目的：:探讨MicroRNA-96（miR-96）对人视网膜色素上皮（RPE）细胞增殖和迁移的影响。方法：:实验研究。通过RNA原位杂交检测人胚胎眼（20周）石蜡切片中RPE层miR-96的表达情况。将miR-96和随机序列寡核苷酸链[阴性对照（NC）]通过阳离子脂质体介导转染人眼RPE细胞，采用细胞增殖实验（MTS）、流式细胞术和Transwell实验分别检测细胞增殖、细胞周期以及细胞迁移能力。通过生物信息学及Western blot法确定miR-96作用的靶基因。应用Western blot检测miR-96对细胞增殖迁移相关信号通路蛋白（Akt、ERK）及细胞周期相关蛋白（p-Cdc2、CyclinD2、p-Rb）表达的影响。组间数据比较采用独立样本 t检验。 结果：:miR-96在人眼RPE细胞中有表达。MTS结果显示，转染NC、miR-96后，人眼RPE细胞的相对增殖速率分别为100%、74%±2%，差异有统计学意义（ t=42.174， P=0.002）。流式细胞术检测结果显示，转染miR-96后阻滞在G1期的RPE细胞明显多于转染NC后，且差异有统计学意义（ t=-18.444， P=0.003）。Transwell实验结果显示，与转染NC相比，转染miR-96能显著抑制RPE细胞的迁移，差异具有统计学意义（ t=6.754， P=0.002）。进而，明确了 MITF是miR-96作用的靶基因。Western blot检测结果显示，转染miR-96后细胞中细胞周期相关蛋白p-Rb（ t=11.211， P=0.002）、p-Cdc2（ t=9.133， P=0.003）、CyclinD2（ t=7.542， P=0.005）以及迁移相关信号通路蛋白p-ERK（ t=16.699， P<0.001）、p-Akt（ t=23.552， P<0.001）的表达水平均降低。 结论：:miR-96通过作用于靶基因 MITF，调控细胞周期和迁移相关蛋白的表达从而抑制人RPE细胞的增殖和迁移。

目的 研究甘草次酸修饰的姜黄素阳离子脂质体(GAMCLCL)肝靶向性以及抗肝癌作用.方法 制备甘草次酸(GA)配体——GA和十八胺盐(SGO),用红外光谱和质谱检测;并进一步利用SGO制备GAMCLCL,透射电镜观察脂质体形态,NanoZS90纳米粒度仪测定脂质体粒径与电位;采用活体成像系统观察GAMCLCL小鼠体内荧光分布.Wistar大鼠随机分为对照组、模型组、阿霉素(阳性药,2mg·kg-1)组、姜黄素(20 mg·kg-1)组和GAMCLCL低、高剂量(2、4mg·kg-1)组,除对照组外,采用Walker-256细胞种植法制备肝原位移植瘤模型,每天1次,尾iv给药,连续7 d;另设GAMCLCL(4 mg·kg-1)给药14 d组;称肿瘤质量,计算肝脏系数、脾脏系数;全自动生化分析仪测定血液红细胞(RBC)、白细胞(WBC)、血小板(PLT)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和肌酐(CRE)水平,试剂盒法检测乳酸脱氢酶(LDH)水平;ELISA法检测血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)水平;Western blotting法检测肿瘤组织血管内皮生长因子(VEGF)、cleaved Caspase-3、Bcl-2、p53、p-PI3K、p-Akt蛋白表达水平.结果 红外光谱和质谱的结果可以验证GA与十八胺的反应生成了 SGO;GAMCLCL外观呈球形,其粒径为(194±0.25)nm,聚合物分散性指数(PDI)为0.21±0.02,电位为(31.9±0.31)mV;GAMCLCL在2个月内呈黄色透明溶液,无沉淀析出;GAMCLCL与血清混合未出现任何聚集和沉淀现象;活体成像实验显示,给药后各时间点荧光主要集中在肝脏,10、30、60 min时肝脏荧光较强,120 min时肝脏荧光明显减弱,240 min时肝脏荧光基本消失.与模型组比较,各给药组大鼠肿瘤质量均明显减轻(P＜0.05、0.01);各给药组肝脏系数显著降低(P＜0.05、0.01),游离姜黄素组、GAMCLCL4 mg·kg-1(7、14 d)组脾脏系数显著下降(P＜0.01);阿霉素及GAMCLCL4mg.kg-1(7、14d)组的RBC和PLT计数均显著升高(P＜0.01),WBC计数均显著降低(P＜0.05、0.01);各给药组大鼠ALT、CRE均显著降低(P＜0.05、0.01),除游离姜黄素组外,各给药组LDH显著降低(P＜0.05、0.01);各给药组IL-6、TNF-α均显著降低(P＜0.01、0.05);各给药组VEGF、Bcl-2、Akt、p-PI3K的蛋白表达均显著下调(P＜0.05、0.01),cleaved Caspase-3和P53蛋白表达均显著上调(P＜0.05、0.01);GAMCLCL(4 mg·kg-1)给药7 d与14 d的抗肿瘤效果相似,明显强于游离姜黄素.结论 GAMCLCL能显著增强姜黄素的肝靶向性和抗肝癌作用,有利于提高荷瘤大鼠的无进展生存期.

