为了明确不同盐度对Halomonas campaniensis XH26合成羟基四氢嘧啶(5-hydroxyectoine,5-HE)代谢通路和基础代谢的影响,研究采用无NaCl作为对照组,以12％、14％和16％NaCl浓度梯度作为高盐组.利用转录组测序和液质联用技术(LC-MS)分析了H.campaniensis XH26在不同NaCl浓度条件下的差异表达基因和差异代谢物,并利用qPCR对与Ectoine和5-HE合成密切相关的差异基因的表达量进行了相对定量分析验证.结果显示,5-HE合成量在高盐组间随盐梯度先增加后降低,并在14％NaCl浓度时达到最高.转录组结果显示,在186个KEGG代谢通路中,差异表达基因在ABC转运蛋白、双组分系统、鞭毛组装等通路中高度富集.筛选到与5-HE合成代谢相关的7个关键基因表达存在差异,包括lysC、ectA、ectB、ectC、ectD、doeC和doeD.qPCR验证结果与转录组学分析结果基本一致.代谢组分析共发现了 1159个差异代谢物,主要富集在氨基酸代谢、辅因子-维生素代谢和碳水化合物等代谢通路.研究还筛选出了显著差异的相容性溶质,包括四氢嘧啶、羟基四氢嘧啶和甜菜碱.研究分析了菌株H.campaniensis XH26的耐盐特性及盐适应机制,初步明确了5-HE产量及合成基因簇表达随盐度变化的规律,为高产5-HE的野生菌的优化和基因工程菌的构建提供了理论基础.

为挖掘盐单胞菌盐胁迫过程中存在的相关新型未知基因,并明确其功能,以野生菌株Halomonas campani-ensis strain XH26为研究对象,通过盐梯度转录组学数据筛选出上调表达的新型基因orf03282(300 bp),利用生物信息学工具进行基因序列、蛋白理化性质、跨膜结构域和二级结构等分析.通过克隆目的基因和构建异源表达载体,探究相关功能.结果表明:随盐度增加,基因orf03282的表达量呈上调表达趋势.在盐单胞菌属中,orf03282的基因序列进化保守,与菌株H.campaniensis LS21和H.alkaliphila X3的相似性最高,分别为99.67％和99.33％.预测蛋白Orf03282为不稳定的疏水性单次跨膜蛋白,定位于细胞外膜.蛋白Orf03282能在菌株E.coil BL21体内实现异源表达,可提高E.coil BL21胞内的Ca2+含量和增强菌株的盐耐受性.推测蛋白Orf03282的生理功能可能与Ca2+离子转运相关,通过增加胞内Ca2+浓度提高细胞的耐盐能力.

[背景]大肠杆菌通过C5 途径合成卟啉及血红素,5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,5-ALA)是C5 途径中关键的前体物质,血红素由原卟啉IX(protoporphyrin IX,PPIX)螯合一个铁离子所形成,目前 5-ALA与 PPIX的外泌对卟啉的积累和血红素合成的影响尚不清楚.[目的]构建 5-ALA外泌蛋白基因 rhtA和卟啉外泌蛋白基因 tolC双缺失的大肠杆菌以积累卟啉,同时外源添加铁离子,并过表达亚铁螯合酶基因 hemH 及参与铁摄取的基因 efeB,促进卟啉向血红素的转化.[方法]通过Red同源重组敲除大肠杆菌BL21(DE3)的rhtA和tolC,并外源添加不同浓度的FeSO4 及Fe2(SO4)3,同时构建重组质粒pEHE过表达hemH和efeB,检测卟啉和血红素含量,分析卟啉向血红素的转化.[结果]敲除rhtA和tolC对菌体生长无显著影响,与野生菌WT相比,敲除菌株WT-RT的卟啉含量增加,血红素合成略有提升.外源添加 100 μmol/L Fe2+时,菌株WT-RT的血红素含量最高为 29.44 μmol/g-DCW.外源添加 25 μmol/L的Fe3+时,菌株WT-RT的血红素含量达到了 38.22 μmol/g-DCW,是野生菌WT的 1.78 倍.过表达efeB的菌株RT-pEE血红素含量显著下降,而共表达hemH和efeB的菌株RT-pEHE的血红素含量相较于菌株RT-pEE显著提高.[结论]tolC和rhtA的缺失导致卟啉的积累,适量添加Fe2+和Fe3+、共表达hemH和efeB可促进PPIX向血红素的转化.该结果为利用重组大肠杆菌生产血红素提供了新策略.

