端粒解旋酶(telomere-linked helicase,Tlh)在维持端粒长度和基因组稳定性中起关键作用.除其基础作用外,解旋酶还在涉及DNA/RNA代谢的细胞过程中担当重要的角色.本研究通过同源序列比对在灵芝中获得 Tlh 基因,分析发现 Tlh 基因编码 750 个氨基酸,其蛋白含有DEXHC-RecQ、DEAD和HELICc结构域,与担子菌中的Tlh蛋白保守性较高.进一步构建灵芝Tlh沉默菌株(Tlhi-9 和Tlhi-21),检测Tlh在灵芝中的生物学功能.结果显示,与野生型相比,Tlhi-9 和Tlhi-21 菌株菌丝生长减缓,菌落直径分别降低 23%和 24%,生物量分别降低 41%和 43%;相较野生型,Tlhi-9 和Tlhi-21 菌株中CMCase活性分别降低 39%和 43%,而木聚糖酶活性均降低 40%;Tlhi-9和Tlhi-21 菌株中胞内多糖含量较野生型分别降低 38%和 40%;Tlhi-9 和Tlhi-21 菌株中灵芝酸含量较野生型分别降低 51%和 56%.研究结果说明,Tlh基因参与调控灵芝生长、纤维素酶与木聚糖酶活性及次生代谢.

为了充分开发利用灵芝资源,本研究对采自西藏墨脱县的一份野生灵芝子实体标本进行了分离纯化培养,并通过形态学观察和分子生物学分析鉴定为有柄灵芝 Ganoderma gibbosum.将此菌株作为试验菌株,从碳源、氮源、温度、pH这4个因素进行生物学特性研究,从中选择3个较优水平进行正交试验.结果表明,有柄灵芝菌丝生长的最佳碳源为果糖,氮源为酵母,最适温度为25℃,适宜 pH 为 7.0.驯化出芝栽培基质配方选用杂木屑 58%、玉米芯 20%、麦麸 20%、石灰1%、石膏 1%,40 d左右菌丝满袋,覆土一周后出现原基,50 d左右子实体成熟.初步成分分析表明,有柄灵芝粗多糖、氨基酸含量分别为1.5%和10.8%.本试验成功对野生有柄灵芝进行了人工驯化栽培,为有柄灵芝作为新的药用菌进行开发利用提供了参考.

[背景]灵芝被纳入我国"药食同源"试点名单,腺苷作为其主要活性物质之一,在免疫调节、抗炎、抗癌等方面发挥着重要作用.[目的]调控腺苷生物合成关键酶基因的表达来提高灵芝腺苷产量.[方法]将不同培养时间阶段腺苷合成酶基因(包括 5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸甲酰转移酶GlATIC、嘌呤核苷磷酸化酶GlPNP、腺苷激酶GlADK)的表达量与腺苷含量相关联,筛选出与灵芝腺苷含量呈正相关的关键酶基因.克隆关键酶基因并在灵芝中过表达,探究关键酶基因过表达对灵芝腺苷积累的影响.[结果]GlPNP的表达与灵芝腺苷含量呈正相关.GlPNP的cDNA全长为 969 bp,预测GlPNP蛋白的相对分子量为 34.6 kDa,呈三聚体的四元结构.研究结果表明,过表达菌株中GlPNP的表达量在第 4 天比野生型菌株(WT)上调了 2.9-3.9 倍,与含空载体的菌株(CK)相比,腺苷含量分别提高了 78%和 63%.[结论]过表达嘌呤核苷磷酸化酶是提高灵芝腺苷产量的一种有效手段.