阳离子脂质体在基因治疗和基因沉默领域被广泛应用,其数量繁多,结构多样,有优化和改善基因递送行为的功能,随着基因治疗研究的逐渐深入,新型阳离子脂质体也被不断开发.阳离子脂质体主要有4个组成部分,即亲水的阳离子头部、疏水的脂质尾部、连接键以及辅助脂质,每个部分的结构对基因递送中阳离子脂质的转染效率和细胞毒性具有重要影响.可电离阳离子脂质细胞毒性较低,已有产品上市.本综述可为阳离子脂质体的设计提供一个概念框架,为阳离子脂质体的选择提供一定理论支持.

目的 制备肝癌细胞膜嵌合的TPP修饰HCPT脂质体(HCPT@T/HM-L),将HCPT高效递送到肝癌细胞线粒体,充分发挥药物在靶细胞器的药效作用.方法 采用薄膜水化法制备HCPT@T/HM-L,以挤压法将肝癌细胞膜嵌合在脂质体膜上,测定粒径、ζ电位、电镜进行表征;然后检测体外释放、溶血;以香豆素6为荧光探针,探索其胞内转运、线粒体靶向效果;最后从肿瘤细胞和荷瘤小鼠模型上,系统性评价肝癌细胞膜嵌合的HCPT@T/HM-L抗肿瘤效果.结果 HCPT@T/HM-L在电镜下呈现为规则圆球、具有"核-壳"状结构,粒径大约为(162.7±5.8)nm,ζ电位为(12.4±1.8)mV;HCPT@T/HM-L能促进载药系统的细胞摄取和靶向进入线粒体;细胞药效结果显示,HCPT@T/HM-L能很大程度上抑制肝癌细胞的生长,降低线粒体膜电位、升高细胞内ROS和Caspase-3水平,降低抗凋亡蛋白Bcl-2,提高促凋亡蛋白Bax表达,从而增强药物促进肝癌细胞的大量凋亡;荷瘤小鼠结果显示,HCPT@T/HM-L能明显抑制皮下瘤的生长,促使肿瘤细胞线粒体出现严重的功能障碍,从而促进肿瘤细胞的大量凋亡;细胞和动物试验结果均显示,HCPT@T/HM-L具有很好的抗肿瘤效果,明显优于其他组,这可能与肝癌细胞膜的融合以及TPP阳离子的线粒体靶向作用有关.结论 HCPT@T/HM-L可以高效递药到肝癌细胞线粒体,促进肿瘤细胞的大量凋亡,在精确治疗肿瘤方面具有较好的临床转化潜能.

