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双打击多发性骨髓瘤的临床特点及治疗反应分析
编辑人员丨1周前
目的:分析初诊双打击多发性骨髓瘤(MM)的临床特点及治疗反应。方法:应用原位荧光杂交技术(FISH)检测西南医科大学附属医院2015年1月至2019年6月初诊MM患者146例1q21扩增及17p缺失情况,收集患者临床资料,国际分期系统(ISS)分期Ⅲ期合并1q21扩增和/或17p缺失定义为双打击MM组,共42例,非双打击MM组104例。对患者的临床指标进行相关性分析。结果:双打击组β 2-微球蛋白、乳酸脱氢酶、肌酐、血钙、骨髓浆细胞比例、国际骨髓瘤工作组分组高危型者比例均较非双打击组高,两组差异均有统计学意义( Z=-6.636、-3.789、-5.116, t=2.288, Z=-5.091,χ 2=32.489,均 P<0.05);双打击组患者的血红蛋白为(75.14±20.65)g/L,低于非双打击组的(88.21±26.31)g/L( t=-3.187, P=0.002)。146例患者的4年生存率为42.7%,非双打击患者的4年生存率为51.4%,双打击组患者的4年生存率为13.6%,两组差异有统计学意义( Z=4.000, P<0.001)。42例双打击患者中,19例患者采用传统方案治疗,4年生存率为12.3%,23例患者采用含硼替佐米方案治疗,4年生存率为25.4%,两种治疗方法的生存率差异无统计学意义( P>0.05)。 结论:与非双打击相比,双打击MM患者的临床表现更严重,4年生存率更低,硼替佐米可能无法改善双打击MM患者的预后。
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编辑人员丨1周前
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Miller-Dieker综合征胎儿1例的产前遗传学分析
编辑人员丨1周前
目的:探讨1例超声提示双侧侧脑室增宽胎儿的遗传学病因。方法:采集胎儿的脐带血样及其父母的外周血样,对胎儿进行染色体核型分析,对胎儿及其父母应用微阵列比较基因组杂交(aCGH)技术进行拷贝数变异(CNV)分析,用qPCR技术验证候选致病CNV,用Goldeneye DNA身份鉴定系统确认生物学关系。结果:胎儿的染色体核型未见异常。aCGH分析结果提示其17p13.3区存在1.16 Mb的杂合缺失(1615572_2777617)×1,部分覆盖Miller-Dieker综合征(MDS)核心区域,同时17p12区域还存在1.33 Mb的杂合缺失(14111772_15442066)×1,该缺失可导致遗传性压力易感性周围神经病(HNPP)。孕妇外周血17p12区存在1.33 Mb杂合缺失(14111772_15442066)×1。胎儿父亲外周血检测未见异常。qPCR分析结果提示胎儿脐带血17p13.3和17p12区域以及孕妇外周血17p12区域基因表达量约为正常对照的1/2。亲缘关系鉴定结果显示胎儿父母确为其生物学父母,胎儿父母选择继续妊娠。结论:胎儿确诊为新发变异MDS,脑室增宽可能是MDS胎儿产前超声的一个重要指标。
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编辑人员丨1周前
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原发性CD5阳性的弥漫性大B细胞淋巴瘤的临床病理学特征
编辑人员丨1周前