由于野生菌味道鲜美,营养丰富,逐渐走上人们餐桌.但野生菌种类丰富,食用菌与毒菌外形极其相似,导致我国每年都有误食毒菌中毒的事件发生,误食毒菌成为我国食物中毒事件中导致死亡的最主要原因.本文查阅国内外关于野生菌中毒相关文献并对其进行归纳梳理,从野生菌中毒现况及流行病学特点、野生菌相关知识知晓现况、对野生菌的态度及行为等方面进行综述,为减少野生菌中毒、科学防控等工作提供科学依据.

目的 建立超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱法(ultra performance liquid chromatography-mass spectrometer detector quadrupole time of flight,UPLC-Q-TOF)定性定量检测毒蘑菇中鹅膏肽类毒素的分析方法.方法 样品加入甲醇后均质,超声离心提取,待测液采用ACQUITY UPLC? HSS T3 1.8 μm色谱柱(2.1×50 mm)进行分离,以0.1％氨水溶液-甲醇为流动相进行梯度洗脱 0 min,2％B;0～0.5 min,2％B;0.5～6.0 min,95％B;6.0～7.0 min,95％B;7.0～8.0 min,2％B,流速0.3 mL/min,柱温40℃,进样量2.0 μL.采用超高效液相色谱四级杆飞行时间质谱仪对毒蘑菇进行分离、鉴定鹅膏菌中的毒素成分.结果 毒蘑菇样品中1、2、3、5、6、7、8号样品均未检出鹅膏肽类毒素;4号样品共检出6种组分,经鉴定为已知的鹅膏肽类毒素,分别是α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽和二羟鹅膏毒肽酰胺.进一步建立鹅膏肽类毒素快速定量方法,5种鹅膏肽类毒素在25～1 000μg/L范围内呈现良好的线性关系,相关系数为0.991 2～0.998 9,平均加标回收率为89.5％～110.5％,相对标准偏差为3.80％～7.80％.其中α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽的含量分别是(19.701±0.175)、(0.098±0.014)、(1.548±0.001)、(0.331±0.002)及(0.108± 0.060)mg/kg,二羟鹅膏毒肽酰胺与羧基二羟鬼笔毒肽相对含量为0.754 mg/kg.结论 该方法用于测定毒蘑菇中多种鹅膏肽类毒素,方法简单、快速、可靠,为进食毒蘑菇突发中毒患者的快速临床诊断和及时治疗提供了有效的科学依据.

为寻找新型的与纤维素酶相关转录调控因子,以嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila ATCC42464)为研究材料,通过克隆嗜热毁丝霉mhr2基因序列,构建重组过表达载体,转化并筛选到转化子MtO24中mhr2基因表达量比野生型菌株高204倍.蛋白浓度及酶活测定的结果显示,诱导培养72 h,转化子胞外蛋白浓度和滤纸酶活分别是野生菌的1.58和1.30倍;非诱导培养144 h,转化子胞外蛋白浓度和滤纸酶活分别是野生菌的1.87和1.49倍.实时荧光定量PCR的结果表明,转化子中主要纤维素酶基因egl1、egl3和cbh1、cbh2的表达量均有显著提高.研究初步证实了mhr2基因具有调控纤维素酶基因表达的功能.

1 病例资料患者女,24岁,G2P0+1,双胎妊娠,末次月经2017-05 -01,定期产前检查无异常.2017年11月7日12:00自食野外采摘蘑菇(具体类别不详),约30 g.半小时后出现全身乏力,针刺样疼痛.1 h后出现恶心、呕吐,呕吐物为胃内容物,伴洗肉水样血尿、腹痛.腹痛程度中等,表现为下腹部.无瘀斑、瘀点,无畏寒、发热,无尿痛、尿急,二便失禁、黑便、腹泻等.于21:30转诊至某中心医院,查体:T 38.2 ℃, P 80次/min,R 20次/min,BP 107/67 mmHg,神智清晰,急性病容,贫血貌,口唇及指端欠红润.心肺未见异常.腹部膨隆,腹软,无压痛,宫底脐上3指,可扪及腹壁宫缩,胎心音未闻及.