目的 探讨miR-182对人皮肤黑素瘤细胞系A375细胞的增殖与侵袭能力的影响,及miR-182影响黑色素细胞增殖的机制.方法 利用阳离子脂质体LipofectamineTM 2000将miR-182模拟物或抑制剂转染人黑素瘤A375细胞,以使miR-182过表达或低表达,采用MTT方法检测细胞活力变化,应用Transwell小室法检测A375细胞侵袭能力的变化,同时通过Real-time PCR检测核转录因子环磷酸腺苷反应元件结合蛋白1(CREB1) mRNA的表达情况,采用Western blotting检测CREB1蛋白的表达水平.结果 与对照组相比,miR-182沉默能够显著增强A375细胞增殖和侵袭能力,P＜0.01,显著降低CREB1蛋白与mRNA的表达水平,P＜0.01;miR-182过表达的作用与之相反.结论 miR-182沉默增强A375细胞增殖和侵袭能力可能与降低CREB1蛋白相关.

目的 探讨NF-κB p65基因沉默对类风湿性关节炎滑膜HFLS-RA细胞增殖及凋亡的影响.方法 采用阳离子脂质体LipofectamineTM2000转染NF-κB p65的siRNA至HFLS-RA细胞中,利用RT-PCR和Western blot技术分别检测HFLS-RA细胞中NF-κB p65 mRNA和蛋白的表达情况.噻唑蓝MTT法和流式细胞仪检测细胞的增殖率和凋亡率.结果 与空白对照组和阴性对照组比较,转染siRNA后的HFLS-RA细胞中NF-κB p65 mRNA、蛋白表达量和细胞增殖率均明显下降,而细胞凋亡率明显升高,差异均有统计学意义(均P＜ 0.05).结论 NF-κBp65基因在类风湿性关节炎滑膜HFLS-RA细胞的增殖和凋亡过程中起着重要作用,使其沉默后能够抑制滑膜HFLS-RA细胞增殖,诱导其凋亡.

目的 研究PRDM1基因失活对C-MYC的调控在弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)中的作用,探讨其与免疫分型及预后相关性.方法 选取2009年1月至2015年12月在新疆医科大学第一附属医院收治DLBCL患者的石蜡包埋组织100例,反应性增生淋巴结20例.免疫组织化学EnVision法检测CD20、CD10、MUM1、Ki-67、bcl-6、Blimp1、C-MYC、PAX5蛋白表达,根据Hans分型法进行免疫分型.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测两组中PRDM1、C-MYC mRNA表达情况.单因素生存分析(Kaplan-Meier)法从蛋白、mRNA水平分析 PRDM1/Blimp1及C-MYC与预后相关性.应用阳离子脂质体转染法介导的小干扰RNA(siRNA)转染OCI-LY1[生发中心B细胞型(GCB型)]和OCI-LY3(non-GCB型)细胞系,RT-PCR和 Western blot方法检测 siRNA转染前后细胞系中 C-MYC mRNA和蛋白表达情况.结果 100例 DLBCL患者中,GCB型27例(27/100,27.0%),non-GCB型73例(73/100,73.0%).Blimp1蛋白在肿瘤中阳性表达26例(26/100,26.0%),反应性增生淋巴结中阳性表达20例(20/20,100.0%).PRDM1 mRNA 高表达58例(58/100,58.0%),其中 GCB 型22例(22/27,81.5%),non-GCB型36例(36/73,49.3%),两者之间差异有统计学意义(P=0.004).同时,在mRNA水平,PRDM1在不同免疫分型、血清乳酸脱氢酶(LDH)水平、B症状、原发部位等临床病理参数表达有差异,C-MYC在性别、国际预后指数(IPI)评分、血清 LDH水平之间表达有差异, PRDM1与C-MYC 具有显著相关性(χ2=7.648,P=0.006).沉默两个细胞系中 PRDM1基因后, RT-PCR和Western blot结果显示在OCI-LY1细胞系中C-MYC基因和蛋白在转染组表达较空白对照组及阴性对照组表达上调.结论 在DLBCL中PRDM1基因失活所致的C-MYC基因表达上调可能是DLBCL发生的一个重要因素,为相关研究提供实验证据.同时,PRDM1蛋白及mRNA和免疫分型相关,PRDM1 mRNA是提示不良预后的标志.

