目的 了解山西省市售食品中阪崎克罗诺杆菌的污染状况、毒力基因携带状况及脉冲电场凝胶电泳(PFGE)分子分型.方法 采用质谱检测系统对菌株进行分型鉴定,通过荧光PCR检测4种毒力基因:ompX、cpa、hly和sip,并对菌株进行PFGE分子分型.结果 2013-2022年检测样品1 050份,分离阪崎克罗诺杆菌80株,总检出率为7.62％.4种毒力基因的检出率分别为:ompX 86.25％,cpa 85.00％,hly 98.75％,sip 86.25％.PFGE分型分为67种基因图谱,相似度在43.7％～100.0％,菌株间表现出较高的遗传多样性,不同产地、不同厂家间的菌株型别分散,仅少数菌株呈现出遗传相关性.结论 该研究结果可对山西省食品中阪崎克罗诺杆菌的风险状况和分型情况提供数据支持,需进一步加强评估和多环节防控.

[背景]阪崎克罗诺杆菌是一种食源性病原体,摄入受污染的婴儿配方奶粉(powdered infant formula,PIF)常引起新生儿坏死性小肠结肠炎和脑膜炎,对早产儿和免疫功能低下的婴儿健康甚至生命产生严重威胁.噬菌体具有特异性杀菌性,可成为一种新型生物防控制剂预防阪崎克罗诺杆菌和其他食源性致病菌的污染.[目的]从污水中分离出感染阪崎克罗诺杆菌噬菌体,评价其生物学特性、基因组生物信息及在婴儿配方奶粉中杀菌作用.[方法]采用双层琼脂法分离鉴定噬菌体,并测定其酸碱稳定性、温度稳定性、宿主范围和一步生长曲线,透射电镜观察形态,对其基因组进行二代测序和裂解功效测定.[结果]从污水中分离到一株新的能裂解阪崎克罗诺杆菌的噬菌体JC01,具有二十面立体对称头部和非收缩的长尾,噬菌体JC01 基因组为双链DNA,由61 736 bp组成,预测有 76 个开放阅读框(open reading frame,ORF),不含有tRNA,基因组中不含有耐药基因和毒力基因.系统发育分析及基因比对分析显示噬菌体JC01 是全新的噬菌体,归类于有尾噬菌体纲(Caudoviricetes)卡金斯病毒科(Casjensviridae)雅昆病毒属(Jacunavirus),被命名为Jacunavirus 01.噬菌体JC01 在不同温度(-20-40 ℃)和pH 5.0-9.0 范围内稳定,且对婴儿配方奶粉污染的阪崎克罗诺杆菌具有良好的杀菌效果.[结论]JC01 噬菌体是裂解阪崎克罗诺杆菌的新噬菌体,作为生物安全防控剂在食品生产和加工方面具有很大潜力.

目的 建立一种能够快速准确鉴定克罗诺杆菌的实时荧光聚合酶链式反应(PCR)方法,并对食品样品和人工污染样品进行克罗诺杆菌检验.方法 根据克罗诺杆菌DNA旋转酶B亚基(gyrB)基因保守区序列设计引物和探针.通过特异性试验、绝对灵敏度、相对灵敏性试验、抗干扰试验对所建立方法进行方法学验证.采用人工污染样品增菌液进行方法灵敏度试验.结果 本研究建立的方法能够特异性扩增7种克罗诺杆菌,但对与其亲缘关系较近的其他肠杆菌及食品中较为常见的其他致病菌均无扩增,表明本研究建立的方法具有很好的特异性和抗干扰能力.采用阪崎克罗诺杆菌验证绝对灵敏度达1～10pg,相对灵敏度可以达到103CFU/mL.在基因组水平和培养物水平均具有很好的抗干扰能力.人工污染样品在36℃增菌24 h后检测灵敏度可以达到100 CFU/mL.结论 本研究所建立的实时荧光PCR方法对婴幼儿配方食品样品中的克罗诺杆菌的检测具有快速、特异、灵敏和稳定的特点,可以为传统婴幼儿配方食品中的克罗诺杆菌的检验提供技术参考.

