目的:热带假丝酵母以油脂为底物发酵时会产生副产物甘油,研究对热带假丝酵母gk基因进行过表达,将副产物甘油转化为能量,提高油脂转化利用效率.方法:以热带假丝酵母Candida tropicalis 1798中的甘油激酶(gk)为研究对象,利用PCR技术获得同源臂基因gkpR,通过一步法无缝克隆将同源臂和G418抗性基因(kan')连接至pPICzαA载体,同时将解脂假丝酵母Candidalipolytica 1457中的启动子基因pGAP无缝连接至载体中的gkpR,构成质粒pPICzαA-gkp,并电转化至C.tropicalis 1798感受态细胞中,通过一次同源单交换,将启动子pGK替换为pGAP.结果:经过G418抗性筛选和PCR鉴定,成功获得pGAP基因替换菌株C.tropicalis 1798-gkPr;发酵验证结果显示,启动子基因替换C.tropicalis 1798在以甘油为底物培养时重组菌OD600值比野生型菌株高46.4％,重组菌培养基中甘油剩余量比野生菌降低56.1％,表明启动子替换能促进C.tropicalis 1798对甘油的吸收利用.此外,以油脂为底物进行发酵实验时还发现重组菌产长链二元酸的量比野生菌提高32.7％.结论:通过启动子替换手段构建的重组菌C.tropicalis 1798-gkPr,提高了热带假丝酵母对油脂组分中甘油成分的利用效率.

巴斯德毕赤酵母是用途广泛的蛋白表达系统.目前用于毕赤酵母的质粒主要以整合型质粒为主,很少见到游离的质粒用于外源基因的表达.文中通过将来源于酵母自身的自主复制序列连接到酵母整合型表达载体pGAP中构成自主复制的游离型表达载体pGAPZαA-PARS,将该载体用于表达木聚糖酶基因.转化毕赤酵母后同传统的整合型表达菌株相比,以甘油为碳源时最高酶活达到343 U/mL,比整合型表达提高了45.9％.同时游离载体表达重组酶比活相对整合表达提高了81.2％.为了节约发酵成本,进一步研究了分别以甘油、葡萄糖、蔗糖、混合碳源(蔗糖∶甘油=1∶2)等不同碳源下游离型重组菌株的表达水平.发现甘油表达水平最高,蔗糖最低,但是以工业葡萄糖为碳源时产酶成本最低.由于pGAP载体不需要以甲醇为碳源,因而文中所构建的游离载体pGAPZαA-PARS极大促进了毕赤酵母在食品行业中的应用.同时,游离型载体可大幅度提高表达水平,为进一步研究提高GAP启动子的高效表达奠定了基础.

人体中150余种蛋白通过糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定于细胞膜上发挥功能,从GPI锚的合成、与蛋白结合到定位于细胞膜上发挥作用,这一系列过程受一大类基因调控,包括PIG基因,如PIGA、PIGB、PIGC等及PGAP基因,如PGAP1、PGAP2等.近年来,国外对PIG/PGAP基因变异所致疾病的报道逐渐增多,但国内罕见报道.现就PIG/PGAP基因相关疾病的遗传方式、临床特点、治疗及基因型-表型相关性的研究进展进行综述.

目的 描述枯草芽孢杆菌CGMCC 12426的微生物特征,对其进行全基因组测序和注释.方法 枯草芽孢杆菌菌株CGMCC 12426基因组DNA测序由太平洋生物技术公司的RSⅡ测序仪基于单分子实时测序(SMRT)技术平台完成,其注释是在NCBI原核基因组注释管道(pGAP)完成.结果 已发布的枯草芽孢杆菌CGMCC 12426的完整基因组序列是由1个环形的4138265 bp的染色体与1个74165 bp的质粒组成,最终预测得到的4581个基因包括4222个编码序列、87个tRNA和30个rRNA(5S rRNA、16S rRNA和23S rRNA)序列.结论 为进一步阐明该菌株的遗传背景提供了基础,也为研究代谢和调控机制提供了重要机会.

