目的:建立药用蛇及其水提物的DNA微型条形码鉴别方法.方法:通过比对药用蛇及常见11种混伪品的16S rRNA序列,建立约220 bp的蛇类DNA微型条形码,并与16S rRNA标准条形码比较,对药用蛇原料及水提物进行测序鉴定.采用MEGA-X软件分析遗传距离并以邻接法(NJ)构建系统发育树.结果:DNA微型条形码引物对药用蛇原料及水提物的扩增率为100％,鉴定率为100％.药用蛇及其混伪品的种内平均遗传距离均小于种间平均遗传距离,且各物种在NJ系统发育树中具有良好的单系性,并与16S rRNA标准条形码原料的鉴定结果一致.结论:该研究建立的蛇类DNA微型条形码可有效实现药用蛇原料及水提物等制品的物种鉴别,为保障蛇类原料、临床汤剂及配方颗粒等药品的安全性和有效性提供了技术支撑.

目的:优化金钱白花蛇碱溶性蛋白质(bm ASP)的提取工艺,并对其进行SDS-PAGE、HPLC、FTIR表征.方法:在单因素试验基础上,以提取pH、料液比、提取时间和提取温度为自变量,bm ASP提取率为因变量,基于Box-Behnken组合设计对提取工艺进行响应面优化,对提取产物进行HPLC、FTIR、SDS-PAGE分析.结果:最佳提取工艺条件为:提取pH 8.0,料液比 1∶40(g/mL),提取时间 5.0 h,提取温度 45℃,bm ASP提取率为 5.96%.HPLC结果表明bm ASP的保留时间为2.998、4.745、4.977、5.672 min;FTIR结果表明bm ASP在3 551.45、3 575.95、3 413.06 cm-1 等处有特征吸收峰;SDS-PAGE指纹图谱结果表明bm ASP 分子量介于 18.4～116 kDa,其中 18.4～19.5 kDa、23.38～25.11 kDa、32.53～38.64 kDa、58.62～65.96 kDa的蛋白质含量丰富.结论:bm ASP提取工艺的响应面模型可靠有效,结果稳定,可为金钱白花蛇药效物质基础的研究、资源开发利用及真伪鉴定提供实验依据.

金钱白花蛇是中医临床应用的贵细动物类药材,现代文献一般认为其始载于民国时期(1936 年)出版的广东地方炮制专书《饮片新参》.该文通过查阅历代典籍、地方志,并结合历版《中国药典》、各地炮制规范及现代科学研究报道,对金钱白花蛇的名称、地理分布、形态特征、生态习性、毒性及药用部位等进行系统的考证,结果表明光绪二十年(1894 年)已有金钱白花蛇的药用记载,民国十九年(1930 年)更将其用于安脑丸组方中.其基原动物银环蛇在明代正德年间(1521 年)始有记载,多称为簸箕甲.其形态特征、生态习性、毒性古今记载一致,地理分布与现代动物志等文献记载基本相似.应用幼蛇干燥体作为药用部位,并无本草及现代科学明确依据.事实上,关于幼蛇与成蛇的药效物质基础、药理药效及临床应用是否存在显著差异,尚无定论,有待进一步深入研究.该考证结果厘清了金钱白花蛇的药用历史及现状,由此建议开展银环蛇幼蛇及成蛇的系统比较研究,为金钱白花蛇药用部位的修订提供科学依据.

