目的:通过酵母双杂交实验筛选与环指蛋白216(ring finger protein 216, RNF216)相互作用的蛋白，进一步阐明RNF216在GnRH缺陷疾病中的作用。方法:构建pGBKT7- RNF216重组表达载体，将其转化到Y2HGold酵母中，与人cDNA文库进行杂交，筛选与RNF216相互作用的蛋白，然后在Y2HGold酵母中进行验证。 结果:成功构建了pGBKT7- RNF216重组表达载体，并在Y2HGold酵母中成功表达；通过酵母双杂交实验，筛选到了一个与RNF216相互作用的蛋白——丝状蛋白B(filamin B, FLNB)，并在Y2HGold酵母中验证了它们之间的相互作用。 结论:成功筛选到一个与RNF216相互作用的FLNB蛋白，RNF216可能通过调节FLNB或FLNB/FLNA异源二聚体影响GnRH神经元的增殖和迁移。

目的:鉴定SseK3蛋白宿主中新的生物学底物以及对其功能的影响。方法:通过酵母双杂交系统(yeast-two-hybrid，Y2H)从HeLa cDNA文库中筛选SseK3潜在结合蛋白；通过细胞共表达和体外活性试验检测SseK3对底物蛋白的精氨酸N-乙酰葡萄糖胺化(Arg-GlcNAc)修饰；通过点突变检测SseK3对底物蛋白的修饰位点；通过免疫共沉淀试验检测底物蛋白的Arg-GlcNAc修饰对其互作蛋白结合能力的影响。结果:酵母双杂交和基因测序结果表明，SseK3的一个全新底物是Snapin；SseK3在细胞内和体外均可以Arg-GlcNAc修饰Snapin；修饰位点位于Snapin蛋白C端的119和120位精氨酸；Arg-GlcNAc修饰Snapin抑制了Snapin-SNAP25的结合。结论:本研究成功筛选到SseK3的一个新的宿主底物蛋白Snapin，初步研究了SseK3对Snapin的Arg-GlcNAc修饰及该修饰对Snapin功能的影响，为后续进一步理解细菌的Arg-GlcNAc修饰功能以及在病原微生物感染过程中的作用机制提供理论依据。

[目的]筛选玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)转录因子的互作蛋白,解析黑色素调控转录因子StMR1 调控玉米大斑病菌致病性的分子机制.为解析玉米大斑病菌侵染过程中转录因子的调控网络,阐明病菌的致病机理提供参考.[方法]收集玉米大斑病菌菌丝和孢子不同萌发阶段作为试验材料,采用Gateway方法构建玉米大斑病菌cDNA文库,使用同源重组的方法构建转录因子StMR1 的诱饵载体,采用酵母双杂交技术筛选其互作蛋白并进行一对一验证.[结果]构建的玉米大斑病菌文库插入的平均片段长度大于 1 000 bp,初级文库及次级文库的库容量为 1.2×107 和 1.04×107 CFU,重组率为 100%,可以用于酵母双杂交筛选.成功构建可以用于筛库的诱饵载体pGBKT7-StMR1,经初筛与复筛得到 3 个互作蛋白,一对一验证短链脱氢酶、糖基转移酶、富含亮氨酸重复序列蛋白均与转录因子StMR1 存在互作.[结论]成功构建了丰富度高且质量好的玉米大斑病菌cDNA文库并筛选到了与转录因子StMR1 互作的蛋白.

次生乳管是天然橡胶合成和贮存的场所,是由橡胶树树干树皮中维管形成层细胞分裂分化而来.次生乳管的数量与天然橡胶产量直接相关,而这些乳管的数量取决于形成层分化次生乳管的频率(乳管分化能力),是橡胶树产量育种的主要指标.前期研究中,我们发现组蛋白去乙酰化酶(HDA)抑制剂曲古抑菌素A(TSA)能诱导橡胶树乳管分化且组蛋白去乙酰化酶基因(HbHDA6)能够参与橡胶树乳管分化调控.由于组蛋白乙酰化修饰调控橡胶树次生乳管分化的分子机制尚未阐明,因此该文使用冠菌素(COR)诱导橡胶树形成层分化产生次生乳管的实验系统,以分离形成层组织为材料,构建酵母双杂交 cDNA 文库,以HbHDA6 基因为诱饵来筛选酵母双杂交文库,确定与 HbHDA6 相互作用的蛋白.结果表明:(1)利用Gateway技术构建的均一化COR诱导橡胶树形成层组织的酵母双杂交cDNA文库,初级文库的容量为 6.34×106 CFU·mL-1,总单克隆数为1.27×107,文库重组率为100%;次级文库的容量为7.72×106 CFU·mL-1,总单克隆数为 1.54×107,文库重组率为 100%.初级文库和次级文库的插入片段平均长度分别为 1.1 kb和 1.2 kb.(2)成功构建了筛选 HbHDA6 互作蛋白的pGBKT7-HbHDA6 诱饵载体,并确认无自激活活性.(3)使用该诱饵载体对构建的酵母双杂交cDNA文库进行筛选,并通过NCBI_BLAST比对和去除重复以后,获得了 22 个与HbHDA6 发生互作的蛋白,包括CLP1、ERF3、ERF4、HSP82、LARP6a、APT5、PP2A、FBA6 等.该研究成果为解析组蛋白乙酰化修饰调控橡胶树次生乳管分化的分子机制提供了理论基础,为转基因改良橡胶树的产胶潜力提供了候选基因,为高性能天然橡胶遗传改良育种提供了新线索.