目的 利用生物信息学分析转移性胃癌和原位胃癌的在分子水平的差异,揭示转移性胃癌进展机制,为精准诊疗和预后评估提供潜在的分子靶点.方法 从TCGA公共数据库获取胃癌患者RNA-Seq及DNA甲基化芯片数据,筛选转移性胃癌和原位胃癌在两个组学维度的一致性差异基因,评估其功能及富集通路并进行风险回归分析.结果 筛选出一致性差异基因170个,转移组上调基因52个、下调基因118个.功能分析提示免疫调节、细胞分化、外源信号感应、自噬与溶酶体转运、药物及蛋白代谢等信号通路与转移性胃癌发生有关.针对上述基因进行预后风险评估,发现RTP3、GTF3C5、TMEM102、NHLRC3、FUT2、PGAP2、AAMP是与转移风险相关的7个关键基因,其联合表达信号可用于胃癌患者的预后评估.结论 由7个关键基因组成的联合因子可为胃癌预后评估提供依据,是临床检测的潜在生物学标记物.

基于毕赤酵母核糖体DNA序列(rDNA),构建多拷贝谷氨酰胺转胺酶基因表达载体pPICZa-rDNA-mtg,并转化到表达前导肽(Pro peptide或pro)的宿主菌pGAP9-pro/GS 115,得到共表达菌株pro/rDNA-mtg(GS115).实时荧光定量PCR (qPCR)分析了4株阳性表达菌株中mtg基因拷贝数,进一步研究了不同基因拷贝数对重组毕赤酵母产酶的影响及高产菌株在3L发酵罐高密度发酵.结果 表明,被检测的4株阳性表达菌株中mtg拷贝数分别为2.21、3.36、5.72和7.62 (mtg-2c、mtg-3c、mtg-6c和mtg-8c),其发酵产酶能力和蛋白质表达水平为mtg-3c＞mtg-2c＞mtg-6c＞mtg-8c;高密度发酵较低和较高拷贝数的两株菌mtg-3c和mtg-6c,发酵上清的最高酶活和单位菌体酶活分别为3.12 U/mL、52.1 U/g湿重和2.07 U/mL、36.5 U/g湿重,其中单位菌体酶活mtg-3c是mtg-6c的1.4倍;mtg-3c纯化酶的最高酶活达到7.21 U/mL,蛋白浓度为437.2 μg/mL.通过分析拷贝数对重组毕赤酵母产酶的影响,发现mtg-3c适合pro/rDNA-mtg中pro和mtg共表达,MTG高酶活与菌株较高分泌蛋白有关.

传统的酶联免疫分析包括两次分子杂交,在临床检测等实际应用过程中耗时较长,增加了操作人员的劳动强度.通过基因工程构建一抗(单克隆抗体)和标记酶如辣根过氧化物酶(HRP)的融合蛋白,变两次分子杂交为一次分子杂交,即可大大缩短酶联免疫分析的时长.本研究以人胰岛素单链抗体(single chain variable fragment,scFv)基因和辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)基因为模板,依据酵母密码子偏好性进行密码子优化、稀有密码子剔除、转录终止子类似结构消除等设计,合成了编码scFv-HRP重组融合蛋白的基因.该基因分别克隆至大肠杆菌表达载体pET28a与酵母遗传转化载体pGAPZαA.pET-scFv-HRP在E.coli BL21(DE3)中表达时(1 mmol/L IPTG,30℃,诱导2 h),其产率可达总蛋白的4.6％;在E.coli Rosette (DE3)中表达时(1 mmol/L IPTG,30℃,诱导2 h),未出现可见的诱导表达蛋白带.pGAP-scFv-HRP线性化后转化P.pastoris GS115,获得了12个阳性菌落.其中3株(4号,7号和8号)含有较高重组基因拷贝(依据博来霉素测试).4号转基因酵母菌株摇瓶发酵后,对发酵液和细胞破碎后的上清液进行SDS-PAGE分析,在scFv-HRP理论分子量(63 kD)条带附近有明显的蛋白质条带出现.以抗纯化标签(6×His)抗体进行免疫印迹检测,该位置蛋白条带显示阳性.切下该位置蛋白条带后进一步进行串联质谱分析,结果表明该位置的蛋白条带含有重组蛋白scFv-HRP的片段且氨基酸残基序列一致.重组人胰岛素单链抗体和辣根过氧化物酶融合蛋白scFv-HRP的构建为后续建立胰岛素快速检测方法提供了重要材料基础.

