目的 构建稳定表达Cas9蛋白的工具细胞,并利用短回文重复序列/相关蛋白9(CRISPR/Cas9)编辑技术改造1型单纯疱疹病毒(HSV-1),获得ICP34.5基因敲除的oHSV-1/Ecfp重组病毒.方法 利用慢病毒包装体系,将包装Cas9表达质粒的病毒感染HEK293T细胞,然后经嘌呤霉素筛选获得稳定表达Cas9蛋白的293T-Cas9细胞株,通过聚合酶链式反应(PCR)及蛋白质免疫印迹技术检测Cas9基因及蛋白表达情况;利用分子克隆技术构建HSV-1病毒ICP34.5基因敲除的基因编辑质粒(pU6-Ecfp);pU6-Ecfp转染293T-Cas9细胞后感染野生型HSV-1病毒,在胞内通过CRISPR/Cas9技术敲除HSV-1病毒中ICP34.5基因,再利用增强型青色荧光(Ecfp)示踪及极限稀释法进行病毒富集纯化,通过PCR法进行oHSV-1/Ecfp病毒鉴定.结果 PCR扩增、核酸电泳及蛋白质免疫印迹技术结果显示,细胞株293T-Cas9高转录Cas9基因及高表达Cas9蛋白;通过PCR鉴定及荧光示踪结果显示,基因编辑质粒pU6-Ecfp构建成功;Ecfp荧光示踪、PCR扩增及核酸电泳结果显示,Ecfp成功插入ICP34.5基因敲除位点,获得oHSV-1/Ecfp重组病毒.结论 稳定表达Cas9蛋白的293T-Cas9细胞可作为CRISPR/Cas9基因编辑的工具细胞,构建的HSV-1/Ecfp病毒实现了ICP34.5基因敲除及Ecfp示踪蛋白的敲入.

目的:探讨经靶向导管注入尼可地尔与重组人尿激酶原(rh-proUK)联合经皮冠状动脉介入术(PCI)治疗冠状动脉慢性完全闭塞(chronic total occlusion,CTO)的效果及对远期预后的影响.方法:收集2021年9月至2023年1月于我院成功进行PCI术的237例CTO患者为研究对象,开展回顾性研究.根据治疗方法不同进行分组,将经靶向导管注入尼可地尔联合PCI术治疗的患者纳入尼可地尔组(n=78),将经靶向导管注入rh-proUK联合PCI术治疗的患者纳入rh-proUK组(n=78),将经靶向导管注入尼可地尔与rh-proUK联合PCI术治疗的患者纳入联合组(n=81).比较3组微循环指标[靶血管心肌梗死溶栓试验(TIMI)血流分级、TIMI心肌灌注分级(TMPG)、校正TIMI血流帧数(cTFC)]、心肌损伤指标[肌酐、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、N末端脑钠肽前体(NT-proBNP)、肌钙蛋白(IcTnⅠ)]、心功能[左心室舒张末期内径(LVED)、室壁运动积分指数(WMSI)、左心室射血分数(LVEF)]、心肌微循环血流灌注情况[心肌灌注定量分析常数(k)]及不良心血管事件发生率.结果:联合组TMPG 3级占比高于尼可地尔组、rh-proUK组,cTFC低于尼可地尔组、rh-proUK组(P＜0.05);术后24h联合组CK-MB、肌酐、IcTnⅠ、NT-proBNP均低于尼可地尔组、rh-proUK组(P＜0.05);术后3个月 联合组LVEF高于尼可地尔组、rh-proUK组,LVED 低于尼可地尔组、rh-proUK组(P＜0.05);术后7d联合组基础态、负荷态心肌微循环血流灌注k值高于尼可地尔组、rh-proUK组(P＜0.05);3组术后6个月、12个月不良心血管事件总发生率比较无显著差异(P＞0.05).结论:经靶向导管注入尼可地尔与rh-proUK联合PCI术治疗CTO患者可促进术后心肌微循环改善,有助于缓解术后心肌损伤、恢复心功能,改善远期预后.

