目的:评价右美托咪定对机械通气相关性肺损伤(VILI)大鼠细胞外信号调节激酶(ERK)/钠钾ATP酶(Na ＋-K ＋-ATPase)信号通路的影响。 方法:清洁级健康雄性SD大鼠48只，体重270～320 g，4～5月龄，采用随机数字表法分为4组( n＝12)：对照组(C组)、VILI组(V组) 、右美托咪定组(D组)和右美托咪定＋育亨宾(α 2肾上腺素能受体阻断剂)组(DY组) 。C组不行机械通气，自主呼吸空气4 h；V组机械通气(通气频率40次/min，V T 40 ml/kg，I∶E 1∶1，PEEP 0，FiO 2 21%)4 h；D组机械通气前20 min静脉输注右美托咪定5.0 μg/kg，机械通气期间以5.0 μg·kg -1· h -1的速率静脉输注，DY组给予右美托咪定前10 min时静脉注射育亨宾0.1 mg/kg，其余处理同D组。机械通气4 h时，取血标本和肺组织，测定肺湿/干重(W/D)比值与肺通透指数(LPI)，观察肺组织病理学结果，测定肺泡内液体清除率(AFC)。采用Western blot法检测肺组织ERK、磷酸化ERK(p-ERK)、Na ＋-K ＋-ATPase的表达水平。 结果:与C组比较，V组与DY组肺组织LPI和W/D比值升高，AFC降低，p-ERK表达上调，Na ＋-K ＋-ATPase表达下调( P<0.05) ，D组上述指标差异无统计学意义( P>0.05)；与V组比较，D组肺组织LPI和W/D比值降低，AFC升高，p-ERK表达下调，Na ＋-K ＋-ATPase表达上调( P<0.05)，肺组织病理学损伤减轻，DY组上述指标差异无统计学意义( P>0.05)；与D组比较，DY组肺组织LPI和W/D比值升高，AFC降低，p-ERK表达上调，Na ＋-K ＋-ATPase表达下调( P<0.05)，肺组织病理学损伤加重。 结论:右美托咪定减轻大鼠VILI的机制可能与激动α 2肾上腺素能受体，抑制ERK/Na ＋-K ＋-ATPase信号通路有关。

目的:探讨外源性肿瘤坏死因子α(TNF－α)对三维环境下小鼠间充质干细胞向汗腺细胞分化的影响及其分子机制。方法:(1)取5只6～8周龄雌性C57BL/6小鼠，用烫伤仪在每只小鼠背部制成1个1 cm 2深Ⅱ～Ⅲ度烫伤创面。伤后1 d，取创面全层皮肤组织，采用酶联免疫吸附测定法检测组织中TNF－α浓度。(2)将0.9 g明胶和0.3 g海藻酸钠混匀后溶于30 mL磷酸盐缓冲液中制成水凝胶，取10只1 d龄雌雄不明C57BL/6小鼠足底全层皮肤研磨成真皮匀浆，从10只7 d龄雌雄不明C57BL/6小鼠股骨和胫骨中分离培养间充质干细胞。混合8 mL预热水凝胶、1 mL小鼠足部真皮匀浆、1 mL第2或3代终浓度为1.5×10 5个/mL间充质干细胞悬液，利用三维生物打印机在培养皿中打印出纵横交错的圆柱块共12块。打印块用25 g/L氯化钙溶液交联10 min，加入间充质干细胞培养基常规培养12 h后，按随机数字表法分为空白对照组和TNF－α处理组，每组6皿、6块。2组打印块均更换新鲜的汗腺诱导培养基培养，TNF－α处理组培养基中另加入终质量浓度为20 ng/mL的TNF－α。培养6 h，采用实时荧光定量反转录PCR法检测各组2皿打印块中间充质干细胞的多能性标志物Nanog mRNA的表达，采用蛋白质印迹法检测各组1皿打印块中间充质干细胞的Nanog蛋白表达，样本数均为3。培养14 d，采用实时荧光定量反转录PCR法检测各组2皿打印块中间充质干细胞的汗腺细胞标志物细胞角蛋白14(CK14)、CK18、钠钾ATP酶蛋白a1(ATP1a1)和水通道蛋白5(AQP5)mRNA表达，样本数为3；采用免疫荧光染色检测各组1皿打印块中间充质干细胞CK14、CK18、ATP1a1和AQP5蛋白表达分布。