目的:制备麦胚凝集素(WGA)修饰的长春瑞滨(VRB)阳离子脂质体(WGA-VRB阳离子脂质体),优化处方并进行细胞毒性试验.方法:以磷脂、胆固醇为辅料,以3β-[N-(N'-N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐(DC-Chol)为阳离子材料,以二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)为长循环链,采用薄膜分散法及硫酸铵梯度法制备WGA-VRB阳离子脂质体.以包封率为指标,采用星点设计-响应面法优化处方中DC-Chol、胆固醇和VRB用量.测定所制VRB脂质体和 WGA-VRB阳离子脂质体中VRB含量,比较二者和空白阳离子脂质体作用于人乳腺癌细胞MCF-7和人非小细胞肺癌细胞A549后对细胞存活率的影响.结果:5 mL WGA-VRB阳离子脂质体的最优处方为磷脂22 mg、胆固醇12 mg、DC-Chol8 mg、VRB0.5 mg,其包封率为(92. 24±1. 21)％(n=3),与预测值的相对误差为5. 3％.VRB脂质体和WGA-VRB阳离子脂质体中VRB含量分别为(96. 01±3. 26)、(93. 39±1. 59) μg/mL(n=3);与空白阳离子脂质体和VRB脂质体比较,WGA-VRB阳离子脂质体可明显降低MCF-7、A549细胞的存活率(P<0. 05).结论:成功制得WGA-VRB阳离子脂质体,其对MCF-7、A549细胞存活的抑制作用强于VRB脂质体.

目的:为加强对新型阳离子脂质体的开发与应用提供参考.方法:以"基因传递""新型阳离子脂质体""阳离子脂质材料""表面修饰""Gene transfer""New cationic liposomes""Cationic lipid material""Surface finish"等为关键词,组合查询2005年1月-2018年3月在中国知网、万方数据、维普网、PubMed、ScienceDirect等数据库中相关文献,对介导基因传递的新型阳离子脂质体进行论述.结果与结论:共检索到相关文献429篇,其中有效文献36篇.目前新型阳离子脂质体主要通过采用新型阳离子脂质材料、进行表面修饰和改进制备方法研制得到.近年来主要包括以酒石酸为骨架合成、基于胆固醇和其他新型阳离子脂质材料如寡肽制备的新型阳离子脂质材料.阳离子脂质体结构表面易于修饰,其靶向特异性差导致基因传递率低,因此可使用不同物质如非表面活性剂及聚乙二醇等多聚阳离子和其他物质如聚乙二醇进行表面修饰以提高基因传递率,也可通过对特定部位的抗体和蛋白等偶联进行表面修饰,从而提高靶向传递基因率;且经表面修饰后的阳离子脂质体还可解决对特定部位靶向特异性差的问题.目前阳离子脂质体改进的制备方法包括改进的乙醇注入法、高压均质法、薄膜-冻融法、二氧化碳超临界法、真空干燥-超声法、薄膜-挤出法、薄膜-冻干法和小单室脂质体融合法等,可制备不同粒径阳离子脂质体并应用于工业化生产.目前新型阳离子脂质体制备趋向于多种技术联合,因此如何通过更深入的研究阳离子脂质体基因传递机制和临床治疗要求等方面从而合成新型阳离子脂质体以及怎样进一步用于临床是今后的重点方向.

核酸药物血清稳定性差、难以跨膜及脱靶效应明显等问题严重限制了其在临床上广泛应用.十几年来,核苷(酸)类脂质材料倍受重视,但一直未能实现包载寡核苷酸类药物转染入胞.药学院天然药物及仿生药物国家重点实验室张礼和院士/杨振军教授研究团队设计合成了一系列以胞嘧啶/胸腺嘧啶为头部,以油醇甘油醚为疏水尾链,以酯键或酰胺键链接的中性脂材DXBAs(DOTA,DNTA,DOCA,DNCA),其以氢键及π-π堆积作用与核酸类药物进行识别与结合.

目的 反义核酸是一段与靶基因互补的单链寡核苷酸序列,通过与细胞内核酸杂交成双链结构抑制靶基因转录和翻译过程,从而调控基因表达.然而,无载体递送反义核酸跨膜能力较差且寡核苷酸磷酸二酯键易被核酶水解.为提高反义核酸入胞效率,并对活性作用的发挥进行进一步优化,本课题主要从寻求高效低毒的载体系统及优化修饰策略入手对其进行研究.方法 本研究利用中性胞苷脂材(DNCA)混合阳离子脂质体(CLD)对反义核酸G3139包载递送,结合部分位点磷硫代(PS)修饰方式,考察不同修饰位点的序列活性与作用机制.结果 与结论 采用混合脂材包载能显著提高反义核酸G3139的抗MCF7/ADR细胞增殖能力,并发现9 ～16位(5'-端计算)区域内多位点(≥4)修饰物抗肿瘤活性较高.此外,G3139部分位点PS修饰物有效激活RNase H降解靶mRNA,并降低杂交双链Tm(DNA的熔解温度)值.结合转录组学与蛋白组学研究,确证减少PS修饰位点数可以降低反义核酸与非特异性靶标结合,从而降低毒副作用.

