目的:探讨重组卡介苗(BCG)的抗膀胱癌作用，评估膀胱内灌注重组BCG对大鼠生存的影响。方法:构建稳定表达白细胞介素(IL)-15和Ag85B的重组BCG菌株(BCG-IL-15-Ag85B)，建立大鼠膀胱癌模型，分为BCG-IL-15-Ag85B灌注组，BCG灌注组和磷酸盐缓冲液(PBS)灌注组。观察并记录各组大鼠的生存情况，测量各组大鼠肿瘤的体积，以评估抗肿瘤效果；流式细胞术检测不同组别膀胱组织内嗜中性粒细胞和淋巴细胞的水平，荧光定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测不同组别中巨噬细胞炎症蛋白1α(MIP1α)和MIP2 mRNA的表达水平。组间比较采用独立样本 t检验。 结果:成功构建可表达IL-15融合蛋白的重组BCG，BCG-IL-15-Ag85B可显著延长荷瘤大鼠的生存时间以及抑制肿瘤的生长。BCG-IL-15-Ag85B灌注组(607.33±18.45)的中性粒细胞数目明显高于BCG灌注组(405.00±24.64)和PBS灌注组(204.67±20.55)，差异有统计学意义( t＝11.386， P<0.05)；BCG-IL-15-Ag85B灌注组(114.67±15.82)的淋巴细胞数目明显高于BCG灌注组(50.00±10.00)和PBS灌注组(17.67±2.52)，差异有统计学意义( t＝5.984， P<0.05)。BCG-IL-15-Ag85B灌注组(2.78±0.57)的MIP1α mRNA的表达水平明显高于BCG灌注组(1.76±0.13)和PBS灌注组(1.00±0.06)，差异有统计学意义( t＝5.327， P<0.05)。BCG-IL-15-Ag85B灌注组(2.96±0.62)的MIP2 mRNA的表达水平明显高于BCG灌注组(1.88±0.16)和PBS灌注组(1.00±0.07)，差异有统计学意义( t＝5.674， P<0.05)。 结论:膀胱内灌注BCG-IL-15-Ag85B增强了膀胱组织的免疫应答，提高了抗肿瘤效果，为膀胱癌的临床治疗提供新思路和新策略。

目的:初步评价自主构建的结核多组分重组蛋白疫苗EPRHP014免疫原性和保护效果，为研制结核新疫苗、有效防控结核病提供科学基础。方法:选择结核分枝杆菌全长蛋白抗原3种（EsxH、Rv2628和HspX）和经表位预测和优化的表位优势蛋白抗原2种（nPPE18和nPstS1），共5种组分构建蛋白抗原组合物EPRHP014，包括融合表达纯化的多组分蛋白抗原（EPRHP014f）和分别表达纯化单个蛋白构成多组分混合蛋白抗原（EPRHP014m）。EPRHP014f和EPRHP014m分别辅以铝佐剂制备多组分蛋白疫苗，采用卡介苗（BCG）作对照。皮下注射免疫BALB/c小鼠后，采用ELISA法检测血清特异性抗体效价，采用ELISpot和Luminex技术检测多种细胞因子分泌情况，采用结核分枝杆菌体外生长抑制试验观察其免疫保护作用。结果采用 t检验或秩和检验进行统计分析。 结果:EPRHP014m和EPRHP014f免疫小鼠后均能诱导产生高效价的IgG抗体及其亚型IgG1和IgG2a，抗体效价与BCG免疫组小鼠差异无统计学意义（ P>0.05）。EPRHP014f组诱导产生的分泌IFN-γ和IL-4的斑点形成细胞（SFC）数量均高于EPRHP014m组和BCG组（ P<0.05），而EPRHP014m组和BCG组的IFN-γ和IL-4的SFC数量差异无统计学意义（ P>0.05）。EPRHP014m组诱导分泌的GM-CSF、IL-12p70均高于BCG组（ P<0.05），而IL-6和IL-10分泌水平与BCG组的差异无统计学意义（ P>0.05）；EPRHP014f组和BCG组的IL-6、IL-10、IL-12和GM-CSF分泌水平差异无统计学意义（ P>0.05）。EPRHP014m组、EPRHP014f组和BCG组具有明显的体外抑菌作用，差异无统计学意义（ P>0.05）。 结论:EPRHP014f和EPRHP014m免疫后均能诱导小鼠产生较强的体液免疫和细胞免疫应答，且有较强的体外抑制结核分枝杆菌生长的能力，显示抗原组合物EPRHP014具有良好的结核疫苗研发和应用价值。