目的:检测不同病理分级膀胱癌患者组织PGAP2表达水平,并探讨其表达水平与膀胱癌病理分级及分子生物学关系.方法:选取2011年8月-2015年4月于开滦总医院林西医院住院的78例膀胱癌患者肿瘤组织作为肿瘤组,膀胱癌患者均为尿路上皮癌,组织学分级按照WHO分级标准:Ⅰ级24例、Ⅱ级29例、Ⅲ级25例;根据膀胱癌患者肿瘤组织PGAP2 mRNA水平平均值,将患者分为PGAP2高表达组(n=39)和PGAP2低表达组(n=39);根据患者出院后5年内是否出现复发或因膀胱癌死亡,将患者分为预后良好46例和预后不良32例.选取膀胱癌患者相应癌旁正常组织作为正常组.采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测膀胱癌肿瘤组织及癌旁正常组织PGAP2 mRNA水平;Ualcan数据库检索验证PGAP2在正常膀胱组织及膀胱癌肿瘤组织中的表达;分析肿瘤组织PGAP2 mRNA水平与膀胱癌患者病理分级等临床病理特征的关系;多因素Cox回归分析影响膀胱癌预后的因素.结果:肿瘤组PGAP2 mRNA水平高于正常组,差异有统计学意义(P＜0.05),与Ual-can数据库结果一致;PGAP2高表达组肿瘤多发、组织浸润深度为肌层浸润性膀胱癌、预后不良的患者比例均高于PGAP2低表达组,差异有统计学意义(P＜0.05);肿瘤组织PGAP2表达水平与膀胱癌病理组织学分级有关,差异有统计学意义(P＜0.05);病理分级、PGAP2是影响膀胱癌预后的独立危险因素(P＜0.05).结论:膀胱癌患者肿瘤组织PGAP2表达水平与病理分级等临床病理特征密切相关,且是影响膀胱癌预后的独立危险因素,可对膀胱癌的病情评价及治疗提供一定理论依据.

[背景]一直以来,链霉菌都是活性物质的主要生产者,近年来随着抗生素滥用引起的环境和微生物抗药性问题越发严重,挖掘高效生物防治因子和新型抗生素成为了解决以上问题的重要手段.[目的]通过获得植物内生链霉菌SAT1全基因组序列和次级代谢基因簇信息,利用比较基因组学和泛基因组学分析SAT1菌株的特殊性以及与其他链霉菌的共性,为阐明SAT1抑菌和内生机制提供理论基础,为揭示链霉菌的生态功能提供可靠数据.[方法]通过三代测序平台PacBio Sequel完成SAT1基因组测序,利用生物信息学技术进行注释和功能基因分类;分别利用RAxML和PGAP软件进行系统发育树的构建和泛基因组分析;次级代谢基因簇的预测和分析通过antiSMASH网站完成.[结果]获得SAT1菌株的全基因组完成图,该菌线性染色体长度约7.47 Mb,包含有4个质粒,GC含量近73％,共预测到7550个蛋白编码基因,含有37个次级代谢基因簇,分属29个类型,其中默诺霉素基因簇与加纳链霉菌具有较高相似性.42株代表链霉菌中,单个菌株次级代谢基因簇数量为20-55个,主要类型为PKS类、Terpene类和Nrps类,而且含有大量杂合基因簇,各个菌株中特有基因数目较为庞大.[结论]链霉菌SAT1菌株在基因组特点以及次级代谢基因簇的数量和类型上与其余41株链霉菌具有一定的共性,其中潮霉素B基因簇和默诺霉素基因簇合成的相关物质可能与SAT1抑菌活性密切相关.42株链霉菌中次级代谢基因簇数量的多少与基因组大小成正相关,同时大量杂合基因簇以及庞大的特有基因数目的存在说明链霉菌在长期进化过程中存在了很高程度的水平基因转移现象,可能具有重要的生态功能.

血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF 165)是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子,高纯度的VEGF165对于抗肿瘤药物和生物标志物研发检测试剂必不可少.目前关于VEGF165的异源表达方法,纯化步骤多且产物纯度不高.以毕赤酵母表达系统为基础,构建人血管内皮生长因子(VEGF165)多拷贝的表达载体.按照酵母密码子偏好性优化人血管内皮生长因子基因(vegf165)的密码子,在毕赤酵母BBPB表达载体基础上,用Biobrick生物积块的方法,构建以Pgap为启动子的五拷贝rhVEGF 165表达载体,同时添加组氨酸标签.利用His标签和VEGF165自身的肝素结合结构域,仅用两步亲和层析纯化得到纯度高于98％的rhVEGF 165蛋白.rhVEGF165纯化后浓度为0.45 mg/mL,且具有生物学活性.该异源表达策略简化了rhVEGF165的纯化步骤,rhVEGF 165具有天然VEGF165的生物学活性,且纯度达到目前文献报道的最高水平.