CRISPR/Cas是原核生物在进化过程中获得的一种免疫防御系统,用于抵抗外来遗传物质的入侵,近年来被开发成为高效的基因编辑、基因调控以及分子诊断工具.其可编程靶向机制揭开了利用该系统进行基因组操作的序幕,并允许在活性范围内实现动态调节和控制基因表达.作为现有基因修饰手段中灵活性最强和成本最低的技术之一,已被广泛应用于临床疾病治疗、工农业生产、可持续染料开发和化学品加工等领域.随着对CRISPR/Cas系统的不断深入挖掘和探索,大量研究报道了 gRNA工程改造及优化方法,包括改变间隔序列长度、调节恒定区和可变区的结构、向末端或中间延伸添加额外功能序列及化学合成修饰等,以期降低脱靶突变率,提高作用效率,充分激发CRISPR基因操纵工具在生物医学方面的潜力.基于此,本综述将介绍CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12系统中gRNA工程化设计方法及应用研究的最新进展,分析探讨了当前工程化gRNA技术面临的机遇和挑战,旨在为获得性能更加优异的gRNA提供思路和方向,从而提高利用CRISPR/Cas系统探测人类细胞基因组的能力,进一步为可编程生物学带来更多可能性.

目的:利用指数富集的配体系统进化技术(SELEX)筛选与大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)特异性结合的核酸适配子(apt)，探讨apt与BMSCs的结合方式及能力。方法:利用SELEX技术，以大鼠BMSCs为靶点，从构建的核酸文库中反复筛选、克隆、测序及分析，获得候选apt。流式细胞术测定和软件分析获得不同浓度(0、4、8、16、32、64、128、256 nmol/L)候选apt与BMSCs的结合曲线及平衡解离常数。胰酶消化实验探究apt与BMSCs结合的靶点，并观察apt体外捕获BMSCs的能力。结果:流式细胞术与荧光共聚焦实验表明SELEX筛选第9轮文库与BMSCs结合能力最高。经序列分析适配子apt7与BMSCs的亲和力最高，平衡解离常数为(11.79±0.72) nmol/L。胰酶消化实验表明当胰酶消化细胞时间超过10 min后，apt7与BMSCs的亲和力下降甚至消失。体外捕获实验表明固定于培养皿上面的apt7能体外捕获骨髓细胞液中的大鼠BMSCs。结论:本研究通过SELEX技术成功分离出能高亲和力、高特异性结合大鼠BMSCs的特异性适配子apt7，为进一步将适配子应用于组织工程支架表面招募循环干细胞研究提供了实验依据。

新乡医学院河南省医用组织再生重点实验室主任郭志坤教授主编的《心脏解剖学》,已于2024年6月由河南科学技术出版社出版发行(图1).《心脏解剖学》共20章,系统介绍了心的发生和发育,心的物种进化和增龄变化,心包,心的位置、毗邻及体表投影,心的形态及内腔结构,心壁的构造及心间隔,心传导系,心的动脉-冠状动脉,心的静脉,心的淋巴管,心的神经,心肌再生,心的发育畸形,心的断层解剖,心的脂肪,心导管介入治疗的解剖学基础,心脏移植的解剖学基础,心脏影像解剖学基础,心常用的解剖学技术等.除大体解剖学外,重点阐述了近年来的心脏研究新进展,如心肌再生、心脏脂肪、瓣膜组织工程等.该书内容涉及多个学科,知识面较宽,综合性较强,理论和实际紧密结合,适用于医学本科生、研究生、解剖学教师、法医学教师、病理学教师、心脏外科医生、心血管内科医生、心脏研究工作者.

熊果酸近年来由于其独特的药理活性以及宝贵的市场价值,逐渐引起人们的广泛关注.目前熊果酸大多从枇杷叶中提取,但植物提取法产率低,成本高,化学合成法又不易获得,因此生物合成法为熊果酸提供了一个新的来源.α-amyrin作为合成熊果酸的主要前体物质,其产量与熊果酸产量呈正相关性.氧化鲨烯环化酶(OSC)属于多基因家族,可以催化常见的前体 2,3-氧化鲨烯生成多种不同类型的三萜骨架,为三萜类物质的合成起决定性作用.但药用植物中催化合成α-amyrin的关键基因报道较少,且其催化产物中α-amyrin产量及占比一直是研究者们关注的重点.该文从鸢尾、苹果、青蒿和长春花中克隆出能够催化 2,3-氧化鲨烯生成α-amyrin的 4 种环化酶ItOSC2、MdOSC1、AaOSC2 和CrAS基因,系统地对 4 种环化酶进行序列比对以及进化树分析,并以质粒形式将其转化至酿酒酵母中进行异源表达.发酵 7 d后测定其催化产物中α-amyrin、β-amyrin以及麦角固醇的产量及占比,筛选出一个催化生成α-amyrin能力最好的AaOSC2,为后期构建高产α-amyrin及熊果酸的工程酵母菌株提供关键基因元件.