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的全球性传染性疾病。卡介苗作为在全球普遍接种的结核病疫苗，可降低儿童重症结核病的发病率，但对减少成人结核病的发病率价值有限。新型结核病疫苗的研发对全球结核病防治目标的达成必不可少，本研究就已进入临床试验阶段的疫苗进行综述，并介绍目前疫苗的研究策略。

目的:对5个结核分枝杆菌重组蛋白及其组合物的细胞免疫进行评价。方法:88份新鲜肝素抗凝人群外周静脉血液，其中42份来自北京市昌平区结核病防治所就诊的结核病患者，46份健康志愿者由中国疾病预防控制中心传染病所提供，均为接种过卡介苗（BCG）且没有结核暴露史和任何临床症状体征的健康人。以结核分枝杆菌标准菌株H37Rv DNA为模板，PCR扩增选取的5个重组蛋白Rv3874、Rv3875、Rv2031c、Rv1411c和Rv3418c的完整编码基因；通过基因重组和蛋白纯化技术，分别克隆、表达和纯化5个重组蛋白作为刺激物，采用效应T细胞酶联免疫斑点试验（ELISPOT）对人群进行细胞免疫检测。结果:成功克隆、表达和纯化了Rv3874、Rv3875、Rv2031c、Rv1411c和Rv3418c重组蛋白；灵敏度分别为50.00%、71.43%、69.04%、73.81%和76.19%；特异度分别为86.96%、76.09%、71.74%、39.13%和36.96%。阳性预测值、阴性预测值、曲线下面积及约登指数分别为52.46%~77.78%、62.96%~74.47%、0.511~0.754和0.129~0.475。除Rv1411c和Rv3418c外，Rv3874、Rv3875和Rv2031c在结核病患者中检测到的斑点形成细胞数均高于健康志愿者，差异均具有统计学意义（ P值均<0.001）。在5个重组蛋白所构成的26种组合物中，灵敏度为80.95%~95.24%，特异度为68.89%~24.44%。随着组合物中重组蛋白个数的增加其灵敏度逐渐增加，但特异度随之下降。 结论:结核分枝杆菌重组蛋白Rv3874、Rv3875和Rv2031c刺激T细胞产生免疫应答的能力较强，具有一定的抗原性。而Rv1411c和Rv3418c单独用作诊断抗原的效能并不理想，与多组分抗原联合构成的组合物具有一定应用价值。

目的 探讨重组蛋白Rv2346c对卡介苗(BCG)感染鼠巨噬细胞(RAW264.7)后的免疫效应的影响及其机制.方法 通过DNA合成、基因扩增、载体构建、诱导表达、纯化等过程制备重组蛋白Rv2346c;利用Cell Counting Kit-8 (CCK8)方法检测RAW264.7增殖水平;采用菌落形成试验评估BCG生长情况;运用ELISA方法检测BCG和RAW264.7共培养上清中的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6 (IL)-6的浓度;采取Western blot方法检测RAW264.7细胞中核转录因子κB (NF-κB) p65的表达水平.结果 DNA测序及Western blot检测证实成功制备重组蛋白Rv2346c;BCG可以抑制RAW264.7细胞增殖(P＜0.05),而RAW264.7细胞对BCG有灭活作用(P＜0.05);重组蛋白Rv2346c可以增强BCG对RAW264.7细胞增殖的抑制作用(P＜0.05),并降低RAW264.7对BCG的灭活效应(P＜0.05);Rv2346c还可以抑制RAW264.7分泌TNF-α和IL-6(P＜0.05),并抑制NF-κB p65的表达(P＜0.05).结论 重组蛋白Rv2346c可以抑制小鼠巨噬细胞RAW264.7对BCG的免疫灭活效应,该作用可能与抑制细胞因子分泌和NF-κB p65活化有关,具体机制值得进一步深入探讨.