目的 了解PubMLST数据库中克罗诺杆菌(Cronobacter spp.)全球分离株的分子流行病学特征,为克罗诺杆菌病的预防和控制提供理论依据. 方法 利用PubMLST数据库收录的数据,筛选其中具有完整序列分型(sequence type,ST)的来自全球的克罗诺杆菌株数据,分别进行国别、来源、菌种构成、序列型及克隆复合体(Clonal complex,CC)的构成分析,并基于7个管家基因序列构建与人类致病密切相关的CC4和CC7型克罗诺杆菌分离株的系统发育树,进行遗传进化分析. 结果 从PubMLST数据库巾筛选出1 603条菌株数据,共含有541个ST型和50个CC型,其巾ST4型和CC4型居多,分别含有256和295条菌株数据.来自中国的克罗诺杆菌分离株数据有610条数据,包括31 5个ST型和40个CC型,其中ST4型和CC4型分别含有62条和75条菌株数据.1 603株克罗诺杆菌分离株中,来自中国的分离株数居多(610),其次为捷克(188)和美国(176);来源于食品的分离株数量居多(58.39％),其次为环境标本(21.83％)和临床标本(14.78％);菌种构成以阪崎克罗诺杆菌(C.sakazakii)数量居多(70.24％),其次为丙二酸盐阳性克罗诺杆菌(C.malonaticus,12.41％),都柏林克罗诺杆菌(C.dublinensis,8.98％),苏黎世克罗诺杆菌(C.turicensis,4.68％),穆汀斯克罗诺杆菌(C.muytjensii,2.5％),尤尼沃斯克罗诺杆菌(C.universalis,1.00％)和康迪蒙提克罗诺杆菌(C.condimenti,0.1 9％).致病变种阪崎克罗诺杆菌、丙二酸盐阳性克罗诺杆菌和苏黎世克罗诺杆菌分别含有256、92,49个ST型以及27、10、5个CC型.与人类致病密切相关的CC4和CC7型分离株分别包括32和12个ST型,其中ST4型分离株在CC4型较多,ST7型分离株在CC7型较多.CC4和CC7型分离株分别分布在全球21和10个国家中,其中CC4和CC7型中国分离株分别占其总数的25.42％和36.00％.系统发育分析CC4和CC7型克罗诺杆菌分离株分布在两个不同的簇群,亲缘关系较远. 结论 克罗诺杆菌全球分离株具有高度遗传多样性,目前已分离出5种克罗诺杆菌临床分离株,且与致病相关的CC4和CC7型菌株占比较高,提示应加强对不同来源的克罗诺杆菌病的流行病学监测,以降低克罗诺杆菌爆发的风险.

目的 研究不同样品前处理方法对VITEK(R)基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(VITEK(R) MALDI-TOFMS,以下简称VITEK MS)鉴定阪崎克罗诺杆菌的影响及该方法对阪崎克罗诺杆菌的分型溯源能力,研究VITEKMS与MALDI 7090TMMALDI-TOF/TOF MS(以下简称MALDI 7090)所得图谱的异同.方法 选取3种不同样品前处理方法处理18株阪崎克罗诺杆菌野生菌株、2株阪崎克罗诺杆菌标准菌株和2株非阪崎克罗诺杆菌标准菌株,比较VITEK MS鉴定结果与传统鉴定结果的一致性;通过VITEK MS的鉴定结果和图谱的比对,研究不同样品前处理方法对阪崎克罗诺杆菌鉴定的影响;利用VITEK MS质谱图特征峰的聚类分析,对20株阪崎克罗诺杆菌进行溯源研究;同时比较VITEK MS与MALDI 7090所得图谱,研究两者的异同.结果 20株试验菌株的VITEK MS鉴定结果均为阪崎克罗诺杆菌,与传统的鉴定结果一致,并与2株非阪崎克罗诺杆菌标准菌株能明显地区分;3种不同样品前处理方法得到的鉴定谱图与标准谱图比对获得的鉴定结果可信度之间差异无统计学意义(P＞0.05),但质谱图中质谱峰数量和相对峰强度有明显差异,其中甲酸提取法在2 000～ 15 000 m/z范围内,相对峰强度＞5 mV的质谱峰数量达15个以上.在相似水平为80％的条件下,VITEK MS的聚类分析将甲酸提取法的20株阪崎克罗诺杆菌分为5个群,通过聚类分析及菌株来源能够推测阪崎克罗诺杆菌传播途径.VITEK MS和MALDI 7090得到的谱图,两者特征峰的出峰位置与相对峰强度无明显差异.结论 MALDI-TOF MS技术可以准确鉴定阪崎克罗诺杆菌:甲酸提取法更适用于阪崎克罗诺杆菌的MALDI-TOF MS鉴定;MALDI-TOF MS技术对阪崎克罗诺杆菌的溯源研究具有重要价值;VITEK MS与MALDI 7090所得谱图无明显差异.

克罗诺杆菌,原名阪崎肠杆菌,是污染婴幼儿配方奶粉的主要致病菌,能感染新生儿,并导致严重的坏死性小肠结肠炎、菌血症和脑膜炎等疾病.随着对该菌认识的深入,阪崎肠杆菌被命名为肠杆菌科独立的新属——克罗诺杆菌属.最新分类表明克罗诺杆菌属共包含7个种,每个种之间基因组构成和致病性存在差异,因此分种是克罗诺杆菌研究的基础,对进一步认识和了解克罗诺杆菌具有重要意义.近年来,除了传统生化方法分种,一系列分子生物学方法也应用于克罗诺杆菌的分种.本文综述了克罗诺杆菌的生物学特性和目前用于克罗诺杆菌分种的各种方法,以期增加对克罗诺杆菌分种方法的认识,为今后的研究工作提供依据.