目的:利用DNA条形码线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因鉴别蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇及其混伪品共 32 种蛇类.方法:收集蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇及其混伪品,对样品DNA进行聚合酶链式反应(PCR)扩增,扩增产物电泳后进行双向测序.应用CodonCodeAligner 11.0.1 软件对峰图质量进行比对、拼接,利用MEGA 11.0 软件对各物种碱基进行分析,构建邻接(NJ)系统聚类树并计算遗传距离.结果:NJ系统聚类树显示,蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇及其混伪品共 32种均独立聚为一支,眼镜蛇科与蝰科聚为一支,并与游蛇科并列聚类.游蛇科黄环林蛇、颈棱蛇与眼镜蛇科聚为一支,游蛇科赤链华游蛇、环纹华游蛇、草腹链蛇与蝰科聚为一支,锦蛇属玉斑锦蛇、黑眉锦蛇、百花锦蛇未聚为一支.结论:利用DNA条形码COⅠ基因能够准确鉴定蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇及其混伪品共 32种蛇类,赤链华游蛇、环纹华游蛇、草腹链蛇、黄环林蛇、颈棱蛇、玉斑锦蛇、百花锦蛇、黑眉锦蛇、宽吻水蛇、铅色水蛇、中国沼蛇、渔游蛇的种属归类有待进一步研究.

目的:研究金草消毒颗粒(JCG,由肿节风、金钱草、白花蛇舌草、大青叶组成)对D-氨基半乳糖(D-GalN)/脂多糖(LPS)所致小鼠肝损伤的保护作用及机制.方法:JCG(1.7,3.4,6.8 g·kg-1)连续给药10 d后,采用腹腔注射给予D-GalN(700 mg·kg-1)和LPS(10 μg·kg-1)建立小鼠肝损伤模型.记录8h小鼠存活率,生化检测小鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT),天门冬氨酸氨基转移酶(AST),总胆红素(TBIL),尿素氮(BUN),肌酐(CREA),免疫球蛋白G(IgG),免疫球蛋白M(IgM)水平,酶联免疫吸附法(ELISA)检测白细胞介素-1β(IL-1β),白细胞介素6(IL-6),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测肝组织一氧化氮合酶(iNOS),环氧合酶-2(COX-2),磷酸化型核转录因子-κB p65(p-NF-κBp65)的表达,采用苏木素-伊红(HE)染色观察肝组织的病理变化.结果:与模型组比较,金草消毒颗粒可提高小鼠存活率,降低血清ALT,AST,TBIL,BUN,CREA,IL-1β,IL-6,TNF-oα水平(P ＜0.05,P＜0.01),显著升高IgG,IgM水平(P ＜0.05,P＜0.01),下调肝组织iNOS,COX-2,p-NF-κB p65表达(P ＜0.05,P＜0.01),肝组织病理性损伤明显减轻.结论:金草消毒颗粒有很好的护肝作用,其机制可能是通过改善肝肾功能,减少促炎症因子水平,增强机体免疫功能,抑制肝组织iNOS,COX-2,p-NF-κB p65细胞因子的表达水平,达到保护肝细胞作用.

目的:建立基于DNA条形码技术的毒性药材金钱白花蛇药源调查方法,调查市售金钱白花蛇的药源构成.方法:建立金钱白花蛇正品及其主要混伪品的参考细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ (Co Ⅰ)条形码库,收集51份市售金钱白花蛇样品,分别获取每份样品头部和尾部的Co Ⅰ序列,通过构建邻接系统发育树进行物种鉴定.结果:共获得60条金钱白花蛇正品及其主要混伪品的Co Ⅰ条形码,银环蛇种内最大遗传距离0.020 1,与金环蛇、赤链蛇和赤链华游蛇的种间最小遗传距离分别为0.156 1,0.208 8和0.209 3,种内最大变异小于种间最小变异;金钱白花蛇正品及其混伪品在邻接系统发育树上聚为独立的支,金钱白花蛇正品及其混伪品在系统发育树上可明确区分.所有市售金钱白花蛇样品均可从头部和尾部成功获得Co Ⅰ序列,药源调查结果表明银环蛇29份,赤链蛇20份,赤链华游蛇2份,混伪品占比43％;基于头部和尾部的鉴定结果一致.结论:DNA条形码技术可用于市售金钱白花蛇的药源调查;金钱白花蛇市场混乱、混伪品较多,质量问题严重.