目的 构建结核分枝杆菌rBCG-Rv2029c重组疫苗并鉴定.方法 通过PCR扩增Rv2029c抗原编码基因,然后用双酶切法将Rv2029c和pMV261质粒酶切,再将酶切产物连接成rpMV261-2029c重组质粒,用电穿孔法将该质粒导入BCG中构建成rBCG-Rv2029c重组疫苗,最后用SDS-PAGE和Western blotting鉴定表达的重组蛋白.结果 通过PCR成功扩增出1 020 bp的Rv2029c基因,插入到pMV261质粒中,再把融合基因成功导入BCG中,经双酶切及基因比对鉴定证实,再通过热诱导后用Western blotting显示重组蛋白具有免疫原性.结论 成功构建了结核分枝杆菌rBCG-Rv2029c重组活疫苗,为重组疫苗的免疫机制研究奠定基础.

目的 通过不同分枝杆菌致敏豚鼠皮试反应的大小评价4种结核分枝杆菌皮肤变态反应原的诊断效果.方法 用结核分枝杆菌和卡介苗分别致敏豚鼠,致敏成功后采用轮圈法于每只豚鼠皮内分别注射TB-PPD、BCG-PPD、重组结核分枝杆菌ESAT6-CFP10变态反应原(简称EC)和重组结核分枝杆菌11kDa变态反应原(简称11kDa)4种皮肤变态反应原各0.1mL.记录注射后24及48 h注射局部红肿反应的纵径和横径,计算其均值.结果 在不同分枝杆菌致敏豚鼠中,4种皮试试剂各自24及48 h皮试反应大小差异均无统计学意义(P＞0.05).在结核分枝杆菌致敏豚鼠中,TB-PPD和BCG-PPD皮试反应均为阳性,48 h局部红肿直径分别为(11.1±1.4)和(8.7±2.4) mm,差异有统计学意义(P＜0.05);EC和11kDa皮试反应也均为阳性,48 h局部红肿直径分别为(15.4±2.3)和(17.0± 1.7) mm,差异无统计学意义(P＞0.05),但两者反应强度均高于TB-PPD和BCG-PPD.在卡介苗致敏豚鼠中,TB-PPD和BCG-PPD皮试反应均为阳性,48 h局部红肿直径分别为(11.8±1.3)和(11.4±1.5) mm,差异无统计学意义(P＞0.05).而EC和11kDa皮试反应均为0.结论 EC和11kDa可有效鉴别结核分枝杆菌感染和卡介苗接种,而TB-PPD和BCG-PPD均不能对其进行有效鉴别.

目的 构建弓形虫Rhomboid基因和猪IL-2基因的重组卡介苗(BCG),并分析其免疫保护效果.方法 应用RT-PCR技术分别扩增弓形虫Rhomboid基因和猪IL-2基因,克隆至pMD 18-T载体中,双酶切鉴定及测序正确后,将弓形虫Rhomboid基因和猪IL-2基因串联后分别连接至穿梭表达载体pMV261和整合表达载体pMV361中,电转化BCG,制备重组BCG pMV261-IL-2-Rho和pMV361-IL-2-Rho.分别经颈部肌肉注射免疫猪,共3次,每次间隔2周,免疫剂量均为108 CFU/只,采用ELISA法检测免疫前后猪体内抗体(IgG)滴度、Th1型及Th2型细胞因子的变化情况;第3次免疫后2周通过腹腔注射的方式接种弓形虫China I株速殖子1×108个/只进行攻虫试验,观察重组BCG对猪的免疫保护效果.结果 成功构建了重组BCG pMV261-IL-2-Rho和pMV361-IL-2-Rho.重组BCG免疫猪后,随着免疫次数的增加,血清中抗体滴度也逐渐升高,且与PBS对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.01).3次免疫后,pMV261-IL-2-Rho组血清Th1型细胞因子IL-2、IFNγ和IL-12的表达水平均明显提高,与PBS对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.05),而pMV361-IL-2-Rho组血清IL-2、IFNγ和IL-12的水平虽略有升高,但与PBS对照组相比,差异无统计学意义(P＞0.05);各组在免疫过程中Th2型细胞因子IL-4水平均未发生明显变化.攻虫后各组猪出现精神沉郁,食欲下降,体温升高等症状,耐过发病期后的猪,食欲逐渐恢复,体温渐趋正常,各种症状减轻,且各组猪在攻虫后20 d均无死亡.结论 构建的基因重组BCG pMV261-IL-2-Rho对猪弓形虫感染具有一定的免疫保护作用.