目的:探讨miR-181a在AR儿童血清中的表达,并分析miR-181a对AR患儿Treg细胞分化和功能的调控作用.方法:选择20例AR患儿和20例年龄相近,无过敏史的儿童为研究对象.Pearson相关分析外周血Treg数量与miR-181a表达之间关系.从AR患儿外周血中分离纯化Tregs.将miR-181a模拟物和抑制剂转染到Tregs细胞中.用流式细胞仪和ELISA法评价Tregs的功能.用卵清蛋白建立AR小鼠模型,然后通过功能增益和功能损失法确定miR-181a在AR中的作用.结果:与对照组相比,AR患儿外周血Treg数量减少,并且miR-181a表达显著降低.Pearson相关分析显示外周血Treg数量与 miR-181a表达呈显著正相关(R2=0.335,P＜0.001).miR-181a模拟物促进了 Tregs的增殖,并上调了 IL-10和TGF-β的mRNA表达.荧光素酶报告试验表明,miR-181a直接靶向OPN的3'UTR.在动物实验中,与AR和AR+miR-NC组相比,AR+miR-181a模拟组炎症减轻,AR+miR-181a抑制剂组炎症更严重.重组OPN蛋白显著逆转了 miR-181a模拟物的抗炎作用.此外,AR组小鼠Treg细胞明显减少,miR-181a模拟物显著增加了 AR小鼠的Treg细胞,而重组OPN蛋白显著逆转了miR-181a模拟物诱导的Treg细胞增多.结论:miR-181a的上调显著降低了 OPN的表达,进而减少了嗜酸性粒细胞和增强Treg功能,减轻了 AR发病过程中气道炎症的发生.

目的 观察参芪地黄汤结合重组人促红细胞生成素与左卡尼汀治疗对终末期肾病患者肾功能的影响及Janus激酶/信号转导与转录激活子(JAK/STAT)途径的调控作用.方法 选择 2019 年 10 月至 2021 年10 月在邢台医学高等专科学校第二附属医院就诊的 144 例终末期肾病患者作为研究对象.将患者按随机数字表法分参芪地黄汤治疗组和常规治疗组,每组 72 例.两组患者均行维持性血液透析,常规治疗组给予重组人促红细胞生成素和左卡尼汀治疗,参芪地黄汤治疗组加用参芪地黄汤(组成:生黄芪、桑寄生、旱莲草、猪苓、茯苓皮、生薏苡仁、丹参、石韦各 30 g,党参、山茱萸、泽兰、淮山药各 15 g,生地黄、荔枝核、蚕砂、莪术各 10 g,决明子 6g),每日 1 次,共治疗 3 个月.观察不同治疗方式两组患者治疗后的临床疗效和肾功能、微炎症状态及血清JAK/STAT途径相关蛋白水平的变化,并记录不良反应发生情况.结果 参芪地黄汤治疗组总有效率高于常规治疗组[90.28%(64/72)比 77.78%(55/72),P＜0.05].两组治疗后残余肾功能(RRF)、24 h尿蛋白、血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)和炎症因子[超敏C-反应蛋白(hs-CRP)、白细胞介素-6(LL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)]水平均较治疗前明显降低,参芪地黄汤治疗组治疗后RRF明显高于常规治疗组(mL/min:4.82±1.18比 3.96±1.05),而 24h尿蛋白(mg:62.26±12.16 比 97.71±16.28)、BUN(mmol/L:16.25±3.64 比 20.65±4.13)、SCr(μmol/L:242.25±25.62 比 280.62±26.63)、hs-CRP(mg/L:5.86±1.15 比 7.78±1.32)、IL-6(ng/L:3.26±0.64比 4.62±1.13)、TNF-α(μg/L:29.23±5.64 比 32.66±6.13)含量均明显低于常规治疗组(均P＜0.05).治疗后参芪地黄汤治疗组JAK、STAT均较治疗前呈增加趋势,而磷酸化JAK(p-JAK)、磷酸化STAT(p-STAT)均较治疗前呈降低趋势(均P＜0.05),常规治疗组血清JAK/STAT途径相关蛋白水平变化不显著(均P＞0.05),故参芪地黄汤治疗组治疗后JAK、STAT均明显高于常规治疗组[JAK(μg/L):1.46±0.28 比 1.26±0.26,STAT(μg/L):1.37±0.25 比 0.99±0.24,均P＜0.05],p-JAK、p-STAT均明显低于常规治疗组[p-JAK(μg/L):0.45±0.08 比0.65±0.13,p-STAT(μg/L):0.66±0.13 比 0.82±0.28,均P＜0.05].两组患者不良反应发生率差异无统计学意义[13.88%(10/72)比 9.72%(7/72),P＞0.05].结论 在重组人促红细胞生成素与左卡尼汀治疗基础上服用参芪地黄汤可有效抑制JAK/STAT信号通路,改善终末期肾病患者肾功能以及微炎症状态,从而提高治疗效果.

