目的 探索蟾毒灵通过Janus激酶2(JAK2)/信号转导子和转录激活子3(STAT3)通路抑制结直肠癌增殖、迁移和侵袭的机制研究.方法 将人结直肠癌HT29细胞随机分为对照组和低、中、高剂量实验组;对照组细胞不做处理,低、中、高剂量实验组细胞分别给予2.5、5.0、10.0 μmol·L-1的蟾毒灵处理48 h.用FLAG STAT3慢病毒感染HT29细胞后,细胞分为慢病毒感染组、高剂量实验+慢病毒感染(10.0μmol.L-1)组.用细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测细胞存活率;用克隆实验验证细胞增殖率;用Transwell实验验证蟾毒灵作用后细胞的迁移能力;用蛋白质印迹(Western blot)法检测慢病毒转染效率以及细胞相关蛋白表达情况.结果 药物作用48 h后,对照组和低、中、高剂量实验组细胞数分别为(1 003.25±255.53)、(698.00±152.25)、(562.13±31.56)和(449.50±82.40)个,侵袭细胞数分别为(932.00±188.84)、(742.22±108.64)、(514.67±124.82)和(343.56±86.42)个,p-JAK2蛋白相对表达水平分别为1.37±0.27、0.97±0.06、0.74±0.06 和 0.39±0.12;对照组、高剂量实验组、慢病毒感染组、高剂量实验+慢病毒感染组细胞数分别为(906.88±211.71)、(389.00±143.08)、(1 279.38±210.34)和(604.75±12.52)个,侵袭细胞分别为(671.22±44.74)、(246.11±28.16)、(1 080.78±119.13)和(574.78±16.23)个.中、高剂量实验组的细胞增殖数量、细胞侵袭数量和p-JAK2蛋白相对水平与对照组比较,在统计学上差异均有统计学意义(均P＜0.05);高剂量实验组、慢病毒感染组、高剂量实验+慢病毒感染组细胞增殖数量、细胞侵袭数量与对照组比较,在统计学上差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 蟾毒灵可通过激活JAK2/STAT3信号通路抑制结直肠癌增殖、迁移和侵袭.

目的 探究蟾毒它灵(Bufotalin)对急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)细胞HL-60铁死亡的作用及机制.方法 用不同浓度(0.1、0.5、1.0、2.0、4.0 μg·mL-1)蟾毒它灵分别作用于APL细胞HL-60,使用光学显微镜观察细胞的形态学变化;采用CCK-8法检测细胞的存活率情况;采用Western blot法检测细胞中铁死亡相关蛋白CD71、xCT、FTH 1、GPX4的表达水平;采用谷胱甘肽(GSH/GSSG)检测试剂盒检测细胞内GSH和GSSG的含量变化;采用脂质氧化(MDA)检测试剂盒测定细胞内MDA的含量变化.将0.5 μg·mL-1蟾毒它灵、0.1 μmol·L-1 Fer-1和0.5 μg·mL-1蟾毒它灵+0.1 μmol·L-1 Fer-1分别作用于HL-60细胞,使用光学显微镜观察细胞形态学变化,并用Western blot法检测铁死亡相关蛋白的表达水平.结果 不同浓度蟾毒它灵处理HL-60细胞后,细胞形态呈现出哑铃型、梭形等不规则形状,细胞的存活率降低,且呈时间-剂量依赖关系.与对照组相比,蟾毒它灵可降低铁死亡相关蛋白GPX4、xCT、FTH 1的表达水平和总谷胱甘肽的含量(均P＜0.01),升高CD71蛋白的表达水平和MDA含量(均P＜0.05).蟾毒它灵与铁死亡抑制剂Fer-1联合处理HL-60细胞后,与对照组比较,HL-60细胞的生长数量和形态学无明显变化,CD71、xCT、FTH1、GPX4蛋白表达水平的差异也无统计学意义(均P＞0.05).结论 蟾毒它灵可抑制APL细胞HL-60的增殖并诱导铁死亡,其可能通过GPX4介导的抗氧化途径和铁代谢途径实现.

目的 基于网络药理学结合指纹图谱与多元统计分析预测蟾皮质量标志物.方法 基于文献分析定位蟾皮质量标志物范围来源,通过网络药理学筛选蟾皮中药效相关成分,结合指纹图谱和多元统计分析筛选出影响蟾皮批次间差异性成分,将药效成分与特征差异性成分关联,预测质量标志物,并进行分子对接验证和含量测定.结果 蟾皮质量标志物为沙蟾毒精、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、蟾蜍噻咛,能与主要抗肿瘤靶点稳定结合,其含量在多批次样品间具有一定差异,其中沙蟾毒精、蟾蜍噻咛整体较高,华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基整体较低.结论 沙蟾毒精、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、蟾蜍噻咛为蟾皮抗肿瘤作用的质量标志物.