目的:在小鼠体内观察卡介苗的锌离子依赖的金属蛋白酶-1 (Zinc metalloprotease-1, Zmp1) 对结核分枝杆菌抗原PPE68处理的影响.方法:68周龄BALB/c小鼠随机分为5组, 分别为p Bud CE4.1空质粒对照组 (n=7) 、表达PPE68抗原肽的p BudCE4.1-PPE68p质粒组 (n=9) 、表达PPE68抗原的p Bud CE4.1-PPE68质粒组 (n=9) 、PPE68抗原和Zmp1共表达的p Bud CE4.1-PPE68-Zmp1质粒组 (n=10) 及PPE68抗原肽和Zmp1共表达的p Bud CE4.1-PPE68p-Zmp1质粒组 (n=8) .各组质粒电转化减毒沙门菌株SL7207构建相应的重组沙门菌.以灌胃方式将各组沙门菌免疫小鼠3周.收集小鼠血液和肺肠灌洗液, 采用ELISA法测定血清中IFN-γ、IL-12含量及肺与肠道s Ig A的含量;分离培养脾细胞, 用CCK-8法检测脾淋巴细胞增殖情况.结果:与PPE68抗原组相比, PPE68和Zmp1共表达组的IFN-γ (117.29±16.86, P=0.034) 、IL-12 (40.46±7.11, P=0.0037) 、淋巴细胞刺激指数SI (3.30±0.49, P=0.004) 均降低;与PPE68抗原肽组相比, PPE68抗原肽和Zmp1共表达组相应因子含量下降不明显, IFN-γ (132.75±28.40, P=0.070) 、IL-12 (55.43±11.78, P=0.198) 、SI (4.70±1.57, P=0.124) .结论:卡介苗的Zmp1影响结核分枝杆菌抗原PPE68的处理过程, 这可能是影响BCG免疫效果的重要原因.

目的 用豚鼠模型初步评价抗生素联合卡介苗治疗结核病的可行性.方法 用高剂量Mtb皮下攻击豚鼠2周后,将重组ESAT6-CFP10(EC)变态反应原皮试阳性的豚鼠随机分成4组:NS组、BCG组、抗生素组、抗生素+BCG组.抗生素+BCG组接受异烟肼(isoniazid,INH)和利福喷丁(rifapentine,RFT)的联合化疗,1次/周,共3次,给药结束后,每只豚鼠皮下免疫1/10人用剂量BCG;BCG组每只豚鼠仅皮下免疫1/10人用剂量BCG;抗生素组仅给药INH和RFT,1次/周,共3次;NS组给予生理盐水作为阴性对照.全部豚鼠于攻毒13周后安乐死解剖,评价肝、脾、肺的脏器综合病变指数,计算脾脏活菌载量(lg CFU),并对肝、脾、肺脏器做组织病理检查.结果 NS组、BCG组、抗生素组和抗生素+BCG组的脏器评分分别为83±8、81±10、45±28和33±14.其中,BCG组与NS组差异无统计学意义;抗生素组和抗生素+BCG组与NS组差异均有统计学意义(分别q=6.84,P＜0.001;q=9.02,P＜0.001),两组与BCG组比较,差异也均有统计学意义(q=6.44,P＜0.001;q=8.63,P＜0.001);但抗生素组与抗生素+BCG组差异无统计学意义.抗生素+BCG组豚鼠的脾脏活菌载量为(3.62±1.13)lgCFU,与NS组的(4.92±0.52) lg CFU和BCG组的(5.20±0.43) lg CFU比较,差异均有统计学意义(q=5.54,P＜0.01;q=6.72,P＜0.001).抗生素组脾脏活菌载量为(4.39±0.50)lg CFU,与其他各组的差异均无统计学意义.病理组织切片显示各组病变程度由重到轻依次为BCG组＞NS组＞抗生素+BCG组≈抗生素组.结论 化疗后免疫1针BCG的治疗效果较差,多针次的BCG免疫效果还需进一步研究.