对数据行独立样本 t检验。 结果:(1)伤后1 d，小鼠烫伤创面组织中TNF－α质量浓度为(19±3)ng/mL。(2)培养6 h，TNF－α处理组打印块中间充质干细胞Nanog mRNA和蛋白表达量分别为0.39±0.04、0.36±0.03，均明显低于空白对照组的1.00±0.05、1.00±0.07( t＝16.51、14.56， P<0.01)。(3)培养14 d，TNF－α处理组打印块中间充质干细胞CK18、CK14、ATP1a1、AQP5 mRNA表达量分别为0.38±0.03、0.42±0.11、0.23±0.06、0.25±0.03，明显少于空白对照组的1.00±0.03、1.00±0.05、1.00±0.05、1.00±0.07( t＝25.31、8.31、17.07、17.06， P<0.01)。(4)培养14 d，空白对照组打印块中间充质干细胞CK18、CK14、ATP1a1和AQP5蛋白均广泛分布于细胞质，而TNF－α处理组打印块中间充质干细胞CK18、CK14、ATP1a1和AQP5蛋白在细胞质的分布较空白对照组明显减少。 结论:外源性TNF－α抑制三维环境下小鼠间充质干细胞向汗腺细胞定向分化，这可能与TNF－α抑制Nanog mRNA和蛋白水平的表达从而使间充质干细胞多向分化潜能下调有关。

目的:观察生物三维打印类细胞外基质(ECM)硬度对骨髓间充质干细胞(BMSC)向皮肤附属器细胞分化的影响。方法:(1)分别将1 g海藻酸钠和4 g明胶、3 g海藻酸钠和8 g明胶混匀，混合物分别溶于100 mL超纯水中，配制2种海藻酸钠-明胶复合水凝胶，分别命名为1A4G水凝胶、3A8G水凝胶，用于后续实验。观察2种水凝胶室温下、4 ℃冷凝15～30 min(冷凝条件下同)后、冷凝且用25 g/L氯化钙溶液交联(交联条件下同)后、冷凝后且用生物三维打印机(三维打印仪器下同)进行三维打印且交联后形态。取2种水凝胶冷凝并交联后，采用杨氏模量测定仪检测杨氏模量(硬度)，样本数为3。取2种水凝胶交联并冷冻干燥，用扫描电子显微镜观察其孔隙结构。取2种水凝胶交联并冷冻干燥，用无水乙醇置换法检测孔隙率，样本数为3。(2)从20只1周龄雌雄不限C57BL/6小鼠股骨和胫骨中分离培养BMSC，取第2代细胞进行实验。分别将1.0×10 7个/mL的BMSC单细胞悬液与1A4G水凝胶、3A8G水凝胶以1∶9的体积比充分混匀，制备载BMSC的1A4G水凝胶、载BMSC的3A8G水凝胶，进行三维打印，1 mL载细胞水凝胶(打印用量下同)打印1块，交联后加入间充质干细胞(MSC)专用培养基培养。根据水凝胶不同，将打印块分为1A4G组和3A8G组。取2组打印块各1块，培养7 d，采用细胞活/死试剂盒计数50倍视野下活、死细胞。取2组打印块各9块，另将9孔用2 mL MSC专用培养基培养的每孔1.0×10 6个BMSC设为二维培养组。分别于培养1、3、5 d，1A4G组与3A8G组各取3块打印块、二维培养组取3孔细胞，用细胞计数试剂盒8法检测培养液中吸光度值，以此表示细胞增殖活性。(3)同实验(2)制备载BMSC的1A4G水凝胶、载BMSC的3A8G水凝胶各10 mL，分别加入从10只新生1 d雌雄不明C57BL/6小鼠提取的足趾垫匀浆液各0.5 mL混匀进行三维打印及交联，加入MSC专用培养基培养3 d，更换为汗腺专用培养基培养。根据水凝胶不同，将打印块分为1A4G组和3A8G组。汗腺专用培养基培养7 d，采用免疫荧光法检测2组打印块中细胞的上皮细胞表面标志物细胞角蛋白5(CK5)和CK14、汗腺细胞表面标志物CK18和钠钾ATP酶(NKA)、毛囊细胞表面标志物CK17和碱性磷酸酶(ALP)蛋白表达，实时荧光定量反转录PCR法检测2组打印块中细胞的CK5、CK14、CK18、NKA(检测ATP1a1转录本)、CK17、ALP mRNA表达(样本数为3)。