重金属与有害元素的毒性与其形态直接相关.本文建立了基于HPLC-ICP-MS的动物药中汞、砷形态分析方法,在此基础上检测了31种动物药(含2015版《中国药典》项下29个品种)中不同形态汞、砷的残留量.结果发现,不同形态汞、砷的LOQ为0.1～0.65μtg·kg-1,回收率为86.9％～116.6％,RSD为1.49％～4.23％.31种动物药共87个批次均检测到Hg2+,含量为2.39～6567 μg·kg-1;12种动物药共33个批次检测到MeHg,含量为2.83～319.7 μg·kg-1;所有的动物药样品中均未检测到EtHg.31种动物药批次中不同砷形态的检出率分别为:As(Ⅲ):96.77％,As(V):100％,一甲基砷(MMA):45.16％,二甲基砷(DMA):90.32％,砷甜菜碱(AsB):93.55％,砷胆碱(AsC):22.58％.根据不同形态毒性强弱,Hg残留高风险的品种为:蕲蛇、金钱白花蛇、乌梢蛇、蜈蚣;As残留高风险的品种为:地龙、蕲蛇、乌梢蛇、九香虫.本研究可为动物药中重金属风险评估与限量标准制修订提供重要参考.

动物类中药是我国传统中药的重要组成部分.古代中医药学者已经认识到动物类有毒中药的毒性成分同时也是其有效成分,并采取配伍、炮制、制剂等方法达到减毒增效的目的.现代研究发现,各种动物毒素是引起动物类有毒中药毒性的物质基础.动物毒素包括结构和功能丰富多样的蛋白质和多肽等活性物质,不同的动物毒素生物效应也不同.该文通过系统查阅土鳖虫、水蛭、全蝎、金钱白花蛇、斑蝥、蜈蚣、蕲蛇和蟾酥等8种动物类有毒中药的历史记载和现代毒性研究报道,从引起毒性反应的化学成分、分子机制以及临床表现和对策等角度进行综合评价,以期为科学认识动物类有毒中药、促进临床合理应用动物类有毒中药提供参考.

目的:学习2015年版中国药典,指导中药材与饮片的临床应用.方法:认真阅读理解2015年版中国药典,并参阅《中国植物志》、《中国动物志》、《中药大辞典》及对照实物.结果:对于药典中川木通、马钱子粉、木棉花、乌梢蛇、远志、杜仲、金钱白花蛇及翼首草的部分记载产生疑问.结论:建议对药典中川木通、马钱子粉、木棉花、乌梢蛇、远志、杜仲、金钱白花蛇及翼首草的部分内容进行更正.

目的:探讨不同种类植物药中重金属和有害元素的残留特性,结合内梅罗(N.L.Nemerow)综合污染指数法和中药中外源性有害残留物安全风险评估指导原则分析其污染及风险情况,为制定安全性限度标准提供依据.方法:采用微波消解电感耦合等离子体质谱法(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS),对37种2427批次常用花、叶、全草、果实、种子类中药材的重金属残留量进行测定.结果:各元素呈现良好的线性关系(r＞0.999),回收率在62.7％～121.1％,RSD在0.2％～13.0％,表明该方法准确可靠.样品的总合格率为71.4％;重金属和有害元素超标率为镉(20.9％)＞铅(5.8％)＞铜(3.9％)＞汞(3.5％)＞砷(2.9％).不同部位合格率:种子类(97.3％)＞果实类(92.0％)＞花类(68.5％)＞全草类(53.2％)＞叶类(51.3％).结论:叶类、全草类最易蓄积重金属和有害元素,其次是花类;果实、种子类重金属和有害元素残留情况较好;花、叶、全草最易蓄积镉元素.山银花、白花蛇舌草、穿心莲、艾叶、青蒿、鱼腥草、茵陈、广金钱草8个品种的重金属和有害元素污染较严重;白花蛇舌草和山银花中镉,茵陈中的砷以及白花蛇舌草、穿心莲、艾叶、青蒿、鱼腥草、茵陈、广金钱草中的铅有残留风险.