目的:在乏氧微环境中探讨蟾毒灵(bufalin,BU)抑制耐药结肠癌细胞诱导M2 型巨噬细胞极化对普通结肠癌细胞的作用.方法:培养基中加入氯化钴(cobalt chloride,CoCl2)模拟乏氧环境,佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)诱导人源单核细胞THP-1 分化为M0 巨噬细胞.分别采集乏氧条件下耐药结肠癌细胞、普通结肠癌细胞和BU作用于耐药结肠癌细胞的条件培养基(conditioned medium,CM),然后放入M0 巨噬细胞中.通过流式细胞术、Realtime PCR、ELISA 实验检测M2 型巨噬细胞极化标志因子的表达;运用CCK-8 和蛋白免疫印迹(western blot,WB)实验检测耐药结肠癌和普通结肠癌条件培养基诱导M2 型巨噬细胞极化后的上清对普通结肠癌的作用.结果:在缺氧环境下,与普通结肠癌细胞相比,耐药结肠癌细胞CM促进M2 型巨噬细胞标志物IL-10、TGF-β、CD11b、CD206 升高(P<0.01,P<0.05).极化巨噬细胞的上清液增加了普通结肠癌细胞中P-gp和Bcl-2 的表达,同时降低了Bax的表达和对奥沙利铂的敏感性.耐药结肠癌细胞经BU处理后,M2 型巨噬细胞标志物IL-10、TGF-β、CD11b、CD206 表达降低(P<0.01,P<0.05).此外,P-gp和Bcl-2 的表达减少,而Bax的表达增加,导致对OXA的敏感性增加.结论:乏氧条件下,结肠癌耐药细胞CM促进M2 型巨噬细胞极化,蟾蜍灵可通过调节M2 型巨噬细胞极化过程逆转结肠癌耐药.

目的 观察蟾毒灵联合索拉非尼对肝癌HepG2细胞增殖、迁移及侵袭能力的干预作用及对Ras同源基因蛋白A(RhoA)/含Rho关联卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)/缺氧诱导因子1α(HIF1α)通路相关蛋白表达的影响.方法 取对数生长期的肝癌HepG2细胞,分别加入蟾毒灵、索拉非尼单药或联合处理24 h,CCK-8方法检测细胞增殖情况,明确后续实验药物干预浓度;将肝癌HepG2细胞分为空白对照组、蟾毒灵组、索拉非尼组、蟾毒灵联合索拉非尼组,空白对照组不进行任何处理,其余组加入相应药物培养24 h,观察肝癌HepG2细胞增殖、迁移及侵袭情况,West-ern blot 法检测RhoA/ROCK/HIF1α通路相关蛋白表达情况.结果 蟾毒灵、索拉非尼均可抑制肝癌HepG2细胞增殖,选择蟾毒灵4 μg/mL、索拉非尼20 μmol/L为后续实验干预浓度.各药物组肝癌HepG2细胞的迁移与侵袭率和索拉非尼组、蟾毒灵联合索拉非尼组肝癌HepG2细胞中RhoA、ROCK1、ROCK2、HIF1α蛋白相对表达量均明显低于空白对照组(P均＜0.05),且蟾毒灵联合索拉非尼组肝癌HepG2细胞的迁移与侵袭率和各蛋白相对表达量均明显低于蟾毒灵组和索拉非尼组(P均＜0.05).结论 蟾毒灵联合索拉非尼可通过调控RhoA/ROCK/HIF1α通路加强对肝癌HepG2细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用,可能是两者联合使用抑制肝癌复发转移的潜在机制.

目的 基于网络药理学和分子对接研究华蟾素治疗胃癌的作用机制.方法 通过药物靶点预测网站获得华蟾素成分靶点,疾病数据库获取胃癌疾病基因,将两者共同靶点进行GO功能富集分析及KEGG通路分析,Cytoscape软件构建蛋白互作(PPI)网络和药物-靶点-疾病相互作用网络.通过Kaplan-Meier分析关键靶点与胃癌预后的相关性,分子对接分析华蟾素成分与关键靶点的结合情况,最后筛选出核心靶点,并通过TCGA、GEO数据库进行单因素、多因素Cox回归分析以验证其与胃癌预后的关系.结果 华蟾素治疗胃癌涉及 70 个靶点、1 399个生物学过程、75 个分子功能、145 条信号通路,通过药物-靶点-疾病相互作用网络筛选出关键化合物 5 个、关键靶点 10 个,其中与胃癌预后相关的有 7 个.华蟾素主要成分与胃癌关键靶点间有较好的结合活性,核心靶点为EGFR、MAPK3、ALB,与胃癌预后密切相关.结论 华蟾素治疗胃癌的关键成分为华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾酥毒基、蟾蜍色胺C、蟾毒灵,它们可能通过多靶点、多途径来发挥作用.