目的 通过在人胚肾-293T(human embryo kidney-293T,HEK-293T)细胞中过表达岩藻糖转移酶 2(fucosyl-transferases 2,FUT2)基因,进而催化诺如病毒受体人类组织血型抗原(histo-blood group antigen,HBGA)的形成,构建介导诺如病毒和受体发生相互作用的细胞系.方法 构建FUT2 慢病毒质粒,采用Lipofectamine 2000 将FUT2慢病毒质粒及pMD.2G和psPAX2 包装质粒共转染HEK-293T细胞,收获慢病毒颗粒.慢病毒颗粒感染对数生长期的HEK-293T细胞,嘌呤霉素加压筛选获得HEK-293T/FUT2 细胞系.PCR鉴定FUT2 基因是否整合到基因组中,RT-qPCR检测HEK-293T/FUT2 细胞FUT2 mRNA转录水平,流式细胞术分析HEK-293T/FUT2 细胞HBGAs的表达,间接免疫荧光法分析HEK-293T/FUT2 细胞与诺如病毒病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)的结合活性.结果 成功构建了序列正确的慢病毒质粒PLVX-IRES-Puro-FUT2,并获得了慢病毒颗粒.慢病毒颗粒感染HEK-293T细胞后,通过嘌呤霉素加压筛选获得了HEK-293T/FUT2 细胞系,PCR验证显示,FUT2 基因成功整合到HEK-293T细胞基因组中.HEK-293T/FUT2 细胞FUT2 mRNA水平提高了 330 倍.99.9%的HEK-293T/FUT2 细胞表达H2 型人类组织血型抗原.GI.1 重组诺如病毒VLP可以与HEK-293T/FUT2 细胞产生很好的结合反应,EC50为 2.007 μg/mL.结论 建立了H2 型人类组织血型抗原稳定高表达的HEK-293T细胞系,并基于该细胞系初步建立了GI.1 型重组诺如病毒VLP结合活性评价方法.

目的 探讨肥胖对首发急性缺血性脑卒中患者重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)静脉溶栓预后不良的影响.方法 选取2017年12月—2023年12月于苏州大学附属苏州九院神经内科经rt-PA静脉溶栓治疗的297例首发脑梗死患者为研究对象,依据90 d改良的Rankin量表(mRS)评分分为预后不良组(mRS评分为3～6分)和预后良好组(mRS评分为0～2分).采用多因素Logistic回归分析影响急性缺血性脑卒中静脉溶栓患者90 d预后不良的危险因素.结果 297例首发急性缺血性脑卒中患者中,预后良好212例,预后不良85例,预后不良发生率为28.62%.预后不良组肥胖(体重指数≥28.0 kg/m2)患者占27.06%(23/85)、吸烟患者占31.76%(27/85)、溶栓前美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分为13.00(9.50,18.00)分,高于预后良好组的16.98%(36/212)、20.28%(43/212)及7.00(5.00,11.00)分,差异均有统计学意义(χ2/Z=3.871、4.440、-8.013;P＜0.05).多因素Logistic回归分析显示,肥胖(OR=2.918,95%CI=1.364～6.242)、吸烟(OR=3.648,95%CI=1.678～7.931)、溶栓前NIHSS评分高(OR=1.269,95%CI=1.184～1.361)是急性缺血性脑卒中患者静脉溶栓预后不良的危险因素(P＜0.05).结论 肥胖是首发缺血性脑卒中患者静脉溶栓90 d预后不良的危险因素.

