目的:收集1例典型结节性硬化症患者的临床资料并检测其致病基因变异。方法:收集患者临床资料，应用二代测序法对患者进行致病基因筛查，采用Sanger测序法验证，构建迷你基因质粒转染至人肾上皮细胞系293T细胞，提取RNA进行转录分析。结果:患者临床表型包括反复癫痫发作，伴面部血管纤维瘤、甲周纤维瘤、肺淋巴管肌瘤病、肾血管平滑肌脂肪瘤及多发性骨质硬化。二代测序提示患者TSC2基因存在可疑致病变异，经Sanger测序验证，患者TSC2基因第4号外显子存在c.336_336+15delGGTAAGGCCCAGGGCG杂合突变，其父母及100名无关健康对照未检测出该位点变异。该突变位点既往未见报道。迷你基因实验显示，患者TSC2基因mRNA序列发生改变，原4号外显子剪切位点丢失，插入74 bp内含子序列，使剪切位置后移90 bp（r.336delins336+16_336+90）。结论:TSC2基因第4号外显子c.336_336+15delGGTAAGGCCCAGGGCG杂合变异可导致异常剪切，可能是该结节性硬化症患者病因。

目的:探讨 ATP7B基因罕见同义变异对其前体mRNA剪接的影响。 方法:从ExAc数据库中筛选出人群等位基因频率<0.005的248种罕见同义变异，用Human Splicing Finder(HSF)软件分析其对于前体mRNA剪接的影响，进一步用ESE Finder 3.0软件预测其对于反式作用因子SR蛋白家族结合能力的影响。筛选出同时影响两种或以上SR蛋白结合的罕见同义变异，用体外迷你基因剪接报告系统进行验证。结果:HSF分析提示有136种罕见同义变异可能破坏外显子剪接增强子(exonic splicing enhancer，ESE)的基序；ESE Finder 3.0分析提示其中19种会同时影响两种或以上SR蛋白的结合。体外迷你基因实验证实其中c.1620C>T(p.L540L)和c.3888C>T(p.A1296A)变异可导致相应外显子的剪接异常，分别造成第4外显子的完全跳跃以及使第18外显子的跳跃增加25%。结论:同义变异可能通过各种途径影响前体mRNA的剪接，其中以破坏ESEs基序最为常见。本研究结果证实c.1620C>T(p.L540L)和c.3888C>T(p.A1296A)变异会对 ATP7B基因的mRNA剪接产生影响，使相应的外显子发生跳跃，从而为携带者的基因诊断和遗传咨询提供了依据。

目的:构建带myc/his标签的pcDNA3.1/TDP-43及其截断体质粒,探讨myc/his-TDP-43融合蛋白对tau外显子10可变剪接的影响.方法:采用PCR法扩增TDP-43基因及其各截断体,将扩增产物和载体pcDNA3.1双酶切后回收,连接载体和目的片段,获得重组质粒.在HEK-293FT细胞中转染pcDNA3.1/TDP-43·myc·his及其截断体质粒,Western印迹法检测相关蛋白的表达.TDP-43或siTDP-43和tau迷你基因SI9/SILO共转,RT-PCR检测TDP-43对tau外显子10可变剪接的影响.结果:成功构建了pcDNA3.1/TDP-43·myc·his全长及各截断体质粒,并在HEK-293FT细胞中检测到其蛋白表达.Myc/his-TDP-43融合蛋白可呈剂量依赖性促进4R-tau的表达(P＜0.05或0.01).结论:Myc/his-TDP-43融合蛋白可促进4R-tau的表达,携带myc/his标签不影响TDP-43对tau外显子10可变剪接的促进作用,为后续研究奠定了基础.

目的 描述结节性硬化症(TSC)伴发双肾巨大血管平滑肌脂肪瘤一家系患者的临床特征并对该家系进行致病基因突变分析. 方法 整理患者临床资料并通过二代测序对该家系TSC1和TSC2基因进行测序分析.通过迷你基因(pSPL3外显子捕获质粒)构建与表达对可疑剪切突变进行验证,最后以患者RNA对其进行体内验证. 结果 患者临床表现典型,以双肾巨大血管平滑肌脂肪瘤为主,同时伴有面部血管纤维瘤、甲周纤维瘤、肺淋巴管肌瘤病、室管膜下钙化结节和视网膜错构瘤等表现.基因分析发现1个新的TSC2基因杂合突变(c.3610G＞A).在蛋白水平上预测该突变为错义突变(p.Gly1204Arg),但在转录水平上,迷你基因及RNA分析均验证该突变为剪切突变. 结论 本研究新发现1个突变位点与TSC有关,该突变同时导致氨基酸替代和异常剪切.