目的:探讨C-MYC、bcl-2、bcl-6蛋白的表达与原发性CD5阳性的弥漫性大B细胞淋巴瘤(CD5-positive diffuse large B cell lymphoma,CD5 +DLBCL)患者临床病理特征之间的关系。 方法:收集2013年2月至2018年9月上海交通大学医学院附属瑞金医院初治诊断为原发性CD5 +DLBCL标本57例,采用HE染色、免疫组织化学技术及荧光原位杂交(FISH)法,检测原发性CD5 +DLBCL中C-MYC、bcl-2、bcl-6蛋白的表达情况,并分析其与临床病理特征之间的关系。 结果:57例原发性CD5 +DLBCL中,男性27例,女性30例,发病年龄35~99岁。C-MYC、bcl-2、bcl-6蛋白表达阳性率分别为50.9%(29/57)、84.2%(48/57)、75.4%(43/57),其中C-MYC和bcl-2双表达阳性率为40.4%(23/57);其在患者性别、临床分期、血清乳酸脱氢酶(LDH)水平、β2微球蛋白水平、国际预后指数(IPI)评分、B症状、骨髓侵犯和中枢神经系统(CNS)复发等临床特征之间差异无统计学意义( P>0.05);单因素生存分析显示:C-MYC阴性患者中位总生存率显著高于阳性患者( P=0.010),双表达阴性患者中位总生存率显著高于阳性患者( P=0.008),bcl-6阳性患者中位总生存率显著高于阴性患者,差异具有统计学意义( P=0.021),bcl-2蛋白表达与预后无明显相关性( P>0.05);Cox模型多因素分析显示,C-MYC蛋白表达可作为原发性CD5 +DLBCL患者总生存率的独立预测指标( P=0.034)。 结论:C-MYC、bcl-2、bcl-6蛋白在原发性CD5 +DLBCL的预后价值中,bcl-2表达对预后无影响,bcl-6阳性组预后较好,C-MYC蛋白表达可作为预测原发性CD5 +DLBCL患者预后的独立有效指标,但对于原发性CD5 +DLBCL患者中,C-MYC、bcl-2及bcl-6蛋白的表达与C-MYC、bcl-2及bcl-6基因重排之间的关系,还有待扩大样本量进一步深入探讨。
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编辑人员丨1周前
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钩端螺旋体c-di-AMP结合蛋白调控钾离子转运
编辑人员丨1周前
目的:寻找和鉴定钩端螺旋体中编码第二信使c-di-AMP结合蛋白KtrA,并探究c-di-AMP-KtrA/B系统的功能及调控机制。方法:采用PCR扩增 ktrA基因并克隆入pET42a质粒获得pET42a ktrA原核表达载体,将其转入表达宿主菌中获得表达rKtrA的工程菌 E. coli BL21DE3 pET42a-ktrA。通过亲和层析法提纯上述工程菌表达的重组蛋白rKtrA后,运用BIAcore技术检测rKtrA与c-di-AMP的结合能力。采用细菌双杂交法检测钩端螺旋体Ktr系统中KtrA与KtrB的结合能力以及外源c-di-AMP对其结合的调控机制。通过在钾离子转运功能缺失大肠埃希菌LB2003株中回补相关基因,分析c-di-AMP-KtrA/B通路功能。 结果:成功构建钩端螺旋体 ktrA基因原核表达工程菌,纯化的rKtrA可与c-di-AMP特异性结合;KtrA可与KtrB发生相互作用,该结合作用可被c-di-AMP解离;KtrA/B系统参与调控钾离子的摄取,该系统功能受c-di-AMP负调控。 结论:钩端螺旋体KtrA为c-di-AMP结合蛋白,c-di-AMP-KtrA/B系统参与调控钾离子的转运。
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编辑人员丨1周前
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EGFR和PD-L1双靶向嵌合抗原受体构建及表达
编辑人员丨1周前
目的:构建肿瘤相关抗原表皮生长因子受体特异性嵌合抗原受体(EGFR-CAR)和程序性死亡受体-配体1(PD-L1)抗体双修饰慢病毒载体表达系统。方法:人PD-L1-Fc蛋白免疫BALB/c小鼠,经细胞融合、亚克隆筛选高分泌PD-L1特异性抗体的稳定杂交瘤,酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot检测抗体特异性,流式细胞术(FACS)鉴定对PD-1配受体封阻性能,Fortebio测定抗体亲和力,抗体全长测序,经保留鼠源CRD1、CRD2和CRD3人源化改造后构建单链抗体(single-chain variable fragment,scFv);人EGFR单克隆抗体杂交瘤系,经5′RACE技术扩增其轻链和重链可变区(VL和VH)基因,构建scFv,克隆至真核载体pcDNA3.1表达鉴定。