蟾酥作为临床常用的动物药材,广泛用于心血管疾病、风湿和恶性肿瘤疼痛的治疗.因其具有高活性和高毒性的特点,关注蟾酥制剂中蟾酥药味的质量控制,对于保障临床用药的安全有效至关重要.通过梳理我国药品标准收载的蟾酥制剂情况,明确已批准上市的蟾酥制剂有 102 种 474 个批号,其中《中国药典》2020 年版收载 14 种,《中华人民共和国卫生部药品标准》收载 68 种.这些制剂中,蟾酥多以原粉入丸、散剂,功能主治主要集中在清热解毒、消肿止痛、益气活血、开窍醒脑等方面.除了 2020 年版《中国药典》收载的蟾酥制剂中蟾酥药味的质量控制水平相对较高以外,其他蟾酥制剂中蟾酥药味的质控标准均较低,甚至缺失,亟需进行蟾酥制剂的质量标准提升研究.进一步检索中国知网(CNKI)、PubMed、Web of Science,对国内外报道的蟾酥制剂的质量评价研究和质量控制现状进行归纳总结,有 64 种蟾酥制剂报道了定性定量分析方法,主要有薄层鉴别、HPLC指纹图谱和多成分含量测定,指标成分涉及日蟾毒它灵、沙蟾毒精、蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基等主要的蟾蜍甾类成分.综合文献信息,提示在完善蟾酥制剂质量标准过程中,需要关注蟾酥药材、饮片和制剂分析方法和检测指标的关联性,加强吲哚生物碱类成分的监控,以及重视含量均匀度检查等项目,以提升蟾酥制剂的整体质量控制水平.

目的 挖掘能催化蟾蜍内酯类化合物特异性羟化修饰的酶,以促进名贵中药材蟾酥功效组分的开发与应用.方法 采用同源序列比对挖掘藤仓赤霉菌(Fusarium fujikuroi)中的甾体羟化酶,通过毕赤酵母异源表达、工程菌株细胞转化以及代谢产物的分离与鉴定,从而确定酶的功能.结果 以蟾蜍内酯类化合物蟾毒它灵、蟾毒灵为底物,毕赤酵母重组菌株KM71H-FF294转化蟾毒它灵没有产生明显的产物,而转化蟾毒灵时产生了羟化产物7β-羟基蟾毒灵.结论 从藤仓赤霉菌中发现能催化蟾毒灵发生7β-羟化修饰的甾体羟化酶FF294,是目前文献报道首个能催化蟾蜍内酯类化合物羟基化反应的酶.

目的 探索蟾毒灵对长春新碱所致的大鼠疼痛行为的影响及对脊髓内瞬时受体电位香草酸亚型 1(TRPV1)蛋白和星形胶质细胞活化的影响.方法 32 只SD雄性大鼠随机分为 4 组(n = 8):对照组(Control组)、长春新碱组(Vcr组)、长春新碱+蟾毒灵低剂量组(Vcr+Bufalin 0.25 mg·kg-1)、长春新碱+蟾毒灵高剂量组(Vcr+Bufalin 0.5 mg·kg-1).连续 10 d腹腔给予长春新碱(75 μg·kg-1)造模,治疗组连续10 d腹腔给予相应剂量的蟾毒灵.分别测定大鼠的热缩足潜伏期(TWL)和机械缩足反应阈(MWT).qPCR检测大鼠脊髓内trpv1、trpv4 mRNA的表达情况,Western blot法检测大鼠脊髓内TRPV1 蛋白表达情况.免疫荧光检测脊髓星形胶质细胞的活化情况.ELISA实验检测脊髓内肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)的表达水平.结果 蟾毒灵可以提高大鼠热痛阈值及机械痛阈值,降低大鼠脊髓内TRPV1 蛋白表达水平,并可抑制长春新碱诱导的脊髓内星形胶质细胞的活化,降低TNF-α、IL-1β的过表达.结论 蟾毒灵可缓解长春新碱诱导的大鼠神经病理性疼痛,并可降低脊髓TRPV1蛋白的过表达及抑制星形胶质细胞活化和炎性反应.

目的 建立超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱法快速定性定量检测中毒患者食用剩余蟾蜍皮中8种蟾蜍毒素.方法 样品经甲醇提取后,待测液经过A CQUITY UPLC? HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)分离,以0.1％甲酸水溶液为流动相A、甲醇为流动相B进行梯度洗脱,流速0.3mL/min,柱温35℃,进样量2 μL,经ESI正离子模式采集.结果 在10.0～1 000.0 μg/L范围内8种毒素线性关系良好,r2r均≥0.990;检出限为0.7～2.1 μg/kg,定量限为2.5～7.0 μg/kg;三水平加标平均回收率均≥75.79％,相对标准偏差(RSD)均≤9.84％.样品中检测出蟾毒灵、去乙酰华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、伪异沙蟾毒精、蟾毒它灵,含量分别为123.8±3.1、5 920.4± 1.9、680.7±3.2、671.6±9.1、1 796.6±74.9 μg/kg,和蟾蜍他灵、华蟾毒精与华蟾毒它灵均未检出.结论 该方法同时测定蟾蜍毒素中华蟾毒精、蟾毒灵、伪异沙蟾毒精、蟾毒它灵、去乙酰华蟾毒它灵、去乙酰华蟾毒精、和蟾蜍他灵、华蟾毒它灵,有较强实用性、快速、可靠.