糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病最常见的眼部并发症,是工作人群及中老年人视力减退甚至失明的主要原因之一.在糖尿病微血管系统中,视网膜血管功能障碍由多种因素引起,高血糖通过不同的机制损伤视网膜内皮细胞、增加血管通透性、破坏血-视网膜屏障,导致视网膜内皮功能失调.其中,过氧化物酶体增殖物激活受体-y破坏、氧化应激、炎症、晚期糖基化终产物及其受体增加及microRNA失调等多种病理因素均可引起视网膜血管内皮损伤,加速视网膜内皮功能失调,从而导致DR的发生发展.文章旨在对各种病理因素所致视网膜内皮功能失调的相关机制进行综述,以深化我们对该疾病分子及细胞层面机制的理解,了解DR治疗过程中的挑战,为DR的临床管理和治疗提供新思路和策略.

目的:观察益景汤拮抗高糖诱导的体外血-视网膜内屏障(iBRB)模型基底膜(BM)损害及机制.方法:分离、培养大鼠内皮细胞(ECs)和视网膜微血管周细胞(RMPs)构建体外iBRB模型,随机分成低糖组、高糖组、米诺环素组、益景汤组,分别予25 mmol/L葡萄糖、60 mmol/L葡萄糖、60 mmol/L葡萄糖+10 μg/mL米诺环素、60 mmol/L葡萄糖+10％益景汤含药血清干预,各组干预12 h后终止孵育.采用Western blot法检测各组BM相关蛋白[Ⅳ型胶原(collagen Ⅳ,C Ⅳ)、层黏连蛋白(laminin,LN)]及 MMPs/TIMPs 相关蛋白(MMP-2、MMP-3、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2)的表达.结果:与低糖组相比,高糖组、米诺环素组、益景汤组C Ⅳ蛋白表达增加,高糖组、米诺环素组LN蛋白表达增加(均P＜0.05).益景汤及米诺环素能够抑制高糖诱导的C Ⅳ、LN蛋白表达增加,益景汤组、米诺环素组与高糖组相比具有差异(均P＜0.05).与低糖组相比,高糖组、米诺环素组MMP-2、MMP-3、MMP-9 蛋白表达增加(均 P＜0.05).益景汤能够抑制高糖诱导的MMP-2、MMP-3、MMP-9蛋白表达增加,益景汤组与高糖组相比具有差异(均P＜0.05).低糖组、高糖组、米诺环素组、益景汤组各组之间TIMP-1、TIMP-2表达未见明显差异(均P＞0.05).结论:益景汤可能通过调控MMP-2、MMP-3、MMP-9、C Ⅳ、LN的表达,干预高糖介导的BM重塑,抑制iBRB的损害,从而干预DR.

目的:旨在结合转录组测序的结果，聚焦糖尿病视网膜病变中的氧化应激水平和炎症水平，探讨硒结合蛋白1(selenium binding protein 1，SELENBP1)在糖尿病视网膜病变中的作用。方法:对12周龄的db/m和db/db小鼠的视网膜组织进行转录组测序分析筛选差异基因。实验分为两组：db/m小鼠、db/db小鼠，对视网膜组织切片进行活性氧荧光染色，应用蛋白免疫印迹(Western-blot)检测小鼠视网膜组织中的氧化应激反应相关指标还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX)2、NOX4、超氧化物歧化酶2(SOD2)和炎性反应相关指标核因子-κB(NF-κB)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β的变化趋势；用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)、Western-blot和免疫组化(IHC)分析组织中SELENBP1的水平。在体外，应用高糖干预人视网膜微血管内皮细胞(HRMEC)，实验分为两组：正常糖组(NG组)、高糖干预组(HG组)检测活性氧水平及氧化应激和炎性因子的表达；在HRMEC细胞中转染SELENBP1质粒和SELENBP1小干扰RNA，分为正常糖对照组(NG＋Vector)、SELENBP1质粒组(NG＋SBP1)、高糖对照组(HG＋si-NC)、SELENBP1小干扰RNA组(HG＋si-SBP1)，分析活性氧水平及氧化应激和炎性因子的表达水平。结果:与db/m小鼠相比，db/db小鼠视网膜组织中活性氧含量升高、氧化应激相关因子表达增加、抗氧化因子表达下降、炎性因子表达增加，且SELENBP1的mRNA和蛋白水平都明显升高。体外实验表明，高糖干预HRMEC细胞后，细胞中活性氧水平、氧化应激水平和炎症水平明显升高，SELENBP1的mRNA和蛋白表达均明显升高；在HRMEC细胞中过表达SELENBP1后氧化应激水平和炎症水平明显升高；在HRMEC细胞中敲低SELENBP1后氧化应激水平和炎症水平明显下降。结论:SELENBP1通过促进视网膜的氧化应激水平和炎症水平加重了糖尿病视网膜病变，抑制该基因的表达可能会成为减轻糖尿病视网膜病变的有效治疗靶点。