[背景]阪崎克罗诺肠杆菌是一种食源性条件致病菌,它能够引起新生儿、婴幼儿及免疫能力低下的成年人罹患多种疾病,致死率高达50％-80％.[目的]探究天然植物源物质原儿荼酸对阪崎克罗诺肠杆菌的抑制作用及可能的抑制机理.[方法]采用琼脂稀释法确定原儿茶酸对阪崎克罗诺肠杆菌的最小抑菌浓度,并检测其对阪崎克罗诺肠杆菌生长曲线的影响.为探究原儿茶酸对阪崎克罗诺肠杆菌细胞膜的损伤,实验测定了细菌胞内pH、膜电位、胞内ATP浓度、细胞膜完整性,并利用扫描电镜观测原儿茶酸对阪崎克罗诺肠杆菌细胞形态的改变.[结果]原儿茶酸对阪崎克罗诺肠杆菌的最小抑菌浓度为2.5-5.0 mg/mL,原儿茶酸降低了阪崎克罗诺肠杆菌的生长速率.原儿茶酸作用后阪崎克罗诺肠杆菌胞内pH降低,细胞膜电位发生超级化/去极化,胞内ATP浓度降低,细胞膜完整性降低,细胞形态发生变化,这说明原儿茶酸改变了细胞膜通透性.[结论]原儿茶酸对阪崎克罗诺肠杆菌具有良好的抑制效果,其可能的抑菌机理是影响细胞膜的通透性及细胞形态.综合考虑原儿茶酸的多种生物活性,它有潜力作为天然抑菌物质在婴幼儿乳粉等其他食品中开发使用.

目的 分析5株阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii,C sakazakii)是否能够侵染人肠上皮细胞及其侵染能力.方法 将阪崎克罗诺杆菌与Caco-2细胞以100∶1的接种率接种后共培养4h,裂解细胞将进入细胞的菌落释放出来稀释涂布于LB琼脂平板,计数,计算侵染率.结果 从食源性疾病儿童病例中分离出的两种菌株C sakazakii13SJFB217、C sakazakii 14SJFB412对Caco-2细胞的侵染率分别达到0.0 219％和0.0 165％,从婴幼儿奶粉中分离的两株阪崎克罗诺杆菌C sakazakii 14SJ430、C sakazakii 14SJ431侵染率分别为0.0 071％和0.0 083％;来源于人的阪崎克罗诺菌株比来源于食品菌株对肠上皮细胞有更高的侵染能力.结论 石家庄市腹泻儿童粪便中分离到的2株阪崎克罗诺杆菌属于高侵染能力的菌株.

目的:研究6类中药饮片中污染微生物的群落特征,为中药饮片微生物限度标准制定提供依据.方法:参照《中华人民共和国药典》2015年版,对6类中药饮片共60批样品进行耐胆盐革兰阴性菌和沙门菌检查,采用VITEK生化鉴定系统对选择性分离平板上的微生物菌落进行鉴定,并基于16S rRNA高通量测序方法研究中药饮片中污染微生物的群落特征.结果:共有28批样品检出耐胆盐革兰阴性菌,不同类别饮片中耐胆盐革兰阴性菌的检出率差异较大,而沙门菌均未检出;菌株生化鉴定结果表明,6类中药饮片中污染的微生物均属于变形菌门,分布于14个属,其中包含阪崎克罗诺杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌、鲍氏不动杆菌等致病菌或条件致病菌;16S rRNA高通量测序微生物多样性分析结果表明,中药饮片污染微生物主要分布于6个门、27个属,不同类别中药饮片中的优势菌属具有明显差异.结论:16S rRNA高通量测序方法比传统培养法能够获得更加全面的中药饮片中污染微生物群落信息,不同类别中药饮片中污染微生物群落的组成具有一定差异,多种致病菌的检出提示中药饮片污染微生物具有一定的致病风险.

目的 了解2018年江西省婴幼儿食品中克罗诺杆菌的污染情况、分子分型及耐药特征,为市售婴幼儿食品致病菌的溯源积累数据并为临床用药提供参考数据.方法 共采集市售婴幼儿食品337份,按照GB 4789.40-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验》方法进行分离和鉴定,并采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)法对分离株进行验证,采用微量肉汤稀释法和脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术进行药敏试验和分子分型试验.结果 168份婴幼儿配方奶粉中未检出克罗诺杆菌;169份婴幼儿谷类辅助食品中有24份检出克罗诺杆菌(24株),阳性率为14.2％.药敏试验显示,24株分离株共对8种抗生素耐药,头孢唑啉(62.5％,15/24)和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑(29.2％,7/24)耐药率较高,全部菌株均对环丙沙星和亚胺培南敏感,其中1株分离株最高耐7种抗生素.PFGE结果显示分离株共有22种分子型别,相似度为46.6％ ～100.0％.结论 2018年江西省婴幼儿食品中克罗诺杆菌的污染情况与国内部分地区相似,克罗诺杆菌在婴幼儿谷类辅食中普遍存在,分离菌株对一、二代头孢菌素呈现不敏感趋势,PFGE型别高度多样化.