对数据行独立样本 t检验、Fisher确切概率法检验、析因设计方差分析及Bonferroni法。 结果:(1)与3A8G水凝胶比较，1A4G水凝胶室温下黏度稍低、流动性稍好。2种水凝胶冷凝后均呈凝胶状，在此基础上，交联后形状均匀规则，经三维打印且交联后为固态的纵横交错的圆柱块。1A4G水凝胶杨氏模量为(52±6)kPa，明显低于3A8G水凝胶的(218±5)kPa( t＝40.470， P<0.01)。2种水凝胶孔隙结构相似，横断面均呈多孔网状结构；2种水凝胶的孔隙率相近( t＝0.930， P>0.05)。(2)培养7 d，1A4G组和3A8G组打印块中活、死细胞分布相近( P>0.05)，绝大部分为活细胞。培养1、3、5 d，1A4G组和3A8G组打印块及二维培养组培养液中吸光度值两两比较，差异均无统计学意义( P>0.05)。与组内培养1 d比较，1A4G组、3A8G组打印块培养3、5 d培养液中吸光度值均明显升高( P<0.05或 P<0.01)，二维培养组细胞培养5 d培养液中吸光度值明显升高( P<0.01)；与组内培养3 d比较，1A4G组、3A8G组打印块及二维培养组细胞培养5 d培养液中吸光度值均明显升高( P<0.01)。(3)汗腺专用培养基培养7 d，2组打印块中细胞均可见CK5、CK14、CK18、NKA、CK17、ALP蛋白表达。汗腺专用培养基培养7 d，2组打印块中细胞的CK5、CK14、CK18、NKA mRNA表达量相近( t＝0.362、0.807、0.223、1.356， P>0.05)；3A8G组打印块中细胞的CK17、ALP mRNA表达量分别为1.96±0.21、55.57±11.49，均明显高于1A4G组的1.05±0.42、2.01±0.27( t＝3.333、8.074， P<0.05或 P<0.01)。 结论:1A4G水凝胶和3A8G水凝胶三维培养的BMSC均有向汗腺细胞分化的趋势，但3A8G水凝胶三维培养的BMSC向毛囊细胞分化的趋势比1A4G水凝胶明显。提示相对高的生物三维打印类ECM硬度，不仅有利于BMSC向汗腺细胞分化，还有利于其向毛囊细胞分化。

目的:观察钠钾ATP酶抑制剂哇巴因抑制肝癌HepG2细胞的增殖和分裂效果，并探讨其作用机制。方法:不同浓度（0.1、1.0、10.0 μmol/L）哇巴因作用HepG2细胞24 h，以HepG2细胞为对照组，通过细胞活力检测试剂盒（CCK-8法）检测哇巴因对HepG2细胞增殖的抑制作用，细胞免疫荧光共定位（ICC法）检测细胞染色体分离状态，Western印迹检测极光激酶A（AURKA）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、p-mTOR、促分裂原活化蛋白激酶（ERK）、p-ERK蛋白表达。结果:0.1、1、10 μmol/L哇巴因作用细胞24 h后，细胞生长抑制率分别为（23.50±4.57）%、（49.80±5.32）%和（72.10±5.62）%，与对照组相比差异均有统计学意义，抑制效果呈现浓度依赖性（ F=32.8，均 P<0.05）；细胞免疫荧光共定位显示，1 μmol/L哇巴因作用细胞24 h后，染色体分离发生障碍。与对照组相比，加药组细胞纺锤体直径显著较低，差异有统计学意义（ t=9.58， P<0.05）。Western印迹结果显示，1 μmol/L哇巴因作用HepG2细胞24 h后，与对照组相比，AURKA、p-mTOR、p-ERK表达较低（ F=16.26，8.32，33.59； P<0.05），哇巴因可阻抑肝癌细胞在裸鼠体内生长（ F=370.20， P<0.05）。 结论:哇巴因通过阻遏激光激酶信号途径，诱发肝癌HepG2细胞染色体分裂障碍、抑制肝癌细胞生长。