目的:观察富里酸（FA）干预缺氧诱导的人视网膜微血管内皮细胞（hRMEC）基因表达谱的MiSeq测序分析结果。方法:体外培养hRMEC，并将其分为缺氧组（缺氧处理）和FA干预组（即缺氧后FA干预）。采用MTT比色法检测不同浓度和不同作用方式的FA对hRMEC活性的影响。选择FA的最佳作用浓度，通过实时荧光定量PCR （RT-PCR）验证FA对缺氧诱导hRMEC中细胞间黏附分子-1 （ICAM-1）、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、MMP-2、TNF-α、TNF-β等炎症因子及炎症相关因子mRNA表达的影响。收集处于对数生长期的缺氧组和FA干预组细胞，应用MiSeq测序技术对两组细胞进行全转录组测序，获得生物学大数据，在此基础上分析差异表达的miRNA；通过基因注释（GO）功能显著性富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路显著性富集分析对差异miRNA的功能及信号通路进行分析。组间炎症因子及炎症相关因子表达比较时，通过miRNA mimic调节细胞中相应miRNA的表达水平，观察其对细胞功能的影响，从而判断该miRNA的作用。结果:不同浓度和不同作用方式的FA对hRMEC的细胞活性无影响。RT-PCT检测结果显示，缺氧组hRMEC中ICAM-1、IL-1β、IL-6和TNF-β的mRNA表达较正常组明显上调，差异有统计学意义（ t=3.426、6.011、5.282、6.500 ， P=0.027、0.004、0.006、0.003）；FA干预组hRMEC中ICAM-1、IL-6、TNF-α和TNF-β的mRNA表达较缺氧组明显下降，差异有统计学意义（ t=9.961、3.676、3.613、3.387， P=0.001、0.021、0.023、0.028 ）。缺氧组和FA干预组之间共有14个差异表达miRNA，其中上调基因9个，下调基因5个。共4个差异miRNA （hsa-miR-1 285-3p、hsa-miR-30d-3p、hsa-miR-3 170、hsa-miR-7 976）的预测靶基因均为ICAM-1。GO功能显著性富集分析结果显示，差异基因的功能主要富集在细胞发育、细胞分化和单生物发育过程中。KEGG通路显著性富集分析结果显示，差异miRNA表达高度富集的是癌症中蛋白多糖通路和细胞因子-细胞因子受体相互作用通路，差异表达较明显的是花生四烯酸代谢通路和安非他明成瘾性通路。 结论:FA可能通过调控多个miRNA的表达，影响下游ICAM-1 mRNA的表达水平，从而对缺氧刺激hRMEC后细胞的炎性状态产生影响。