目的 探索LIMK1(LIM Kinase1)基因表达上调对人成骨肉瘤细胞耐药的影响,分析其可能的机制.方法 应用阳离子脂质体介导的方法,将含有LIMK1激酶活性的重组质粒CFP-LIMK1-WT cDNA按不同浓度梯度瞬时转染人骨肉瘤细胞MG63,通过RT-PCR验证转染效率;采用CCK-8法检测上述细胞对不同浓度长春新碱的耐药情况,并通过Multi Experiment Matrix(MEM)和The Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery(DAVID)数据平台筛选LIMK1共表达基因及其富集信号通路,分析可能的耐药机制.结果 随着转染浓度梯度增加,LIMK1及multidrug resistance protein 1(MDR1)基因表达呈明显上调趋势,人骨肉瘤细胞MG63的耐药程度增强.LIMK1及其共表达基因主要富集的信号通路有Rap1 signaling pathway、TNF signaling pathway等.结论 LIMK1基因表达上调促进人骨肉瘤细胞耐药,上述作用可能通过Rap1 signaling pathway、TNF signaling pathway等信号通路来调节.

目的:探讨 miR-21对白血病 K562细胞增殖凋亡的影响及对 PI3K/AKT信号通路的调控作用.方法:将K562细胞分为对照组、miR-21 NC组和miR-21干扰组,对照组不做处理,后两组采用阳离子脂质体LipofectamineTM2000转染miR-21 inhibitor和miR-21 negative control.转染48 h后,利用实时荧光定量(qRT-PCR)检测各组细胞中miR-21 mRNA的表达情况,采用MTT比色法检测miR-21对细胞增殖率的影响,流式细胞仪检测miR-21对细胞周期和凋亡率的影响,蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测miR-21对各组细胞中PI3K/AKT信号通路相关蛋白PI3K、AKT和p-AKT表达的影响.结果:miR-21干扰组中细胞的miR-21 mRNA表达水平和细胞的存活率较对照组和miR-21 NC组均明显降低;与对照组和miR-21 NC组比较,流式细胞仪检测miR-3干扰组中G0/G1期所占细胞比例明显升高,S期细胞所占比例明显下降,细胞的凋亡率明显升高.Western blot检测p-AKT的表达水平较对照组和miR-21 NC组明显下降,但PI3K和AKT蛋白的表达水平变化不大.结论:下调miR-21能够抑制白血病K562细胞的增殖,促进其凋亡,其作用机制可以与抑制PI3K/AKT信号通路有关.

DNA甲基化是一种非常重要的表观遗传修饰,在基因的表达调控、基因组的稳定性和发育过程中都发挥着重要的作用[1].DNA甲基化的维持由 DNA甲基化转移酶家族成员DNA甲基转移酶1(DNMT1)催化完成.DNA甲基化水平的改变,通常与DNMT1密切相关[3-4].而Lipofectamine2000是一种常用的阳离子脂质体转染试剂,广泛地应用于特定基因的表达和敲低对细胞影响的研究.而阳离子脂质体对细胞有一定的毒性作用[5].转染试剂Lipofectamine2000会影响细胞中DNMT1的表达,Lipofectamine2000对细胞的毒性作用可能是通过DNMT1实现的.因此本研究通对DNMT1在Lipofectamine2000处理Hela和395-9B-1(小鼠胚胎成纤维细胞)细胞不同时间后的表达情况进行检测,并探讨 Lipo-fectamine2000对细胞的毒性作用.