减数分裂特异性调控分子Moa1定位到着丝粒受到动粒蛋白CENP-C的调控,同时Moa1参与黏连蛋白Rec8介导的着丝粒区域姐妹染色单体的黏连.为了研究这些蛋白质之间的相互作用,本研究利用酵母双杂交实验(yeast two-hybrid assay)测定分析了 Moa1和CENP-C、Rec 8之间的相互作用,并通过在Moa1中定点突变鉴定了与CENP-C和Rec8相互作用所需的一些氨基酸残基.实验结果表明,Moa1和CENP-C的相互作用对于Moa1参与调节姐妹动粒的单极附着很重要.然而,双杂交实验中与Rec8相互作用所需的Moa1的S143和T150突变没有显示出Moa1或Rec8功能的显著缺陷.这表明氨基酸残基的突变可能不足以干扰体内Moa1和Rec8之间的相互作用,需要进一步的研究来确定Moa1和Rec8的相互作用域.本研究揭示了影响减数分裂同源染色体分离的Moa1氨基酸位点,为减数分裂的染色体分离机制提供更深入的理解.

[目的]WRKY转录因子参与植物对低磷胁迫反应的调控.基于前期苦荞在低磷胁迫下的转录组数据,克隆FtWRKY28基因,预测基因及其编码蛋白的序列结构特征,分析基因在各器官中以及在低磷和激素处理下的表达模式、蛋白的亚细胞定位与转录激活活性,为阐明基因的生物学功能奠定基础.[方法]基于苦荞基因组数据库注释设计特异引物,用逆转录PCR从低磷处理的苦荞根RNA样中克隆FtWRKY28的完整编码序列,用生物信息学方法分析基因与蛋白的结构以及同源蛋白的进化关系,用实时荧光定量分析基因的表达模式,用拟南芥原生质体瞬时表达体系分析蛋白的亚细胞定位,用酵母单杂交分析蛋白的转录激活活性.[结果]FtWRKY28的完整编码序列长876 bp,编码1个含291个氨基酸、有1个WRKY结构域、锌指结构域为C2 H2型的蛋白,归属WRKY家族Ⅱ组.FtWRKY28绝大部分定位于细胞核,具有转录激活活性.FtWRKY28在根中表达水平最高,受低磷、吲哚乙酸、赤霉素3和6-苄氨基嘌呤显著诱导.[结论]FtWRKY28具有转录因子的基本结构与生物化学特征,可能通过生长素、赤霉素、细胞分裂素信号网络的交互作用,调控苦荞在低磷胁迫下的响应过程.

叶绿素是水稻光合作用的重要色素,叶绿素的合成决定光合作用的效率,影响植物的产量和品质.在本研究中,发现糖原合成酶激酶OsGSK2过表达植株Go-2成熟期呈现叶片深绿色的表型.相比野生型,Go-2植株叶绿素a、叶绿素b以及类胡萝卜素含量显著升高.透射电镜观察结果显示,相比野生型,Go-2植株叶绿体类囊体片层增多.酵母双杂交"一对一"实验证实OsGSK2与Golden2-Like转录因子OsGLK1存在互作,并进一步通过双分子荧光互补实验确认OsGSK2与OsGLK1存在互作.在水稻原生质体中检测双荧光素酶活性发现,相比单转OsGLK1,OsGSK2与OsGLK 1共转显著提高下游靶基因的表达水平.荧光定量PCR结果表明,相比野生型,在Go-2植株中OsGLK1直接调控的靶基因OsPORB、OsCAO1、LHCB6等转录水平显著上调.研究结果初步揭示了OsGSK2与OsGLK1互作调控水稻叶绿素合成和叶绿体发育的分子机理,进一步拓展了水稻糖原合成酶激酶的分子功能,丰富了水稻叶色调控的分子网络,为水稻高光合分子育种提供了理论依据.