基因合成EGFR-CAR(引入CD137协同信号胞内功能域)与PD-L1-scFv借助2A序列连接,克隆入慢病毒pLVX-EF1a-IRES-ZsGreen1表达载体,使用Lenti-X Packaging Single Shots (VSV-G)共同转染293T细胞,获得包装病毒,感染293V细胞,FACS测定CAR膜表达,ELISA检测CAR感染293V细胞培养上清中PD-L1-scFv表达情况,转染激活人外周血T细胞,验证CAR膜表达。结果:获得PD-L1抗体11E3,具备高度配受体封阻性能,经人源化改造后,亲和力稳定(2.67×10 -10 mol/L),EGFR-scFv获得有效表达。进一步构建了EGFR-CAR和PD-L1双修饰慢病毒分泌型CAR(CTC0537-1)及膜表达型CAR(CTC0537-2),其病毒感染293V细胞阳性率为10%。CTZ0431-1感染293V细胞后,细胞膜表面表达EGFR-scFv,检测培养上清存在PD-L1-ScFv;CTZ0431-2感染293V细胞后,细胞膜表面EGFR-scFv和PD-L1-scFv有效表达,双表达病毒感染活化T细胞的CAR表达率为39.3%。 结论:成功构建了EGFR-CAR和PD-L1-scFv双表达慢病毒载体,EGFR-CAR中度结合亲和力,此为EGFR靶向和PD-L1抗体双修饰CAR-T细胞的实体瘤治疗研究提供了关键工具。
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编辑人员丨1周前
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盐肤木APETALA3/DEFICIENS同源基因的克隆与功能分析
编辑人员丨3周前
AP3/DEF(APETALA3/DEFICIENS)基因为MADS-box基因家族的B类基因,在花发育过程中主要参与调控花瓣和雄蕊发育.对盐肤木(Rhus chinensis)AP3/DEF同源基因进行克隆及功能分析,有助于探究其在盐肤木雄蕊发育过程中的作用.采用RT-PCR技术获得盐肤木AP3/DEF同源基因CDS;利用NCBI CD Search对其序列和结构域进行比较分析;利用酵母双杂交系统,对AP3/DEF同源蛋白与盐肤木中其它MADS-box转录因子进行蛋白互作验证;通过实时荧光定量PCR分析盐肤木AP3/DEF同源基因的时空表达模式;用过表达拟南芥(Arabidopsis thaliana)验证盐肤木AP3/DEF同源基因在花器官发育中的功能.结果表明,克隆得到2个盐肤木AP3/DEF同源基因分别命名为RcAP3(GenBank:OR962160)和RcTM6(GenBank:OR962159),根据其氨基酸保守结构域比对及系统进化分析,发现这2个蛋白序列与漆树科的芒果(Mangifera indica)和阿月浑子(Pistacia vera)AP3/DEF同源蛋白亲缘关系最近.酵母双杂交结果表明,RcAP3和RcTM6与盐肤木B类蛋白RcPI、C类蛋白RcAG和Rcag存在互作关系,但与A类和E类蛋白不存在互作关系.实时荧光定量PCR分析结果显示,RcAP3和RcTM6基因在不同性别盐肤木花芽快速发育期高表达,在花芽发育早期和开花后表达水平较低;RcAP3在雌花、雄花和两性花的花芽分化过程中均维持较高的表达水平,而RcTM6在两性花中显著表达,在雄花和雌花中表达量很低.两性花快速生长期,RcAP3在花瓣和雄蕊中高表达且差异很小,而RcTM6在雄蕊中的表达量显著高于其它花器官.RcAP3基因能恢复拟南芥ap3-3突变体花瓣和雄蕊的缺陷表型,RcTM6过表达则导致拟南芥花瓣、雄蕊和子房缩短,花药败育,表明盐肤木中同属AP3/DEF亚家族的同源基因RcAP3和RcTM6存在功能分化.RcAP3促进花瓣和雄蕊发育,而RcTM6抑制雄蕊发育.研究结果为进一步研究盐肤木性别分化的分子机制奠定了基础.