目的 研究高尿酸血症(hyperuricemia,HUA)肾皮质损伤的超声变化.方法 一共15 只雄性SD大鼠随机分为3 组(每组5 只),包括正常组(Cont组)、模型组(HUA组)和非布司他治疗组(HUA+Feb组,Feb 3 mg/kg·d).所有大鼠自由随意饮水和喂养普通饲料.HUA组大鼠用氧嗪酸(OA,750 mg/kg·d)灌胃8 周诱导成模.HUA+Feb组大鼠于第五周开始用非布司他灌胃4 周.8 周后检测血清尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)和血尿酸(Sua)水平.测定大鼠肾皮质组织中的钠钾ATP酶(NKA)活性和NKA α1 亚单位蛋白表达,并通过超声观察大鼠肾脏结构、检测皮质回声.计算肾/脾回声强度比(K/S).此外,临床上共招募在复旦大学附属华东医院接受肾脏B超检测的正常对照(n =44)和HUA受试者(n =46),并收集他们的基本临床信息并进行比较.结果 动物实验结果显示,与Cont组大鼠相比,HUA组的Sua水平升高(P＜0.05),NKA活性降低(P＜0.05).与HUA组相比,HUA+Feb组的Sua水平降低(P＜0.05),NKA活性和NKA α1 蛋白表达增加(P＜0.05).超声结果显示,HUA组的肾皮质回声高于Cont组(P＜0.05),非布司他治疗后 4周,HUA+Feb组大鼠肾皮质回声显著改善(P＜0.05),且K/S比值低于HUA组(P＜0.05).大鼠肾脏长度、宽度和肾实质厚度在各组间无明显差异(P＞0.05).临床数据显示,HUA患者表现为肾皮质回声增强,结晶增多以及结构欠清,部分伴有多发小囊灶形成.结论 HUA早期肾脏损伤的同时伴有肾脏皮质回声增强,因此超声可能用作非侵入性的影像工具,以评估早期HUA引起的肾脏损伤.

实验旨在探讨饲料添加N-氨甲酰谷氨酸(NCG)或牛磺酸(Taurine)对杂交鳢(Channa maculata ♀ × C.argus ♂)幼鱼肠道生长、消化、抗氧化和肠道菌群的影响.实验选取初始体均重为(22.02±0.02)g的杂交鳢450尾,随机分为3个组,每组3个重复,每个重复50尾,分别投喂基础饲料以及在基础饲料中添加0.03％N-氨甲酰谷氨酸、1％牛磺酸的3种实验饲料,记作对照组,0.03％NCG组和1％Taurine组,饲喂8周.结果表明,饲料中添加0.03％NCG或1％Taurine可显著提高杂交鳢蛋白质沉积率(P＜0.05),提高肠道淀粉酶和肌酸激酶活性(P＜0.05),促进前肠肌层厚度、中肠绒毛宽度、中肠肌层厚度和后肠肌层厚度生长(P＜0.05),增强肠道厚壁菌群和支原体属丰度(P＜0.05),显著降低饲料系数和肠道丙二醛含量(P＜0.05),显著降低肠道梭杆菌群和梭菌属丰度(P＜0.05).此外,饲料中添加0.03％NCG可显著提高杂交鳢肠道总抗氧化能力、过氧化物酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性(P＜0.05),显著缓解肠道病理状态(P＜0.05),显著提高杂交鳢肠道胰蛋白酶、脂肪酶、γ-谷氨酰转移酶和钠钾ATP酶活性(P＜0.05),促进前肠绒毛长度、前肠绒毛宽度和后肠肌层厚度生长(P＜0.05),并显著提高肠道OUT占比、Chao和Ace指数(P＜0.05),增强肠道菌群丰富度和多样性(P＜0.05).结果表明饲料中添加NCG在增强肠道抗氧化活性,缓解肠道氧化损伤方面优于添加牛磺酸,但饲料添加牛磺酸可以增强肠道消化酶活性,增强肠道菌群丰富度和多样性,维持肠道稳态并促进肠道生长,其作用效果优于补充NCG.