目的 探讨肺部超声联合白细胞介素23(IL-23)、IL-17在新生儿感染性肺炎中的诊断和预后评估价值.方法 选取河北省石家庄市人民医院2020年6月至2023年8月收治124例新生儿感染性肺炎患儿作为肺炎组,根据新生儿危重症评分分为非危重组(＞90分,72例)和危重组(≤90分,52例).另选取同期因黄疸住院未合并肺部并发症的124例新生儿作为对照组.根据新生儿感染性肺炎治疗7 d后超声检查情况及症状将患儿分为预后良好组和预后不良组.所有患儿入院后接受肺部超声检查评价肺部超声评分,采用酶联免疫吸附试验法检测血清IL-23、IL-17水平.比较各分组类别患儿肺部超声评分和血清IL-23、IL-17水平,采用受试者工作特征(ROC)曲线分析以上指标对新生儿感染性肺炎的诊断和预后评估价值.结果 肺炎组肺部超声评分和血清IL-23、IL-17水平均高于对照组(均P＜0.05);危重组肺部超声评分和血清IL-23、IL-17水平均明显高于非危重组(均P＜0.05);预后良好组肺部超声评分和血清IL-23、IL-17水平均明显低于预后不良组(均P＜0.05)o ROC曲线分析结果显示,肺部超声评分、IL-23、IL-17联合诊断新生儿感染性肺炎的曲线下面积为0.901,显著大于各指标单独诊断(Z=4.209、3.492、3.748,均P＜0.05);三者联合评估新生儿感染性肺炎预后的曲线下面积为0.954,显著高于各指标单独评估(Z=2.472、2.048、2.839,均P＜0.05).结论 新生儿感染性肺炎患儿肺部超声评分和血清IL-23、IL-17水平均明显升高,其水平与病情及预后密切相关.三者联合对新生儿感染性肺炎诊断和预后评估的效能较佳.

目的:研究传统中药材全蝎三种热稳定性多肽BmKcug2、BmKcug2-P1 和Martentoxin-P2 的消化酶抗性.方法:结合重组表达、消化酶耐受实验、高效液相色谱技术及结构分析,评价多肽BmKcug2、BmKcug2-P1 和Martentoxin-P2 的肠胃蛋白酶稳定性.结果:多肽BmKcug2 对胃蛋白酶、胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶都有很好的稳定性;多肽BmKcug2-P1 对胃蛋白酶稳定性较好,对胰蛋白酶也具有一定的抗性,但对α-胰凝乳蛋白酶稳定较差;多肽Martentoxin-P2 的酶稳定性谱与BmKcug2-P1 类似.结论:本研究发现了全蝎毒腺中存在多肽能够耐受肠胃蛋白酶的消化作用,阐明了全蝎毒腺中多肽的消化酶稳定性,为深入研究全蝎中有效药用成分提供了思路,为系统研究全蝎多肽活性成分和口服给药途径之间的关系奠定了基础.

目的:构建荷载第10号染色体上缺失与张力蛋白同源的磷酸酯酶（PTEN）基因的溶瘤腺病毒验证其在前列腺癌中表达水平及靶向抗肿瘤效果。方法:挖掘公开数据库和利用Galaxy在线工具处理本中心去势抵抗性前列腺癌（CRPC）标本基因测序数据，分析PTEN基因在前列腺癌组织中的表达差异。收集2019年3月至2022年8月徐州医科大学附属医院79例前列腺癌患者的病理样本和临床信息，免疫组织化学法检测前列腺癌组织及癌旁组织中PTEN蛋白的表达。同源重组法构建溶瘤腺病毒ZD55-PTEN，细胞计数试剂盒（CCK-8）法、Hoechst-33258和划痕实验检测其靶向抗肿瘤效果。分别采用卡方检验和 t检验对定性资料和定量资料进行统计分析，不满足正态分布的数据采用Mann-Whitney U检验；Spearman分析PTEN表达水平与临床病理特征的关系。 结果:前列腺癌组织中PTEN表达水平明显低于癌旁组织，差异有统计学意义（501例比52例， Z＝－19.25， P<0.05）；PTEN的mRNA表达水平与淋巴结转移（ n＝425， rs＝－0.98， P<0.05）和Gleason评分（ n＝497， rs＝－1.25， P<0.05）呈负相关。CRPC阶段PTEN缺失明显高于激素敏感性前列腺癌（HSPC）阶段（79例比125例， Z＝－0.89， P<0.05）。前列腺癌组织的PTEN蛋白缺失率高于癌旁组织（45.6%比16.5%， t＝10.98， P<0.01），术前血清PSA水平（ n＝79， rs＝－0.47， P<0.01）和术后Gleason评分（ n＝79， rs＝－0.31， P<0.05）与PTEN的表达呈负相关。PTEN缺失的前列腺癌患者，确诊时PSA水平（36例比43例， χ2＝12.22， P<0.05）和根治术后Gleason评分（36例比43例， χ2＝6.92， P<0.05）显著高于PTEN蛋白完整患者。成功构建溶瘤腺病毒ZD55-PTEN，ZD55-PTEN组细胞存活率低于对照组[ZD55-EGFP组（49.67±4.19）%、ZD55-PTEN组（29.33±3.84）%， t＝8.68， P<0.05]；细胞凋亡率高于对照组[PBS组（12.86±5.23）%、ZD55-EGFP组（48.18±4.22）%、ZD55-PTEN组（68.93±5.88）%， t＝5.90， P<0.05]；划痕愈合率低于对照组[PBS组（79.13±3.98）%、ZD55-EGFP组（61.02±4.73）%、ZD55-PTEN组（47.92±5.97）%， t＝6.34， P<0.05]。 结论:PTEN基因低表达于前列腺癌组织中，且具有抑制DU145细胞的增殖、迁移并诱导凋亡的功能。