次生乳管是天然橡胶合成和贮存的场所,是由橡胶树树干树皮中维管形成层细胞分裂分化而来.次生乳管的数量与天然橡胶产量直接相关,而这些乳管的数量取决于形成层分化次生乳管的频率(乳管分化能力),是橡胶树产量育种的主要指标.前期研究中,我们发现组蛋白去乙酰化酶(HDA)抑制剂曲古抑菌素A(TSA)能诱导橡胶树乳管分化且组蛋白去乙酰化酶基因(HbHDA6)能够参与橡胶树乳管分化调控.由于组蛋白乙酰化修饰调控橡胶树次生乳管分化的分子机制尚未阐明,因此该文使用冠菌素(COR)诱导橡胶树形成层分化产生次生乳管的实验系统,以分离形成层组织为材料,构建酵母双杂交 cDNA 文库,以HbHDA6 基因为诱饵来筛选酵母双杂交文库,确定与 HbHDA6 相互作用的蛋白.结果表明:(1)利用Gateway技术构建的均一化COR诱导橡胶树形成层组织的酵母双杂交cDNA文库,初级文库的容量为 6.34×106 CFU·mL-1,总单克隆数为1.27×107,文库重组率为100%;次级文库的容量为7.72×106 CFU·mL-1,总单克隆数为 1.54×107,文库重组率为 100%.初级文库和次级文库的插入片段平均长度分别为 1.1 kb和 1.2 kb.(2)成功构建了筛选 HbHDA6 互作蛋白的pGBKT7-HbHDA6 诱饵载体,并确认无自激活活性.(3)使用该诱饵载体对构建的酵母双杂交cDNA文库进行筛选,并通过NCBI_BLAST比对和去除重复以后,获得了 22 个与HbHDA6 发生互作的蛋白,包括CLP1、ERF3、ERF4、HSP82、LARP6a、APT5、PP2A、FBA6 等.该研究成果为解析组蛋白乙酰化修饰调控橡胶树次生乳管分化的分子机制提供了理论基础,为转基因改良橡胶树的产胶潜力提供了候选基因,为高性能天然橡胶遗传改良育种提供了新线索.

盐碱土壤环境是限制猴樟引种推广的主要因素,脯氨酸是植物适应盐碱胁迫过程中主要的渗透调节物质,筛选并鉴定出调控脯氨酸合成的转录因子对于猴樟耐盐碱分子机理研究具有重要意义.以猴樟实生苗为材料,在水培培养基础上,采用0 mmol/L和 10 mmol/L的Na2CO3 溶液分别进行处理,选取处理 6 h、48 h的根系组织,提取总RNA,构建盐碱胁迫诱导的猴樟根系酵母cDNA文库;以猴樟根系总DNA为模板,克隆CbP5CS启动子序列,采用Y1H酵母单杂交技术筛选出与CbP5CS启动子存在互作的蛋白,并通过高通量测序技术鉴定出调控猴樟脯氨酸合成的转录因子.结果表明,所构建的cDNA文库库容为 4.88×107 CFU/mL,总克隆数为 9.76×107 CFU,文库插入片段平均长度在 1 000 bp左右,cDNA片段重组率为 100%,符合酵母杂交试验的要求.克隆出的CbP5CS启动子序列长 2 012 bp,成功构建出诱饵质粒pHIS2-CbP5CS,利用共转化方法从文库中筛选到 31 个与CbP5CS互作的EST序列.经酵母回转验证,31个EST序列均与CbP5CS存在互作.经NGS测序和BLAST比对搜索,获得6个转录因子基因,分别为锌指CCCH结构域蛋白 25 异构体 x1、AtbHLH104、转录因子 TFIIIC、RING/FYVE/PHD锌指超家族蛋白、GATA型锌指转录因子家族蛋白、AtbHLH96.以上结果为进一步研究植物脯氨酸代谢响应盐碱胁迫的分子机制奠定基础.

羟基肉桂酰辅酶A奎尼酸羟基肉桂酰转移酶(hydroxycinnamoyl CoA quinate hydroxycinnamoyl transferase,HQT)是绿原酸生物合成的最后一步限速酶.IbHQT1 是甘薯绿原酸生物合成的关键HQT基因,为进一步揭示HbHQT1 在甘薯绿原酸生物合成中的作用和转录调控机制,克隆其启动子,构建甘薯叶酵母单杂交cDNA文库,通过酵母单杂交方法筛选与IbHQT1 启动子结合的上游调控因子.结果表明,1 500 bp的IbHQT1 启动子序列中含有多种激素调节与防御相关的顺式元件及转录因子结合元件.构建的cDNA文库库容为 1.15×107 CFU,插入片段长度平均约1 200 bp.通过酵母单杂交筛选获得2 个转录因子IbMYB11 和IbTGA2.2,可以与IbHQT1 启动子结合.IbMYB11、IbTGA2.2 和IbHQT1 在甘薯(QS80-12-11)不同组织和发育阶段表达类似,与绿原酸的积累存在明显的相关性.