在中国的长江中下游曾经同时分布和栖息着2种淡水豚类(白鱼豚Lipotes vexillifer和长江江豚Neophocaena asiaeorientalis),这曾是全世界范围内非常独特的现象.然而,不幸的是,由于过度捕捞与非法渔业、环境污染、密集航运、沿岸工程、围湖造田、水利开发等人为活动的不利影响,白鱼豚在过去几十年里种群急剧衰退,并于2007年被中外科学家宣布为"功能性灭绝"[1].

爆发游泳能力是表征鱼类生存适合度的重要组分.栖息地破碎化对溪流鱼类(尤其是洄游性鱼类)的生存繁衍构成了严重威胁,同时也对鱼类爆发游泳能力提出了更高要求.秦岭细鳞鲑(Brachymystax tsinlingensis)是我国珍稀特有种、国家Ⅱ级重点保护野生动物,常需要进行多次重复爆发游泳运动以穿越激流甚至堤坝阻隔,因此爆发游泳能力及其可持续性对该物种生存至关重要.相较于秦岭细鳞鲑显著的洄游性,其分布区最为常见的同域物种拉氏鱥(Phoxinus lagowskii)则趋于定居性,二者既是研究同域物种适应进化理论的优越动物模型,又是鱼类栖息地保护与修复实践中十分理想的受试目标.为探究秦岭细鳞鲑及其同域物种拉氏鱥爆发游泳能力的种间差异与种内变异,采用自制的仿生态鱼类爆发游泳能力测定装置,分别测定了不同生活史阶段两种实验鱼的绝对爆发游泳速度(Burst swimming speed,Uburst)、相对爆发游泳速度(Relative burst swimming speed,rUburst)及其可持续性.结果表明:(1)两种实验鱼Uburst、rUburst均具有较高的可持续性(ICC系数＞0.75),但秦岭细鳞鲑Uburst和rUburst具有更强的恢复力;(2)总体上秦岭细鳞鲑的Uburet高于拉氏鱥,二者Uburet差异显著、不存在趋同适应;(3)生活史阶段效应对秦岭细鳞鲑和拉氏鱥Uburst、rUburst均影响显著,两物种爆发游泳能力种内变异模式相近,Uburst随发育年龄增加而增加、rUburet随发育年龄增加而减少.研究结果提示,未来鱼类游泳能力关联的鱼道设计或涉水工程评价中,应综合考虑生活史阶段效应和不同物种的生态习性及其种间差异.

[目的]脂肪酸转运蛋白(FAX)可介导植物细胞内脂肪酸从质体向外运输,在植物生长发育及响应非生物胁迫等方面发挥重要作用.研究陆地棉FAX家族基因及功能分析,为明确陆地棉油脂积累的分子机制和油脂代谢工程提供新思路.[方法]从全基因组水平对GhFAX基因家族进行鉴定,并对GhFAX1 蛋白进行亚细胞定位,通过酵母与烟草遗传转化对GhFAX1进行功能验证.[结果]在陆地棉基因组中共鉴定到 12 个GhFAXs基因,家族各成员间具有相似的基因结构及蛋白理化性质.序列比对分析发现,GhFAX蛋白仅有少数氨基酸在进化中高度保守,暗示其对功能的重要性;进化树分析表明,GhFAXs基因与亚洲棉、雷蒙德氏棉的亲缘关系较近.转录组数据表明,GhFAXs可能参与陆地棉响应逆境胁迫的调控过程.通过实时荧光定量PCR发现,GhFAX4 在花中表达较高,说明其参与花粉发育过程;GhFAX9 在茎中表达较高,GhFAX1 在陆地棉各个组织表达量均较高.选择GhFAX1进行亚细胞定位分析,证实GhFAX1定位在质体中.构建GhFAX1载体,使GhFAX1在酿酒酵母中过表达,结果显示,GhFAX1 过表达酵母总脂提高了 3.53%.底物偏好性试验显示,GhFAX1 对C16:0 具有选择性.通过烟草遗传转化,培育GhFAX1过表达烟草.结果显示,过表达烟草叶绿素提升了 13.24%,荧光参数NPQ提高 14.17%,Fm提高 34.94%,F0 降低 35.28%;叶片总脂肪酸提高了 5.2%,种子总脂肪酸提高了 6.52%;种子的千粒重增加了近 19.1%;同时蛋白含量显著下降.[结论]GhFAXs提高了酵母与烟草的含油量,参与质体中棕榈酸的转出,使蛋白合成途径上的碳源流向油脂合成途径.