目的:热带假丝酵母以油脂为底物发酵时会产生副产物甘油,研究对热带假丝酵母gk基因进行过表达,将副产物甘油转化为能量,提高油脂转化利用效率.方法:以热带假丝酵母Candida tropicalis 1798中的甘油激酶(gk)为研究对象,利用PCR技术获得同源臂基因gkpR,通过一步法无缝克隆将同源臂和G418抗性基因(kan')连接至pPICzαA载体,同时将解脂假丝酵母Candidalipolytica 1457中的启动子基因pGAP无缝连接至载体中的gkpR,构成质粒pPICzαA-gkp,并电转化至C.tropicalis 1798感受态细胞中,通过一次同源单交换,将启动子pGK替换为pGAP.结果:经过G418抗性筛选和PCR鉴定,成功获得pGAP基因替换菌株C.tropicalis 1798-gkPr;发酵验证结果显示,启动子基因替换C.tropicalis 1798在以甘油为底物培养时重组菌OD600值比野生型菌株高46.4％,重组菌培养基中甘油剩余量比野生菌降低56.1％,表明启动子替换能促进C.tropicalis 1798对甘油的吸收利用.此外,以油脂为底物进行发酵实验时还发现重组菌产长链二元酸的量比野生菌提高32.7％.结论:通过启动子替换手段构建的重组菌C.tropicalis 1798-gkPr,提高了热带假丝酵母对油脂组分中甘油成分的利用效率.

目的:通过Tn5转座诱变筛选食甲基杆菌J1-1吡咯喹啉醌(PQQ)生物合成相关基因.方法:构建食甲基杆菌J1-1 Tn5转座突变体库,筛选PQQ合成水平差异明显的突变株,利用质粒拯救法鉴定突变基因,通过基因敲除、回补及过表达进一步研究该基因与PQQ合成的关系.结果:构建了j1-1的Tn5转座突变体库,筛选得到一株PQQ合成水平显著下降的突变株,经鉴定Tn5插入位点为mpq0056基因,该突变株在以甲醇为惟一碳源的培养基中生长速度略慢;敲除J1-1中mpq0056基因后,PQQ的合成水平下降,与Tn5诱变结果一致;回补该基因后,PQQ产量恢复到野生菌水平.结论:mpq0056基因参与了PQQ的生物合成,该基因可能编码分支酸盐裂合酶,并在PQQ生物合成中起重要作用.

目的 研究铜绿假单胞菌野生菌株PAO1和单、双突变菌株(PA-△lasI、PA-△rhlI、PA-△lasI/rhlI)诱导巨噬细胞产生抗菌肽LL-37的作用及影响.方法 采用免疫磁珠法分选人外周血CD14 +单核细胞,经重组人粒-单核细胞集落刺激因子诱导分化为巨噬细胞,以不同浓度的PAO1、PA-△lasI、PA-△rhlI、PA-△lasI/rhlI处理巨噬细胞,ELISA法检测不同作用时间下巨噬细胞产生LL-37的浓度.结果 ELISA显示不同浓度PAO1、PA-△lasI、PA-△rhlI、PA-△lasI/rhlI诱导巨噬细胞在12 h开始分泌抗菌肽,呈诱导性表达,24 h或48 h达高峰,72 h下降逐渐消失,呈现剂量-时间依赖性,以PA-△lasI/rhlI∶ 巨噬细胞=100∶ 1时LL-37最高,达到(1.631 2±0.277 0)ng/mL.结论 抗菌肽LL-37呈诱导性表达,具有时间依赖性和浓度依赖性.双突变菌株更利于巨噬细胞产生LL-37,逃逸宿主免疫防御,进而影响机体免疫系统对铜绿假单胞菌的清除作用.