建立气阴两虚病证糖尿病肾脏疾病病证结合动物模型及评价指标.将30只Wistar大鼠按照体重随机分为正常组(10只)、模型组(20只).模型组采用高糖高脂饲料喂养4周,腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)25 mg/kg诱导形成糖尿病大鼠.把成模大鼠按照24 h尿蛋白值分配到糖尿病肾脏疾病模型组(10只)、气阴两虚病证结合模型组(10只),气阴两虚病证结合模型组以附子、青皮、枳实按照5:6:6,13 g/kg灌胃诱导8周.对大鼠各项测量指标进行观测.发现与正常组和糖尿病肾脏疾病模型组比较,气阴两虚病证结合模型组大鼠粪便中有益菌:乳酸杆菌属、梭菌属、拟杆菌门、双歧杆菌属含量显著降低;致病菌:梭杆菌属、肠杆菌、毛螺菌科、粪肠球菌含量显著升高;气阴两虚病证结合模型组大鼠血清中免疫球蛋白G(IgG)(0.5±0.1 g/L)、免疫球蛋白M(IgM)(14.2±0.6 g/L)和肾脏组织中钠钾泵酶(Na+/K+-ATP)(0.8±0.3 U/mg)、钙镁泵酶(Ca2+-Mg2+-ATP)(2.0±0.3 U/mg)显著低于正常组(P＜0.05),环磷酸腺苷(cAMP)(0.9±0.2 mmol/L)、环磷酸腺苷/环磷酸鸟苷(cGMP)(0.3±0.1 mmol/L)显著高于正常组(P＜0.05).HE染色显示:与正常组和糖尿病肾脏疾病模型组比较,气阴两虚病证结合模型组大鼠出现明显肾脏和结肠损伤;肾脏和结肠组织的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)蛋白表达均显著升高,结肠中毒蕈碱型胆碱受体M3(M3R)、5-羟色胺受体3A(5-HT3A)、闭合蛋白(Occludin)、紧密连接蛋白(ZO-1)表达显著降低.实验结果表明通过高糖高脂喂养4周联合腹腔注射STZ25 mg/kg、附子、青皮、枳实灌胃诱导大鼠8周,可部分形成气阴两虚证糖尿病肾脏疾病基本证候特征,用于评价气阴两虚证糖尿病肾脏疾病的建立.