本文制备了人工外泌体,共传递蛋白和核酸,实现多组分药物高效安全共传递.采用阳离子脂质赋形剂二油酰基三甲基铵丙烷(dioleyl trimethylammonium propane,DOTAP)修饰聚乳酸-羟基乙酸共聚物(polylactic acidglycolic acid copolymer,PLGA)基质来设计优化的制剂,双乳化法制备包裹蛋白和核酸的PLGA/DOTAP纳米粒,再用逆相蒸发法制备最外层的膜结构,此膜结构由二棕榈酰磷脂酰胆碱(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,DPPC)、二油酰磷脂酰胆碱(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,DOPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(1,2-distearoylsn-glycero-3-phosphocholine,DSPC)、胆固醇及膜蛋白组成,通过超声分散和挤出的方式形成人工外泌体结构,并分析其物理特性和传递效果性质.结果 表明,人工外泌体粒径约为156.13 nm,带负电荷(-18.23±0.57 mV),能高效共传递蛋白和siRNA,且siRNA能高效抑制目标基因Trim 28的表达.这说明人工外泌体模拟了外泌体结构,实现了多组分药物安全高效的共递送.

目的 制备槲皮素与microRNA-150 (mR150)共载阳离子固体脂质纳米粒(Que/mR150 SLNs),考察其制备工艺,并评价其体外释放、细胞摄取能力以及眼部给药安全性.方法 采用薄膜分散法制备包载槲皮素的阳离子固体脂质纳米粒(Que-SLNs),以平均粒径、多分散指数(PDI)、包封率为指标,优化其制备工艺;采用静电吸附法将mR150共载于纳米粒中,制备Que/mR150 SLNs,通过琼脂糖凝胶电泳实验考察纳米粒对miRNA的吸附效率;并考察Que/mR150 SLNs中槲皮素的体外释药性能;采用MTT法测定Que/mR150 SLNs对人脐静脉血管内皮细胞HUVEC增殖的影响,并对其进行荧光标记,观察其在HUVEC细胞中的摄取情况;并通过兔眼病理组织切片考察Que/mR150 SLNs对兔眼的刺激性.结果 经过工艺优化,制得的阳离子纳米Que-SLNs载药性、粒径分布、稳定性均较好,其外观呈类球形,放置2个月能保持稳定,槲皮素包封率为(85.25±1.29)％,载药量(1.67±0.02)％,平均粒径(110.00±2.10) nm,Zeta电位(53.20±5.12) mV;体外药物释放结果表明,槲皮素在纳米粒中释放较缓慢,48 h内累积释放量约(80.69±1.29)％;在不同阳离子材料双十八烷基二甲基溴化铵与mR150的质量比(DDAB/RNA)为6∶1时,阳离子固体脂质纳米粒可基本将mR150包载完全,且对其粒径、电位影响较小;MTT实验表明,50～150mg/L的空白纳米质量浓度对HUVEC细胞无明显增殖毒性;细胞摄取实验表明,Cy5与香豆素6(coumarin-6,C6)双荧光标记共载纳米能有效进入HUVEC细胞;兔眼病理组织切片显示Que/mR 150SLNs多次给药对眼部角膜组织无明显损伤.结论 Que/mR150 SLNs固体脂质纳米粒制备工艺稳定可靠、重复性好、贮藏稳定性、生物安全性好,有利于高效递送槲皮素与mR150进入HUVEC细胞,为年龄相关性黄斑变性等血管增生相关疾病的治疗提供思路.

局部点药是眼部用药最常见的方式,但一般药物通过角膜困难,药物生物利用度低.纳米载体药物于80年代开始用于眼部,脂质体和类脂质囊泡(niosomes)与眼表的黏蛋白相互作用,延长药物在眼表的停留时间.纳米乳剂(nanoemulsion)的表面活性剂可以松解角膜上皮细胞紧密连接,形成转运开口,抑制细胞表面糖蛋白酶P(glycoprotein P,Pgp)降解药物活性蛋白.纳米粒子(nanoparticles)通过角膜上皮和结膜上皮而不会引起毒性.纳米胶囊(nanocapsules)更深地内化到角膜上皮(50μm处).聚合物胶束(polymeric micelles)自组装成核-壳纳米载体增强药物渗透角膜的能力.阴离子高代聚酰氨基胺(poly-amidoamine,PAMAM)树枝状大分子增强药物通透性,中性和阳离子低代树枝状大分子通过网格蛋白途径介导药物更高的通透性.纳米晶体(nanocrystal),除增强药物溶解度和溶解速率之外,它的高黏附能力帮助药物保留和渗透到眼组织中.纳米结构材料与干眼关联密切,为干眼的治疗、诊断提供手段.

甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)注射给药的半衰期短,毒副作用大.为了改善MTX注射给药的缺陷,本研究将MTX装载在交联环糊精金属有机骨架(crosslinked cyclodextrin metal-organic framework,COF)中,得到载药微粒MTX@COF,采用溶剂蒸发法将阳离子脂质材料(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺[(2,3-dioleyl-propyl)-trimethylamine,DOTAP]包裹在MTX@COF表面,MTX@COF@DOTAP的微粒形态没有显著改变,但具有不同的表面电荷特征.以水和磷酸盐缓冲液(pH 7.4)为释放介质考察缓释微粒的体外释放,并通过大鼠药代动力学评价其体内释放特征.体外释放结果显示,在水中MTX、MTX@COF和MTX@COF@DOTAP于6h的累积释放量分别为92.70％、36.31％和18.19％;在磷酸盐缓冲液中MTX、MTX@COF和MTX@COF@DOTAP于4h的累积释放量分别为90.82％、79.37％和58.30％,表明MTX@COF可显著延缓MTX的释放,经DOTAP修饰后的MTX@COF可进一步延缓MTX的释放.大鼠药代动力学研究结果显示,皮下注射MTX@COF@DOTAP组与MTX@COF组及MTX组相比,其平均滞留时间MRT(0-t)和达峰时间Tmax明显延长,且MTX@COF@DOTAP组的药时曲线下面积[AUC(0-t)]是MTX组的1.8倍.本研究制备的MTX@COF@DOTAP微粒经皮下注射给药具有一定的缓释效果,并提高了MTX的生物利用度,为MTX的新剂型开发提供一个新的思路.

非病毒载体在基因治疗中的应用前景较广.非病毒载体经过化学结构修饰后,可将DNA、mRNA及siR?NA等外源核酸递送到受体靶细胞或者靶器官,提高载体的转染效率、细胞靶向性.非病毒载体根据物理和化学结构可分为脂质体、阳离子聚合物、金纳米粒、多肽及蛋白质、壳聚糖等.脂质体具有无免疫原型、可生物降解及降低药物不良反应等优点,经过结构修饰后载体转染效率较高.阳离子多聚物是目前基因治疗领域应用最多的聚合物之一,具有灵活易修饰的优点,可与核酸形成复合物,防止核酸酶的降解.金纳米粒是一种无机纳米材料,可稳定吸附蛋白质,基于金纳米粒的载体转染效率高、细胞毒性低.多肽及蛋白质可分为具有荧光免疫标记的非病毒载体、靶向的非病毒载体、核定位的非病毒载体等多种类型,载体转染效率及细胞靶向性均较高,且细胞毒性低,壳聚糖具有稳定性、生物降解性和生物相容性等优点,还可以通过结构修饰、改造,使其转染更加安全、高效.本文将总结常见的非病毒载体在心血管疾病基因治疗中的应用.

目的 制备叶酸修饰蟾毒灵阳离子脂质体(FA-BF-CLs),并对其进行质量评价及抗肝癌研究.方法 采用薄膜-超声分散法制备FA-BF-CLs,以粒径、Zeta电位及包封率等为指标,采用单因素和Box-Behnken响应面分析法对处方及工艺进行优化.透射电镜观察脂质体显微形态,并考察其体外释放过程、溶血性及空白阳离子脂质体体外细胞安全性.采用CCK-8法比较FA-BF-CLs、BF-CLs(未加叶酸修饰的蟾毒灵阳离子脂质体)及BF-solution(蟾毒灵溶液)的体外细胞毒性.结果 最佳条件为磷脂与药物质量比14.17:1、磷脂与胆固醇质量比3.8:1、超声时间13 min,制备得到脂质体粒径(135.5±1.40)nm,多分散系数0.192±0.025,Zeta电位(16.23±0.46)mV,包封率69.42％±2.18％.体外释放研究表明,FA-BF-CLs具有明显的缓释效果,溶血试验结果显示该载体材料无溶血现象.体外细胞安全性结果显示阳离子脂质体浓度在0～20μmol/L范围内安全无毒.体外细胞毒性表明FA-BF-CLs对HepG2肝癌细胞的抑制作用大于BF-CLs和BF-solution(P<0.0.1).结论 制备得到的FA-BF-CLs外观均一稳定、具有缓释性能,空白阳离子脂质体安全无毒,FA-BF-CLs具有更强的体外抗肝癌研究,可用于进一步的研究.