目的:观察聚嘧啶束结合蛋白相关剪切子（PSF）高表达对低浓度4-羟基壬烯醛（4-HNE）诱导下人视网膜微血管内皮细胞（HRMECs）的影响，初步探讨其可能存在的机制。方法:将体外培养的对数生长期HRMECs分为4-HNE处理组、PSF高表达联合4-HNE组（PSF+4-HNE组）、PSF高表达+核因子E2相关因子2（Nrf2）抑制剂（ML385）联合4-HNE组（PSF+ML385+4-HNE组）、磷酸肌醇3激酶抑制剂LY294002预处理后4-HNE联合PSF组（LY294002+4-HNE+PSF组）。4-HNE处理组、PSF+4-HNE组、PSF+ML385+4-HNE组细胞培养基加入10 μmmol/L 4-HNE刺激12 h，PSF+4-HNE组、PSF+ML385+4-HNE组应用转染试剂脂质体2000将1.0 μg pcDNA-PSF真核表达质粒导入细胞中转染24 h后，PSF+ ML385+ 4-HNE组加入ML385（5 μmol/L）预处理48 h。LY294002+4-HNE+PSF组，除采用LY294002预处理外，4-HNE浓度、刺激时间以及质粒转染时间同前。Transwell检测PSF对HRMECs迁移能力的影响；Matrigel体外三维成型法检测PSF对HRMECs管腔形成的影响；流式细胞仪检测PSF对HRMECs中活性氧（ROS）水平的影响；蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测PSF、Nrf2、血红素加氧酶-1（HO-1）蛋白相对表达量以及磷酸化丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶（pAkt）蛋白相对表达量。两组间比较采用 t检验。 结果:4-HNE处理组、PSF+4-HNE组细胞数、迁移细胞数、完整管腔形成数分别为（1.70±0.06）、（0.80±0.13）个，（24.00±0.58）、（10.00±0.67）个和（725.00±5.77）、（318.70±12.13）个。两组细胞数、迁移细胞数、完整管腔形成数比较，差异均有统计学意义（ t=12.311、15.643、17.346， P<0.001）。流式细胞仪检测结果显示，4-HNE处理组、PSF+4-HNE组、PSF+ML385+4-HNE组ROS水平分别为816.70±16.67、416.70±15.44、783.30±17.41；组间两两比较，差异均有统计学意义（ t=16.311、14.833、18.442， P<0.001）。Western blot检测结果显示，4-HNE处理组、PSF+4-HNE组、LY294002+4-HNE+PSF组HRMECs中pAkt、Nrf2、HO-1蛋白相对表达量分别为0.08±0.01、0.57±0.04、0.35±0.09，0.17±0.03、1.10±0.06、0.08±0.11，0.80±0.14、2.50±0.07、0.50±0.05。与PSF+4-HNE组比较，LY294002+4-HNE+PSF组pAkt、Nrf2、HO-1蛋白相对表达量显著下降，差异均有统计学意义（ t=17.342、16.813、18.794， P<0.001）。 结论:PSF高表达通过活化磷酸肌醇3激酶/Akt通路上调HO-1的表达，从而抑制低浓度4-HNE诱导的HRMECs增生迁移和管腔形成。

微血管功能障碍是糖尿病视网膜病变（DR）的关键病理机制。近年来研究发现，糖尿病患者普遍存在"代谢记忆"现象，即使其血糖控制良好，也无法避免糖尿病微血管病变。因此，从基因角度来探索DR的发病机制非常必要。miR-126是血管内皮细胞唯一特异性表达的microRNA，与新生血管的形成关系密切，可影响DR微血管的稳定性及内皮细胞的萌芽和迁移，且其基因水平与血管内皮细胞生长因子的表达呈显著负相关。细胞内和循环中的miR-126在DR微血管稳态调节、早期诊疗和病程监测等方面的潜在价值受到了极大的关注，但这一领域的研究报道多以假说为驱动，仍有一定局限性。相信随着基因组学的快速发展，miRNA谱及其在眼发育和眼部疾病中的分子机制将会逐渐清晰，未来可能会在个别难治性视网膜疾病的干预中率先获得突破，建立一种新型的miRNA诊疗手段。

目的:探讨微小RNA-146a(miR-146a)对高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞(HRMECs)凋亡的影响及其可能的分子机制。方法:体外培养HRMECs，采用含5.5 mmol/L D-葡萄糖或25 mmol/L D-葡萄糖的培养液培养48 h，分别记为正常对照组和高糖组。另取正常培养的HRMECs采用脂质体转染法将miR-146a mimics或相应mimics对照转染至HRMECs，并采用含25 mmol/L D-葡萄糖的培养液培养48 h，分别记为高糖+miR-146a拟似物组和高糖+拟似物对照组。应用实时荧光定量PCR检测各组细胞中miR-146a的表达水平；采用噻唑蓝(MTT)法和流式细胞术分别检测各组细胞活力和凋亡率；采用Western blot法检测各组细胞中凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤因子-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)及核转录因子-κB(NF-κB)信号相关蛋白NF-κB p65和p-NF-κB p65的表达水平。结果:正常对照组、高糖组、高糖+拟似物对照组和高糖+miR-146a拟似物组细胞中miR-146a的相对表达水平分别为1.00±0.10、0.22±0.02、0.21±0.02和0.88±0.09，细胞活力分别为(100.00±10.06)%、(68.41±6.67)%、(67.91±6.74)%和(90.46±8.97)%，细胞凋亡率分别为(3.11±1.02)%、(27.28±3.56)%、(27.44±4.03)%和(7.29±2.11)%。高糖组细胞中miR-146a的相对表达水平和细胞活力值明显低于正常对照组，细胞凋亡率明显高于正常对照组；高糖+miR-146a拟似物组细胞中miR-146a的相对表达水平和细胞活力值明显高于高糖组和高糖+拟似物对照组，细胞凋亡率明显低于高糖组和高糖+拟似物对照组，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。高糖组细胞中Bax和p-NF-κB p65蛋白表达水平明显高于正常对照组，Bcl-2蛋白表达水平明显低于正常对照组，差异均有统计学意义(均 P<0.05)；高糖+miR-146a拟似物组细胞中Bax和p-NF-κB p65蛋白相对表达水平明显低于高糖组和高糖+拟似物对照组，Bcl-2蛋白相对表达水平明显高于高糖组和高糖+拟似物对照组，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。各组间细胞NF-κB p65蛋白相对表达水平比较，差异无统计学意义( F＝0.106， P＝0.955)。 结论:过表达miR-146a可抑制高糖所致的HRMECs凋亡，其作用机制可能与抑制NF-κB信号通路的激活有关。