研究黄芩汤(HQD)的抗须癣毛癣菌活性及作用机制.方法 通过测定最小抑菌浓度(MIC)、最小杀菌浓度(MFC)、菌丝长度、孢子萌发率、生物量和观察菌丝超微结构评价HQD的抗须癣毛癣菌活性;通过山梨醇保护实验检测HQD对须癣毛癣菌细胞壁的影响;通过测定麦角固醇含量和角鲨烯环氧酶(SE)、羊毛甾醇14α-去甲基化酶(CYP51)的活性考察HQD对须癣毛癣菌细胞膜的影响;通过测定线粒体中苹果酸脱氢酶(MDH)、琥珀酸脱氢酶(SDH)及ATP酶(包括钠钾ATP酶、钙镁ATP酶和总ATP酶)的活性考察HQD对须癣毛癣菌线粒体的影响.结果 HQD对须癣毛癣菌具有显著的抑菌活性,MIC、MFC值分别为3.13、25 mg/mL.经HQD干预后,须癣毛癣菌菌丝长度均显著缩短(P＜0.05);孢子萌发率、生物量、细胞膜中麦角固醇含量和SE、CYP51活性以及线粒体中MDH、SDH、各种ATP酶的活性均显著降低(P＜0.05);细胞结构受到了一定程度的破坏,但细胞壁的完整性没有受影响.结论 HQD具有显著的抗须癣毛癣菌活性,其作用机制与降低细胞膜中麦角固醇含量和SE、CYP51活性以及线粒体相关酶活性有关.

目的 探讨阿魏酸钠(SF)对角膜内皮功能障碍及角膜内皮细胞(CEC)损伤的影响及潜在机制.方法 将雄性新西兰兔分为对照组、苯扎氯铵(BAK)组和BAK+SF组,每组6只.除对照组外,其余组以前房注射BAK建立大泡性角膜病变模型,BAK+SF组于术后次日腹腔注射SF溶液200 mg/kg,每天2次,连续14 d.观察各组兔角膜透明度和基质水肿情况(术前及术后第1、7、14天),检测其角膜厚度(术后第14天)和眼内压(术后第1～14天);于术后第14天,评估其角膜内皮结构并检测功能相关蛋白[鬼笔环肽、胞质紧密连接蛋白1(ZO-1)、钠钾ATP酶、Ki67]的表达情况.于术后14 d采集BAK组角膜组织,分离、培养原代兔CEC,将其分为空白组和不同质量浓度SF组,检测不同培养时间下各组细胞的活力和Ras同源基因家族A(RhoA)、骨形成蛋白受体1A(BMPR1A)、BMRP2蛋白的表达情况.结果 与BAK组比较,BAK+SF组兔角膜透明度和基质水肿情况逐渐好转,且角膜厚度显著减小(P＜0.05);其CEC仅缺损至B区,且表现为正常的六边形内皮细胞结构;其角膜内皮组织中鬼笔环肽、ZO-1、钠钾ATP酶、Ki67蛋白的表达均显著升高(P＜0.05).当SF质量浓度≤200 mg/L时,其对兔CEC的增殖有一定的促进作用,具有浓度依赖性(P＜0.05)和时间依赖趋势,且50、100、200 mg/L的SF可浓度依赖性地上调细胞中RhoA、BMPR1A、BMPR2蛋白的表达(P＜0.05).结论 SF可改善大泡性角膜病变模型兔受损角膜内皮的透明度,减轻基质水肿,减小角膜厚度,维持角膜内皮结构完整性并促进角膜内皮功能恢复;该成分还可促进兔CEC的增殖,此作用可能与激活RhoA-Rho激酶-骨形成蛋白信号通路有关.

目的:就对比剂影响糖尿病大鼠单肾近球小管钾钠离子ATP酶(K+,Na+-ATPase)活性状况加以探讨;在对比剂急性肾损伤方面,对健康大鼠与糖尿病大鼠展开对比分析;就对比剂肾病发病机理展开研究.方法:对正常成年SD大鼠及造模成功的糖尿病大鼠经尾静脉注射等量低渗对比剂和生理盐水,经过3d取材;通过微分离技术,借助显微镜找到检测部位单肾近球小管,借助电镜完成鉴定,应用液闪法对K+,Na+-ATPase活性加以测定.结果:与盐水对照组相比,就检测部位的K+,Na+-ATPase活性而言,对比剂组大鼠单根呈极显著较低表现(P＜0.01);与正常大鼠相比,糖尿病大鼠Na+,K+-ATPase活性明显进一步降低(P＜0.01).结论:就大鼠肾近球小管K+,Na+-ATPase活性而言,对比剂呈现出一定的抑制作用,其中糖尿病大鼠作用更为显著.