目的:分离并鉴定柬埔寨野生灵芝菌株及伴生菌,通过拮抗试验初步评价伴生真菌对灵芝的影响.方法:对64个分离自柬埔寨灵芝的真菌样品进行了ITS序列鉴定,对检出的灵芝菌株与相同子实体中分离到的伴生真菌进行了拮抗试验.结果:检出22株灵芝,占比34.4％,全部鉴定为Ganoderma lingzhi;在非灵芝菌株中最常见的是炭角菌属(Xylaria)及炭团菌属(Hypoxylon),分别占比35.9％及15.6％,另检出灵芝病原真菌1株,鉴定为灵芝腐败木生红曲霉Xylogone ganodermophthora;检出药用真菌1株,鉴定为白囊耙齿菌Irpex lacteus.实验证明灵芝菌株间的拮抗作用更为突出,而灵芝与伴生真菌之间能交织生长,这影响到灵芝的品质.结论:柬埔寨民间习用灵芝的药用特性尚需专业而系统的研究,方可确立为药用灵芝种质与资源的一个新自然分布区与产地;当地炭角菌属真菌以及采后储藏方式是影响柬埔寨灵芝品质或用药道地性的重要因素.

灵芝作为传统中药,具有重要的医药和经济价值.本研究以一株野生灵芝属真菌BSU01为实验材料,通过形态特征和ITS序列聚类分析对其进行了鉴定,探讨了该菌株菌丝生长的最适碳源、氮源、C/N、pH及温度等生物学特征,以及该菌株产木质纤维降解素酶的能力.结果 表明,菌株BSU01的形态特征与有柄灵芝相符;且与有柄灵芝ITS序列一致性达99％,并在系统发育树上聚在一起;菌株BSU01菌丝生长最适碳源为果糖或者葡萄糖,氮源为酵母提取物,C/N比为20/1到30/1,温度为30℃,pH值为5.5;菌株BSU01的漆酶、木质素过氧化物酶和Mn依赖过氧化物酶分别为12.13 U/L、0.52 U/L和0.33 U/L;CMCase和木聚糖酶酶活分别为7.14 U/mL和1.88 U/mE.本研究结果将为该菌的进一步开发利用提供数据参考.

AreA作为丝状真菌氮代谢中的关键转录因子,在真菌响应外界氮源、生长发育、次级代谢及抗逆过程中发挥了重要作用.本研究通过生物信息学比对分析,获得了灵芝AreA的全长序列,研究了AreA对菌丝生长、抵御细胞壁胁迫以及次级代谢的影响,AreA编码蛋白的C末端含有保守的GATA型锌指结构域,与其他担子菌中AreA的亲缘关系较近.通过qRT-PCR分析发现,外界氮源浓度的变化能够影响AreA的转录水平.在低氮源浓度条件下,AreA的转录水平显著高于氮源丰富的条件.利用前期构建的AreA沉默转化子研究发现,沉默AreA后菌株生长速率显著低于野生菌株,约下降70％;且AreA沉默菌株菌丝比野生菌株蓬松.细胞壁的组成成分检测发现,AreA沉默菌株的葡聚糖和几丁质含量比野生菌株(WT)和转入空载沉默质粒的菌株(CK)分别下降约65％和40％-60％.随后检测了对细胞壁胁迫的耐受性,结果发现AreA沉默转化子对刚果红和SDS极为敏感,几乎不能生长.在AreA沉默菌株中,灵芝三萜的含量相比于对照菌株下降了约23％.研究结果表明灵芝AreA能够响应环境中的氮源浓度,并且在灵芝的生长发育、次级代谢以及抵御细胞壁胁迫中发挥了重要作用.