目的:观察骨形成蛋白4 （BMP4）对人视网膜微血管内皮细胞（hRMEC）中糖酵解水平的影响。方法:实验研究。将体外培养的hRMEC分为正常组、4-羟基壬烯醛（HNE）组（4-HNE组）、4-HNE+BMP4处理组（BMP4组）。4-HNE组细胞培养基中加入10 μmmol/L 4-HNE；BMP4组细胞培养基中加入10 μmmol/L 4-HNE刺激6 h后，再加入100 ng/ml重组人BMP4。采用流式细胞仪检测各组细胞内活性氧（ROS）水平；噻唑蓝比色法检测4-HNE对细胞生存力的影响；细胞划痕实验、Transwell小室法测定4-HNE对细胞迁移能力的影响。采用实时定量聚合酶链反应、蛋白免疫印迹法检测正常组、4-HNE组细胞中BMP4、SMAD同源物9 （SMAD9） mRNA、蛋白相对表达量。采用Seahorse XFe96细胞能量代谢分析仪测定正常组、4-HNE组、BMP4组细胞内糖酵解代谢水平。组间比较采用单因素方差分析。结果:正常组、4-HNE组、BMP4组hRMEC内ROS水平分别为21±1、815±5、810±7。与正常组比较，4-HNE组、BMP4组ROS水平显著升高，差异有统计学意义（ F=53.40、50.30， P<0.001）。正常组、4-HNE组细胞生存力分别为1.05±0.05、1.28±0.05；迁移率分别为（0.148±0.005）%、（0.376±0.015）%；穿过小孔的细胞数分别为（109.0± 9.6）、（318.0±6.4）个。与正常组比较，4-HNE组细胞生存力、细胞迁移率、穿过小孔细胞数量明显提高，差异均有统计学意义（ F=54.35、52.84、84.35， P<0.05）。4-HEN组细胞中BMP4、SMAD9 mRNA相对表达量分别为1.680±0.039、1.760±0.011；与正常组比较，差异有统计学意义（ F=53.66、83.54， P<0.05 ）。正常组、4-HEN组细胞中BMP4、SMAD9蛋白相对表达量分别为0.620±0.045、0.860±0.190和0.166±0.049、0.309±0.038；与正常组比较，差异有统计学意义（ F=24.87、53.84， P<0.05 ）。正常组、4-HNE组、BMP4组细胞内糖酵解、糖酵解能力、糖酵解储备水平分别为1.21±0.12、2.84±0.24、1.78±0.36，2.59± 0.11、5.34±0.32、2.78±0.45和2.64±0.13、5.20±0.28、2.66±0.33；与正常组比较，差异均有统计学意义（4-HNE组： F=86.34、69.75、58.45， P<0.001；BMP4组： F=56.87、59.35、58.35， P<0.05）。4-HNE组、BMP4组细胞内糖酵解、糖酵解能力、糖酵解储备水平比较，差异均无统计学意义（ F=48.32、56.33、55.01， P>0.05）。 结论:BMP4通过糖酵解诱导hRMEC的增生和迁移。