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编辑人员丨3周前
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成骨细胞条件性视黄酸信号失活小鼠模型的构建与验证
编辑人员丨1个月前
目的·构建并验证可模拟维生素A缺乏症(vitamin A deficiency,VAD)导致的颅颌面骨畸形且出生后可存活的模型小鼠.方法·运用Cre-LoxP重组酶系统,通过将OsxCre与Rosa26dnRARα/dnRARα基因型的小鼠多代杂交,构建成骨细胞视黄酸受体α显性负突变体(dominant-negative retinoid acid receptor α mutation,dnRARα)条件性过表达小鼠OsxCre;Rosa26dn/dn,实现成骨细胞视黄酸信号条件性失活以模拟VAD状态.取OsxCre Rosa26dn/dn小鼠及其同窝对照小鼠股骨骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cell,BMSC)与颅顶骨细胞,成骨诱导后,采用蛋白质印迹法(Western blotting)验证成骨细胞中视黄酸受体α(retinoid acid receptorα,RARα)蛋白的表达水平.取OsxCre;Rosa26dn/dn小鼠及其同窝对照小鼠颅顶骨细胞经诱导形成的成骨细胞,采用双荧光素酶报告基因技术验证视黄酸信号通路抑制程度.同时分别应用表达Cre、eGFP的腺病毒(Ad-eGFP与Ad-Cre)感染Rosa26dn/dn小鼠股骨BMSC与颅顶骨细胞,成骨诱导后运用相同方法评价显性负突变蛋白表达水平与视黄酸信号通路抑制程度.取6周龄小鼠颅骨,运用Micro-CT及三维重建技术验证OsxCre;Rosa26dn/dn模型小鼠颅颌面骨畸形表型.结果·Western blotting结果显示,OsxCre;Rosa26dn/dn小鼠股骨及颅顶骨成骨细胞相较同窝对照小鼠表现出RARα蛋白水平上调.双荧光素酶报告基因实验结果显示OsxCre Rosa26dn/dn小鼠成骨细胞的视黄酸反应元件(retinoid acid response element,RARE)活性相较同窝对照小鼠下调(P<0.05).同时,Ad-Cre感染后Rosa26dn/dn小鼠股骨及颅顶骨成骨细胞相较Ad-eGFP感染后表现出RARα蛋白水平上调,成骨细胞的RARE活性下调(P<0.05).Micro-CT及三维重建结果显示,6周龄OsxCre Rosa26dn/dn小鼠颅骨呈现长度缩短、骨发育不全等VAD样颅颌面骨畸形.结论·成功构建了成骨细胞条件性视黄酸信号失活小鼠模拟VAD所致颅颌面骨畸形,为未来VAD所致颅颌面骨畸形出生后致病机制与潜在靶点的研究提供了新的模型与途径.
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编辑人员丨1个月前
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基于核系统酵母双杂交技术的红螯螯虾IAG互作蛋白筛选
编辑人员丨2024/7/27
为探究胰岛素样促雄性腺激素(Insulin-like androgenic hormone,IAG)在甲壳动物性别分化过程作用的分子调控途径,挖掘与IAG蛋白存在互作关系的候选蛋白信息,研究使用红螯螯虾促雄性腺及输精管组织构建核体系酵母文库,利用酵母双杂交技术筛选与IAG互作的候选蛋白,并对关键候选蛋白的编码基因进行克隆与表达分析.获得初级文库容量为1.12×107,次级文库容量为1.28×107;成功筛选到25个阳性克隆,共注释到12个蛋白编码基因;克隆获得关键候选蛋白的编码基因muc5acl(Mucin-5AC-like)的CDS全长474 bp;半定量与荧光定量表达结果表明,muc5acl在红螯螯虾的促雄性腺、精巢及输精管中特异表达,且在雄性个体促雄性腺中的表达水平显著高于间性,在输精管中的表达则相反,推测该基因可能参与雄性激素的分泌及精子运输过程,并与间性红螯螯虾的性腺发育有关.研究结果将为进一步解析IAG调控红螯螯虾间性性别形成的分子机制提供重要信息.