目的:通过生物信息学方法,利用基因表达综合数据库(GEO)分析两种种植体表面(纳米/非纳米级)早期附着细胞的基因表达谱.方法:从GEO数据库下载芯片数据(GSE42288),运用R软件对42枚纳米级(纳米组)和42枚非纳米级表面处理(非纳米组)的迷你种植体周附着细胞的基因谱进行差异表达基因筛选,使用DAVID软件分别对差异基因进行GO及KEGG通路富集分析,同时使用STRING和Cytoscape软件进行蛋白质网络互作分析.结果:筛选出110个差异表达基因(上调7个,下调103个).GO富集分析结果提示,差异基因在免疫反应、炎症反应、趋化因子调节、细胞凋亡通路等生物学过程及白细胞介素(IL)-8受体活化等分子功能中发挥重要作用;KEGG通路分析结果显示,差异表达基因主要在自然杀伤细胞介导的细胞毒作用、破骨细胞分化、抗原加工提呈、趋化因子、细胞因子及其受体相互作用信号通路上发挥作用;GO、KEGG及蛋白互作网络分析筛选出纳米级种植体组主要的下调差异基因为VEGFA、CCL20、IL-8、CXCR1和CXCR2.结论:纳米级种植体更利于早期骨愈合,这可能与VEGFA、CCL20、IL-8、CXCR1和CXCR2基因的下调有关.

目的:研究雌性11β-HSD1敲除小鼠肠道类器官功能改变.方法:分离年龄性别匹配的C57BL/6J小鼠和11β-HSD1敲除小鼠的肠道组织.细胞流式定量分析肠道上皮层干细胞、祖细胞、潘氏细胞分别所占比例.实时定量PCR检测干细胞和潘氏细胞的标志基因表达情况.分离小鼠肠上皮隐窝单位进行体外3D类器官培养,观察类器官增殖率及类器官分化程度.免疫荧光染色研究小肠类器官干细胞及潘氏细胞的定位和定量.结果:11β-HSD1敲除小鼠与野生组相比,其小肠上皮所含潘氏细胞数显著增高,干细胞数目无明显差异,祖细胞数目增多,肠道干细胞标志基因Lgr5在小肠上皮的表达有增高趋势.同时在大肠上皮组织中有类似的结果,11β-HSD1敲除组大肠干细胞、祖细胞数目及Lgr5基因表达均增高.体外研究结果显示,小肠隐窝成类器官比例有增高趋势,11β-HSD1敲除组增殖分化出的类器官对比野生组具有更复杂的结构及更多数目的类隐窝区域,但大肠隐窝类器官培养结果未见显著差异.对小肠类器官的干细胞及潘氏细胞染色发现,11β-HSD1敲除小鼠肠道类器官含有更多的潘氏细胞,干细胞数目亦有增多趋势.结论:11β-HSD1敲除后小鼠肠道细胞组成发生改变,在小肠上皮组织中,潘氏细胞数目显著增多;在大肠上皮组织中,干细胞、祖细胞数目及干细胞标志基因表达量均显著增加.体外研究显示,11β-HSD1敲除组小肠类器官包含更多的潘氏细胞,类器官具有更强的增殖及分化能力.

疼痛作为一种不愉快的主观体验,具有感觉和情绪两个重要维度.以往研究揭示痛感觉的机制,如伤害性刺激在外周神经系统的检测传递,以及在脊髓层面的加工.但是,大脑环路如何编码痛情绪却知之甚少.杏仁核(amygdalar)作为编码情绪的重要脑区,可以被恐惧和疼痛激活.杏仁核包括很多亚区,本研究探讨基底外侧杏仁核(BLA)如何编码不愉快的痛情绪.结果:(1)原位杂交实验发现,针刺(pin prick)左足,可以激活右侧BLA神经元表达c-Fos基因.在右侧前中部的BLA,高达50％的兴奋性Camk2a+神经元表达c-Fos.研究者将AAV2/5-Camk2a-GCaMP6m-WPRE病毒微量注射到右侧前中部的BLA,并给小鼠佩戴一台迷你显微镜(miniature microscope),就可以在清醒自由活动小鼠观察Camk2a+神经元的钙活动.伤害性的针刺、热和冷刺激,分别激活约15％、13％和13％ BLA神经元,并且激活的神经元有重叠.在BLA神经元中,疼痛神经元群(nociceptive ensemble,即针刺、热和冷刺激激活的神经元总和)约占24％.(2)为了探讨BLA疼痛神经元群在生理痛中的作用,研究者联合Cre-loxP和化学遗传学技术,构建noci-TRAPhM4小鼠.给予CNO抑制疼痛神经元群的活动,可以明显降低痛情绪,但不影响痛感觉,也不影响小鼠在高架十字迷宫的焦虑行为.以上研究表明,BLA杏仁核存在特定神经元群,编码生理痛的痛情绪.研究者进一步探讨该群神经元在神经病理性疼痛中的作用.(3)在佩戴迷你显微镜的清醒自由活动小鼠,建立SNI神经病理性疼痛模型,并观察Camk2a+神经元的钙活动.神经损伤前后,伤害性刺激激活的疼痛神经元群相对稳定,其数量(约占25％)和自放放电均无明显变化.