目的:观察氧化应激条件下骨形成蛋白4（BMP4）对人视网膜微血管内皮细胞（hRMEC）的增生和迁移影响。方法:将体外培养的hRMEC分为对照组、4-羟基壬烯醛（HNE）处理组（4-HNE组）、4-HNE+BMP4处理组（BMP4组）。4-HNE组细胞培养基加入10 μmmol/L 4-HNE；BMP4组细胞培养基加入10 μmmol/L 4-HNE刺激6 h后，再加入100 ng/ml重组人BMP4。噻唑蓝比色法检测4-HNE、BMP4对hRMEC生存力的影响。细胞划痕实验测定4-HNE、BMP4对细胞迁移能力的影响。实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测对照组、4-HNE组细胞中BMP4 mRNA相对表达量以及对照组、BMP4组细胞中纤维连接蛋白（FN）、层粘连蛋白（Laminin）、α-平滑肌收缩蛋白（α-SMA）、胶原蛋白Ⅰ型（Collagen Ⅰ）、血管内皮生长因子（VEGF）、结缔组织生长因子（CTGF）mRNA相对表达量。蛋白免疫印迹法（Western blot）检测对照组、4-HNE组细胞中BMP4蛋白相对表达量。两组间比较采用 t检验。 结果:与对照组比较，4-HNE组、BMP4组细胞生存力（ t=12.73、16.26， P=0.000 2、<0.000 1）、细胞迁移率（ t=28.17、37.48， P<0.000 1、<0.000 1）均明显提高，差异有统计学意义；4-HNE组细胞中BMP4 mRNA、蛋白相对表达量明显升高，差异有统计学意义（ t=16.36、69.35， P=0.000 1、<0.000 1）。qRT-PCR检测结果显示，与对照组比较，BMP4组细胞中VEGF、FN、Laminin、α-SMA、Collagen Ⅰ、CTGF mRNA相对表达量明显升高，差异有统计学意义（ t=10.61、17.00、14.85、7.78、12.02、10.61， P=0.0004、<0.000 1、0.000 1、0.001 5、0.000 1、0.000 4）。 结论:BMP4可诱导hRMEC的增生和迁移，并可调控hRMEC中血管生成因子和纤维化相关因子表达。

目的:建立糖尿病微血管病变大鼠模型，模拟糖尿病视网膜及肾微血管病变的生化及病理改变。方法:健康雄性Sprague-Dawley大鼠40只，随机分为空白组、模型组，分别为10、30只。空白组、模型组大鼠分别给予普通饲料、高脂高糖饲料喂养5周后，模型组大鼠按体重35 mg/kg剂量经腹腔单次注射1%链脲佐菌素（STZ）建立2型糖尿病模型。建模后持续喂养至第10周（建模后4周），观察大鼠一般情况，采集样本进行后续实验。采集大鼠动脉血、尿样标本检测血肌酸酐（CREA）、三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）及尿微量白蛋白、尿肌酐（UCr）、尿糖；计算肾脏指数、微量尿白蛋白/尿肌酐比值（UACR）。光相干断层扫描血管成像（OCTA）观察大鼠视网膜浅层毛细血管丛血管变化及无灌注区情况；苏木精-伊红、高碘酸-雪夫染色观察大鼠肾脏、视网膜形态结构变化；免疫荧光染色观察大鼠视网膜Müller细胞神经纤维及细胞核表达情况；透射电子显微镜观察视网膜组织超微结果。组间比较采用独立样本 t检验。 结果:建模后4周，与空白组比较，模型组大鼠体重显著降低，随机血糖显著升高，差异有统计学意义（ t=5.755、－51.291， P<0.05）；肾脏指数、尿糖、UACR显著升高，UCr显著降低，差异有统计学意义（ t=10.878、137.273、3.482、－6.110， P<0.05）；CREA降低，TG、TC、HDL-C、LDL-C升高，差异均有统计学意义（ t=－28.012、33.018、118.018、13.585、16.480， P<0.05）。OCTA检查可见视网膜浅层毛细血管无灌注区。光学显微镜观察发现，模型组大鼠视网膜内界膜肿胀、增厚，表面不平，内、外核层细胞排列紊乱，密度降低；肾小球充血伴皮质管状上皮肿胀，肾小球系膜区增宽，基底膜增厚。免疫染色结果显示，模型组大鼠视网膜内、外丛状层呈片状强绿色荧光表达，内、外核层呈散在点状绿色荧光表达。透射电子显微镜发现，模型组大鼠视网膜微血管基底膜轻度增厚，血管内皮细胞水肿，内皮细胞核及周细胞核固缩、核膜皱缩，线粒体轻度肿胀，空泡化。 结论:高糖高脂喂养联合单次腹腔注射STZ 35 mg/kg可成功建立2型糖尿病微血管病变模型。