目的:观察吞噬和运动蛋白3(ELMO3)在胰腺癌组织中的表达及与预后的关系，探讨ELMO3对胰腺癌细胞增殖及迁移侵袭能力的影响。方法:选取郑州大学附属洛阳中心医院病理科2011年3月至2019年2月存档的蜡块，免疫组织化学法测定ELMO3在49例胰腺癌及相应癌旁组织中表达，分析其与胰腺癌临床病理特征及预后间的关系。实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)法检测胰腺癌细胞株PANC-1、SW1990、BXPC-3及正常胰腺导管上皮细胞株HPDE6c-7中ELMO3 mRNA表达。胰腺癌细胞株PANC-1重组腺病毒转染ELMO3短发卡RNA(shRNA)沉默基因，RT-qPCR检测转染。细胞计数试剂盒(CCK-8)法及平板克隆实验检测PANC-1细胞增殖能力及克隆形成能力，细胞划痕试验及Transwell实验检测细胞体外迁移及侵袭能力。蛋白质印迹法(Western blot)检测PANC-1细胞株中细胞核增殖抗原(Ki-67)、增殖细胞核抗原(PCNA)、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3的表达。采用单因素方差分析，组内比较采用LSD- t检验，组间比较采用配对或成组 χ2检验。 结果:ELMO3在胰腺癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁组织(73.5%比26.5%， χ2＝6.773， P<0.05)，其阳性表达与胰腺癌患者性别、年龄及肿瘤部位无相关( χ性别2＝0.131， χ年龄2＝1.838， χ肿瘤部位2＝0.490， P值均>0.05)，而与胰腺癌TNM分期、分化程度及肿瘤大小明显相关( χTNM分期2＝4.410， χ分化程度2＝11.769， χ肿瘤大小2＝7.762， P值均<0.05)。ELMO3阳性表达的胰腺癌患者中位生存期(MST)明显低于阴性表达者(8.203个月比19.337个月， χ2＝10.253， P<0.05)。3种胰腺癌细胞株中ELMO3表达水平分别为21.33±0.67、17.65±0.31、16.28±0.47，均高于HPDE6c-7细胞株中的2.01±0.10( FPANC-1＝45.069， FSW1990＝22.824， FBXPC-3＝19.477， P值均<0.05)，转染后PANC-1细胞内ELMO3表达量显著下降，细胞增殖能力、克隆形成能力及迁移侵袭能力均明显下降( P值均<0.05)，且Ki-67、PCNA蛋白表达水平显著降低，而Caspase-3表达量却明显增高，差异均有统计学意义( P<0.05)。 结论:ELMO3在胰腺癌中表达上调，其高表达提示胰腺癌患者预后不良。沉默ELMO3可抑制胰腺癌细胞增殖、克隆形成及迁移、侵袭。