[目的]通过构建白菜种子的cDNA文库,筛选WDR 40 蛋白TRANSPARENT TESTA GLABRA 1(TTG1)的互作蛋白,探究TTG1 参与MBW三元复合体调控种皮原花青素形成的分子机制.[方法]以棕籽白菜自交系'B147'的种子为材料,提取总RNA并建立cDNA文库,通过gateway技术构建诱饵载体pGBKT7-TTG1 并进行酵母双杂交筛库.[结果]酵母文库库容为1.2×107 CFU,文库滴度是 5.0×107 CFU/mL,插入片段平均长度大于 1000 bp,诱饵载体在酵母中无自激活活性.通过构建的诱饵载体pGBKT7-TTG1 与构建的cDNA文库杂交,共获得了 38 个阳性互作蛋白,功能预测显示其中一个蛋白注释为MYB转录因子,注释为MYB73,序列分析结果显示该基因含有R2R3-MYB型抑制子保守基序C1 和C2,推测该基因为白菜中参与种皮颜色形成的R2R3-MYB型抑制子,暗示着白菜中可能存在不同MYB转录因子参与的调控网络,影响着原花青素的形成.[结论]本研究构建了白菜种子组织的酵母双杂交cDNA文库,获得了 38 个TTG1 阳性互作蛋白,首次挖掘到了可能影响白菜种皮颜色原花青素形成的R2R3-MYB型抑制子MYB73,为后期探究白菜种皮原花青素的调控网络奠定良好的基础.

[目的]MYB家族成员在植物生长发育、生物胁迫和非生物胁迫等方面发挥重要调控作用,然而,小麦MYB转录因子在重金属镉(Cd)胁迫中的生物学功能研究较少.挖掘小麦Cd胁迫应答相关基因,阐明其在Cd胁迫中的生物学功能,为耐/低Cd小麦品种的选育奠定基础.[方法]构建Cd胁迫小麦根系酵母cDNA文库,筛选获得Cd胁迫应答基因,利用荧光定量PCR技术检测Cd胁迫条件下小麦不同组织中Cd胁迫应答基因的相对表达量;利用病毒诱导的基因沉默对该基因进行功能验证,检测对照和沉默植株的Cd含量、叶绿素含量、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活力等生理生化指标.此外,对Cd胁迫应答基因及其在小麦和其他物种中的同源基因进行生物信息学分析(系统进化关系、序列特征和表达谱).[结果]Cd胁迫主要抑制小麦根系发育,在添加 0.002 mol/L Cd的酵母培养基上筛选Cd胁迫小麦根系酵母cDNA文库获得 18 个耐Cd转化子,其中 5 个转化子编码TaMYB1 蛋白,转化TaMYB1酵母菌株在高Cd培养基中生长良好,而对照则明显受到抑制.RT-qPCR结果表明,TaMYB1在小麦幼苗中响应Cd胁迫.与对照相比,TaMYB1沉默植株中TaMYB1表达量明显下降,且根系和叶片Cd含量显著低于对照植株,叶绿素含量、SOD、POD活性高于对照植株,MDA含量则低于对照植株.同时,生物信息学分析发现,TaMYB1 属于 1R-MYB家族成员,具有高度保守的MYB和CC结构域,其包含 7 个外显子和 6 个内含子,在拔节期中期的花序和成熟期的花序表达最高,在灌浆前期种子和灌浆中后期种子中表达量最低.[结论]TaMYB1 在小麦响应Cd胁迫应答中发挥重要作用.

盐碱土壤环境是限制猴樟引种推广的主要因素,脯氨酸是植物适应盐碱胁迫过程中主要的渗透调节物质,筛选并鉴定出调控脯氨酸合成的转录因子对于猴樟耐盐碱分子机理研究具有重要意义.以猴樟实生苗为材料,在水培培养基础上,采用0 mmol/L和 10 mmol/L的Na2CO3 溶液分别进行处理,选取处理 6 h、48 h的根系组织,提取总RNA,构建盐碱胁迫诱导的猴樟根系酵母cDNA文库;以猴樟根系总DNA为模板,克隆CbP5CS启动子序列,采用Y1H酵母单杂交技术筛选出与CbP5CS启动子存在互作的蛋白,并通过高通量测序技术鉴定出调控猴樟脯氨酸合成的转录因子.结果表明,所构建的cDNA文库库容为 4.88×107 CFU/mL,总克隆数为 9.76×107 CFU,文库插入片段平均长度在 1 000 bp左右,cDNA片段重组率为 100%,符合酵母杂交试验的要求.克隆出的CbP5CS启动子序列长 2 012 bp,成功构建出诱饵质粒pHIS2-CbP5CS,利用共转化方法从文库中筛选到 31 个与CbP5CS互作的EST序列.经酵母回转验证,31个EST序列均与CbP5CS存在互作.经NGS测序和BLAST比对搜索,获得6个转录因子基因,分别为锌指CCCH结构域蛋白 25 异构体 x1、AtbHLH104、转录因子 TFIIIC、RING/FYVE/PHD锌指超家族蛋白、GATA型锌指转录因子家族蛋白、AtbHLH96.以上结果为进一步研究植物脯氨酸代谢响应盐碱胁迫的分子机制奠定基础.