目的:从中华大蟾蜍(Bufo gargarizans Cantor)肝脏组织中克隆细胞色素P450还原酶基因(BgCPR,GenBank登录号:OQ572435)进行生物信息学分析,并进行功能验证.方法:基于中华大蟾蜍转录组数据库挖掘BgCPR基因序列,使用SnapGene软件设计BgCPR基因两端特异性引物,以蟾蜍肝脏组织总RNA逆转录成的cDNA为模板进行PCR扩增.利用生物信息学分析BgCPR蛋白理化性质、空间结构并构建系统进化树;基于CRISPR/Cas9基因编辑系统将蟾蜍BgCPR基因表达框经同源重组整合进入酿酒酵母基因组,利用聚乙二醇法制备转化子微粒体,验证其对细胞色素C的还原功能.结果:克隆得到全长2 043 bp的BgCPR基因cDNA,编码680个氨基酸,相对分子质量77 852 Da.结构预测显示,BgCPR蛋白为非分泌蛋白;有一段跨膜螺旋区,位于蛋白的第24～46位氨基酸之间;亚细胞定位预测显示该蛋白定位于内质网上.采用体外酶活实验证明其具有传递电子功能.结论:本研究克隆得到中华大蟾蜍BgCPR基因,并构建了表达具有生物活性的BgCPR的酿酒酵母工程细胞,为进一步研究蟾蜍CYP450基因功能乃至解析蟾蜍二烯内酯类化合物的生物合成途径奠定了基础.

氨基酸是蛋白质的基本组成单元,对人和动物的营养健康十分重要,广泛应用于饲料、食品、医药和日化等领域.目前,氨基酸主要通过微生物发酵可再生原料生产,氨基酸产业是我国生物制造的重要支柱产业之一.氨基酸菌株主要通过随机诱变和代谢工程改造结合筛选获得.菌株生产水平进一步提高的核心限制之一是缺乏高效、快速和准确的筛选方法,因此,发展氨基酸菌株的高通量筛选方法对关键功能元件挖掘及高产菌株的创制筛选至关重要.本文综述了氨基酸生物传感器的设计,及其在功能元件、高产菌株的高通量进化筛选和代谢途径动态调控中的应用研究进展,讨论了现有氨基酸生物传感器存在的问题和性能提升改造策略,并展望了开发氨基酸衍生物生物传感器的重要性.

蓝细菌是唯一可进行放氧光合作用的原核微生物,基于光合蓝细菌构建"自养型细胞工厂"具有广阔前景.但以蓝细菌作为底盘进行生物燃料及化学品的合成仍存在细胞耐受能力差、产量低等问题,导致实现工业化生产的经济可行性还比较低,亟需通过合成生物学等技术手段构建新的藻株.近年来,实验室适应性进化(adaptive laboratory evolution,ALE)已被用于底盘工程中,实现了优化生长速度、增加耐受性、加强底物利用和提高产品产量等目标.ALE 在提高蓝细菌鲁棒性方面取得了一定进展,已获得了耐受高光、重金属离子、高盐和高浓度有机溶剂胁迫的进化藻株.但是,蓝细菌中的 ALE 策略效率相对较低,耐受各胁迫的分子机制并未阐释完全.本文综述了ALE 相关技术策略及其在蓝细菌底盘工程中的应用,讨论了如何借鉴其他微生物中 ALE 手段,构建更大 ALE 突变文库、增加菌株的突变频率、缩短进化时间、探索多重胁迫耐受工程菌构建原则及研究策略等,高效解析进化菌株的突变体库,构建高产量、鲁棒性强的工程菌株等,以期未来促进蓝细菌底盘的改造及其工程菌的规模化应用.