目的:进行芹菜根降血脂作用有效部位的筛选,阐明其作用机制.方法:将芹菜根提取物及分离单体加入含有AH109菌株(携带大鼠apo-A Ⅰ与SR-B Ⅰ)的培养基中,通过报告基因α,β-半乳糖苷酶活力的测定来定量检测apo-A Ⅰ与SR-B Ⅰ之间互相作用力的强弱,从而反应被测药物的降脂活力大小.结果:正丁醇组分中分离出的单体能够增强两种蛋白的相互作用.结论:芹菜根中正丁醇组分中分离出的这一单体是降血脂的目标化合物.

目的 构建C2株蓝氏贾第鞭毛虫cDNA文库.方法 Trizol对C2株贾第虫滋养体RNA进行提取,逆转录获得cDNA单链,LD-PCR扩增获得ds cDNA,经纯化后,与pGADT7-Rec共转化酵母株Y187中.通过营养缺陷型平板SD/-Leu培养获得转化子即包含蓝氏贾第鞭毛虫cDNA文库,并对文库的库容及DNA重组率进行鉴定.结果 以RNA为模板,经逆转录、LD-PCR、纯化等,得到了较为理想的双链cDNA.将ds cDNA和pGADT7-Rec转化到酵母菌株,经分离培养,最终得到转化成功的酵母转化子,建立了贾第虫的cDNA文库,文库容量为2.715×107/mL,重组率76.7%,插入片段的大小主要集中在300~1000.结论 成功的构建了较为理想的C2株贾第虫cDNA文库.

甘精胰岛素是一种通过基因工程重组技术,利用大肠杆菌或酵母表达得到的一种重组蛋白类药物,是具有长效作用的人胰岛素类似物.该药物在皮下注射后立即聚合,溶解度降低,形成微沉淀物,使吸收、分解和作用时间延长,相当于基础胰岛素的无峰值分泌,发挥长效平稳降血糖的作用[1].宿主细胞残留DNA因有潜在的致癌或传染风险,是基因工程重组产品需要严格控制的杂质.《中国药典》2015年版收载了2种外源性DNA残留检测方法:DNA探针杂交法和荧光染色法.DNA探针杂交法操作周期较长,干扰因素多,重复性较差,宿主菌DNA的种属和质量直接影响检测结果的准确性[2].荧光染色法是利用双链DNA荧光染料与双链DNA特异结合形成复合物,在波长480 nm激发下产生超强荧光信号,用荧光酶标仪在波长520nm处进行检测,在一定的DNA浓度范围内以及荧光染料过量的情况下,荧光信号与DNA浓度成正比[3-4].荧光染色法操作简单快速,不需要宿主DNA作为模板,能够检测出重组制品中全部DNA污染,因而可广泛用于重组蛋白药物残余DNA的检测.

为了提高黄曲霉毒素 B1(aflatoxin B1,AFB1)单链抗体(single chain Fv fragment, scFv)的表达量和生物活性,将从杂交瘤细胞株2C10中反转录后经基因拼接技术获得的scFv片段基因分别构建到E.coli表达载体pET-30a中和酵母表达载体pPICZαA中进行比较.重组质粒pET-30a-pelB-scFv构建好后转化到BL21(DE3)中进行IPTG诱导蛋白表达,重组质粒pPICZαA-scFv构建完成经线性化后,经电转化法转化至毕赤酵母GS115中,甲醇诱导蛋白表达.表达蛋白经镍离子亲和层析法进行纯化,后检测其生物学活性.结果显示抗AFB1scFv获得了高效表达,在大肠表达系统和酵母表达系统中表达量分别是34 mg/L 和132 mg/L,目的蛋白大小为29 ku左右.纯化后的蛋白经SDS-PAGE,Western blot和ELISA对其进行性质分析,得知抗 AFB1 scFv蛋白具有很好的生物学活性,且灵敏度分别为40 μg/mL 和35 μg/mL.酵母表达系统与E.coli BL21(DE3) 表达系统相比,虽然scFv灵敏度转好,但仍有较大提升空间.