灵芝多糖是灵芝的主要生物活性成分之一,具有多种药理活性,但灵芝多糖的低产量限制了其广泛应用.相关研究表明,灵芝中过表达多糖生物合成相关基因能够提高多糖产量,但过表达GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶(GMP)基因提高灵芝多糖产量未有报道.本研究克隆获得了灵芝gmp基因,并成功构建出了过表达gmp基因的工程菌株(GMP菌株),同时对野生型菌株(WT)和GMP菌株的胞内多糖(IPS)、胞外多糖(EPS)产量以及GDP-甘露糖合成相关基因甘露糖磷酸变位酶1(PMM1)基因及甘露糖磷酸变位酶2 (PMM2)基因的表达水平进行了检测.研究结果表明,在悬浮发酵培养条件下,灵芝中gmp基因的过表达增加了灵芝多糖的积累.与WT菌株相比,GMP菌株的EPS以及IPS的含量最高达到了0.991g/L和21.59mg/100mg干重,比WT菌株分别提高了21.1％和19.5％.gmp基因的过表达也提高了基因pmm1和pmm2的表达.与WT菌株相比,GMP菌株中pmm1以及pmm2基因的表达水平分别上调了2.87倍和2.55倍.研究结果表明,过表达gmp基因是一种提高灵芝多糖产量的有效方法,并且过表达gmp基因提高了灵芝多糖的合成及pmm1和pmm2基因的表达.

为探究不同野生灵芝的主要活性成分以及对野生灵芝的开发利用价值,对13种野生灵芝菌株在同一条件下进行液体发酵,采用化学分析的方法,比较菌丝体胞内三萜和多糖的含量差异.结果显示,13种灵芝菌株的三萜和多糖含量有很大差异,其中无柄紫灵芝Ganoderma mastoporum、亮盖灵芝G.lucidum和树舌灵芝G.applanatum的三萜含量较高;树舌灵芝G.applanatum、紫芝G.sinense和褐灵芝G.brownii的多糖含量较高.目前国内广泛栽培灵芝G.lingzhi的野生菌株发酵产物中的三萜和多糖含量并不是最高的,研究结果表明不同种类的野生灵芝还有进一步挖掘的潜在价值.

灵芝是我国一类传统药用真菌的统称,具有极高的药用价值和经济价值.为了充分保护和利用该类野生药用真菌资源,本研究对采自广西壮族自治区南宁市的一株野生灵芝进行了菌株分离纯化培养,通过基于内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列的分子生物学分析鉴定为四川灵芝Ganoderma sichuanense.以此为实验菌株,对该种的生物学特性和抗氧化活性进行了研究.探索了不同碳源、氮源、无机盐、pH、温度在固体培养条件下对野生四川灵芝菌丝生长速度的影响.对上述5因子进行单因子试验,从中筛选出4因子再进行正交试验.在试验范围内野生四川灵芝菌丝生长的最佳碳源为麦芽糖,氮源为牛肉膏,无机盐为KH2PO4,最适pH 7.0,温度30℃.通过正交试验进一步优化,得到最佳因子组合为麦芽糖30.0 g/L、牛肉膏5.0 g/L、KH2PO41.0 g/L、pH6.0.针对液体培养过程中的多糖、三萜、多酚、抗坏血酸含量、超氧化物歧化酶活性及羟自由基清除能力变化进行了测定,发现该野生四川灵芝具有一定的抗氧化活性.

灵芝是我国著名的药用真菌,具有抗癌、抗肿瘤等功效.灵芝酸属于三萜类化合物,是灵芝的主要活性成分,并已成为评价灵芝品质的重要指标之一.β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,BG)是次生代谢产物合成途径中的关键限速酶,能够调节次生代谢产物的生物合成.本研究通过同源序列比对,注释获得了灵芝β-葡萄糖苷酶基因(GlBG),并通过RNAi技术对灵芝β-葡萄糖苷酶进行功能分析.序列分析结果显示GlBG基因的DNA全长为2 759bp,包含7个外显子和6个内含子,编码793个氨基酸,其编码的蛋白序列中含有β-糖苷水解酶的2个保守结构域.灵芝β-葡萄糖苷酶基因的沉默转化子中灵芝酸含量比野生型菌株的灵芝酸含量平均降低了 38％,并且灵芝酸生物合成途径中的关键酶基因(hmgs、hmgr、fps、sqs和osc)的表达量也显著下降,实验结果表明灵芝β-葡萄糖苷酶在灵芝酸生物合成过程中具有重要作用,并为灵芝次生代谢途径及其调控机制提供了参考.