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编辑人员丨2024/7/27
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内源代谢物烟酰胺缓解小鼠自发性狼疮肾炎的症状
编辑人员丨2024/7/20
目的 构建系统性红斑狼疮疾病NZB/W(F1)小鼠模型,评价内源代谢小分子烟酰胺对NZB/W(F1)模型小鼠狼疮肾炎发病过程中各指标的影响,为烟酰胺在狼疮肾炎治疗中的作用提供依据.方法 通过雄性NZW小鼠与雌性NZB小鼠杂交获取雌性NZB/W(F1)小鼠,利用代谢笼收集小鼠24 h尿液样本并利用蛋白尿试纸检测小鼠蛋白尿水平;通过眼眶静脉丛获取小鼠血液样本,利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中双链DNA抗体水平;利用全自动生化分析仪检测血清中血肌酐、尿素氮水平以及肝功能指标;通过苏木精-伊红染色和组织免疫荧光技术检测小鼠肾脏病理状态.结果 雌性NZB/W(F1)小鼠在自然发病过程中蛋白尿水平逐渐升高,血清中双链DNA抗体、血肌酐和尿素氮水平随周龄逐步升高,显示NZB/W(F1)小鼠狼疮肾炎疾病模型构建成功.与对照组同周龄小鼠相比,烟酰胺饲喂能够明显缓解小鼠蛋白尿水平(P=0.0070),抑制血清中双链DNA抗体产生(P=0.0325),缓解血肌酐(P=0.0067)和尿素氮(P=0.0166)指标发展,同时烟酰胺饲喂组小鼠肾脏损伤较对照组明显减轻.结论 成功构建NZB/W(F1)狼疮肾炎小鼠模型,发现烟酰胺饲喂能够明显缓解NZB/W(F1)小鼠狼疮肾炎的疾病进展.
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编辑人员丨2024/7/20
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橡胶树形成层组织的酵母双杂交cDNA文库构建及HbHDA6互作蛋白筛选
编辑人员丨2024/4/6
次生乳管是天然橡胶合成和贮存的场所,是由橡胶树树干树皮中维管形成层细胞分裂分化而来.次生乳管的数量与天然橡胶产量直接相关,而这些乳管的数量取决于形成层分化次生乳管的频率(乳管分化能力),是橡胶树产量育种的主要指标.前期研究中,我们发现组蛋白去乙酰化酶(HDA)抑制剂曲古抑菌素A(TSA)能诱导橡胶树乳管分化且组蛋白去乙酰化酶基因(HbHDA6)能够参与橡胶树乳管分化调控.由于组蛋白乙酰化修饰调控橡胶树次生乳管分化的分子机制尚未阐明,因此该文使用冠菌素(COR)诱导橡胶树形成层分化产生次生乳管的实验系统,以分离形成层组织为材料,构建酵母双杂交 cDNA 文库,以HbHDA6 基因为诱饵来筛选酵母双杂交文库,确定与 HbHDA6 相互作用的蛋白.结果表明:(1)利用Gateway技术构建的均一化COR诱导橡胶树形成层组织的酵母双杂交cDNA文库,初级文库的容量为 6.34×106 CFU·mL-1,总单克隆数为1.27×107,文库重组率为100%;次级文库的容量为7.72×106 CFU·mL-1,总单克隆数为 1.54×107,文库重组率为 100%.初级文库和次级文库的插入片段平均长度分别为 1.1 kb和 1.2 kb.(2)成功构建了筛选 HbHDA6 互作蛋白的pGBKT7-HbHDA6 诱饵载体,并确认无自激活活性.(3)使用该诱饵载体对构建的酵母双杂交cDNA文库进行筛选,并通过NCBI_BLAST比对和去除重复以后,获得了 22 个与HbHDA6 发生互作的蛋白,包括CLP1、ERF3、ERF4、HSP82、LARP6a、APT5、PP2A、FBA6 等.该研究成果为解析组蛋白乙酰化修饰调控橡胶树次生乳管分化的分子机制提供了理论基础,为转基因改良橡胶树的产胶潜力提供了候选基因,为高性能天然橡胶遗传改良育种提供了新线索.
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编辑人员丨2024/4/6