目的:提高对肺黏液表皮样癌(pulmonary mucoepidermoid carcinoma,PMEC)的认识,并探讨PMEC的临床特点及诊治方法.方法:回顾性分析1例晚期高级别PMEC患者的临床资料及诊治过程.通过复习国内外相关文献,总结PMEC的临床特点及诊治经验.结果:PMEC较罕见,临床表现及影像学表现极易与其他类型肺癌相混淆.本例患者经病理结合免疫组织化学检测明确诊断为高级别PMEC;患者同时并发恶性胸腔积液及骨转移,驱动基因为阴性,程序性死亡受体-配体1(programmed death-ligand 1,PD-L1)表达阳性.采用迷你人源性肿瘤移植动物模型(mini-patient-derived xenograft,mini-PDX)技术进行药物筛选后,根据筛选结果行相应的化疗结合免疫治疗,患者获得部分缓解,无进展生存期为18个月,目前己存活24个月.回顾性分析相关研究的文献资料,病理结合免疫组织化学检测是确诊PMEC的有效方法,患者的预后与分期、手术及病理组织学分级有关,早期患者以手术为主,高级别晚期驱动基因阴性患者生存期短,预后差.结论:PMEC是一种罕见的肺部恶性肿瘤,临床表现缺乏特异性;可通过病理结合免疫组织化学检测获得确诊,化疗结合免疫治疗具有一定的疗效.

目的:建立迷你人源性肿瘤移植(miniPDX)动物模型,筛选敏感上皮性卵巢癌(EOC)患者化疗方案并评价效果,为实现EOC个体化药物治疗提供依据.方法:选取首次诊断为EOC并进行肿瘤细胞减灭术的患者22例作为药敏组,22例患者均同意进行miniPDX试验并签署相关同意书;另选取同期治疗并基本情况匹配的41例EOC患者作为对照组.药敏组采用患者肿瘤组织制成细胞悬液装入胶囊,并植入裸鼠皮下建立miniPDX模型.采用不同化疗药物治疗裸鼠后取出胶囊,CellTiter-Glo荧光细胞活力测定法测定胶囊中肿瘤细胞增殖率,选用细胞增殖率最低的方案对患者进行化疗.对照组采用紫杉醇+卡铂或紫杉醇+顺铂化疗方案.评价2组患者的疗效和不良反应发生率.将2组患者肿瘤组织病理切片进行CK7、WT-1、p16、p53、Ki-67和配对盒基因8抗原(PAX-8)免疫组织化学染色,分析其阳性结果与患者对含铂化疗敏感性之间的关系.结果:药敏组22例患者中,14例完全缓解(CR),4例部分缓解(PR),总缓解率(ORR)为81.8％(18/22);对照组41例患者中,13例CR,14例PR,ORR为65.9％(27/41),药敏组患者ORR高于对照组(P<0.05).2组患者的年龄、病理类型和分期等临床特征比较差异无统计学意义(P>0.05).药敏组和对照组患者不良反应发生率比较差异无统计学意义(P>0.05).免疫组织化学检测,p16、p53、Ki-67和PAX-8阳性铂敏感患者百分率高于p16、p53、Ki-67和PAX-8阴性铂敏感患者(P<0.05),CK7和WT-1阳性铂敏感患者百分率与CK7和WT-1阴性者铂敏感患者比较差异无统计学意义(P>0.05).结论:根据miniPDX动物模型筛选EOC化疗方案可提高EOC患者治疗效果;p16、p53、Ki-67和PAX-8阳性表达可预测EOC患者的铂敏感.

目的:研究巨噬细胞单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)通路对小鼠高血压及心脏结构功能的影响.方法:使用AMPKα1-loxP转基因小鼠杂交集落刺激因子受体的启动子驱动表达雌激素受体-Cre融合蛋白的转基因小鼠,构建他莫昔芬诱导特异性敲除巨噬细胞AMPK的转基因小鼠(Csf1r-Mer-iCre-Mer:PRKAA1fl/fl),取12只Cre阴性小鼠(WT)和10只Cre阳性小鼠(KO),腹腔注射他莫昔芬(20 mg/mL)连续5d,袖套式血压探头测鼠尾血压,分为四组,WT对照组6只,KO对照组5只,行假手术;WT高血压组6只,KO高血压组5只,皮下埋植血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)渗透性迷你泵刺激7d诱导高血压,检测血压和超声心动指标后麻醉处死,心脏组织做石蜡切片和α-SMA免疫组化染色观察纤维化情况.结果:AngⅡ刺激7dWT鼠和KO鼠的收缩压显著升高[WT对照 vs.WT高血压组,SBP(120.7±1.7) vs.(164.2±6.9)mmHg(1 mmHg=0.133 kPa),P=0.0001;KO对照vs.KO高血压组:SBP(104.6±6.3)伽.(143.9±2.9) mmHg,P=0.0005];LVEDD显著降低;左心室舒张末期后壁厚度、LVEF、心脏质量/体重比值和纤维化程度显著提高;α-SMA免疫组化染色差异不明显.结论:巨噬细胞特异性敲除AMPK可降低早期高血压状态下的血压水平,但对心脏功能和纤维化程度的影响不明显.