LAZY1 通过促进生长素的横向极性运输来调控水稻分蘖角,形成紧密直立的株型,从而提高水稻产量.为了研究LAZY1 表达的分子调控机制,本研究利用酵母单杂筛库技术筛选水稻LAZY1 的上游调控因子.首先以水稻粳稻品种日本晴基因组DNA为材料,经PCR扩增得到LAZY1 的启动子序列,接着连接到pHIS2 构建诱饵载体,并转化到AH109 酵母菌株得到pHIS2-LAZY1 诱饵菌.同时以萌发 3 d的日本晴幼苗为材料,采用SMART技术构建cDNA文库,再将纯化的cDNA文库和pGADT7-Rec共转化酵母菌株Y187 获得酵母单杂文库菌,接着将上述诱饵菌和文库菌进行接合完成酵母单杂筛库,共筛选得到 21 个候选的上游调控因子,进一步对其中的转录因子多蛋白桥梁因子OsMBF1 进行双荧光素酶实验验证,结果显示OsMBF1 可在体内促进LAZY1 的转录.本研究得到LAZY1 的上游正调控因子OsMBF1,为揭示LAZY1 介导的生长素极性运输和分蘖角决定的调控网络提供了理论基础,将有助于揭示水稻由散生变为直立生长的奥秘,具有重要的理论和实践意义.

为筛选小麦叶锈菌效应蛋白的互作靶标蛋白,解析效应蛋白干扰寄主的防御反应机制.本试验以小麦叶锈菌菌株13-5-28-1(JHKT)与感病品种Thatcher在 0-12 d互作的供试样本为材料,利用SMART方法构建三框均一化的、用于筛选与小麦叶锈菌互作的小麦cDNA文库,采用同源重组的方法构建效应因子Pt34084 重组诱饵载体pGBKT7-Pt34084,并以其为诱饵蛋白,利用共转化方法筛选互作的靶标蛋白.结果表明,构建的小麦叶锈菌与小麦互作的cDNA文库库容约 1.05×107 CFU/mL,滴度为1.2×109 CFU/mL,平均插入片段大于 1 kb,重组阳性率为 100%,符合cDNA建库要求.构建的诱饵重组载体pGBKT7-Pt34084 在SD/-Trp-His-Ade培养基中添加 20 mmol/L 3-AT及 400 ng/mL ABA可抑制其自激活性.利用该文库共筛选获得 16 个来自小麦及叶锈菌的不同候选互作蛋白,这些蛋白涉及植物代谢、激素信号转导、抗病反应等多个方面.预示Pt34084 可通过多种渠道干扰寄主的防御反应,促进叶锈菌侵染.研究结果有助于解析小麦叶锈菌致病机理,为创造新的有效防控小麦叶锈菌策略奠定基础.

水稻是重要的粮食作物,研究水稻生长发育调控机制可为水稻品种改良奠定理论基础.钙依赖蛋白激酶(calcium dependent protein kinases,CDPKs)是植物中重要的蛋白激酶,参与植物生长发育以及对环境反应的应答.水稻中的CRK5(CDPK-related kinase 5)在蛋白序列和结构上与CDPK高度同源.为进一步研究OsCRK5 在水稻干旱反应中的功能,本研究利用酵母双杂交筛库技术筛选了OsCRK5 的互作蛋白.首先将OsCRK5 的 1-1 332 bp片段克隆至pGBKT7 载体中,获得诱饵载体pGBKT7-OsCRK5,经测序无误后,转化至酵母菌株Y2H Gold中.在营养缺陷培养基中观察到重组蛋白不具有毒性作用及自激活活性,同时利用Western blot分析重组蛋白的表达.进一步利用水稻cDNA文库筛选OsCRK5 的互作蛋白,共得到 77 个阳性克隆.功能预测结果显示,互作蛋白涉及蛋白质合成、贮存和降解过程、转录调控、植物细胞生长和分裂过程、能量代谢和细胞代谢等方面的功能.最后,从阳性克隆中选取参与植物干旱胁迫应答的两个蛋白OsWR1 和OsDi19-1,利用酵母双杂交和双分子荧光互补的方法验证其与OsCRK5 的相互作用.研究结果为水稻抗旱的遗传改良奠定了基础.