基于质谱技术的蛋白质分析已成为一种强大的临床实验室工具，相较于传统方法，它提供了更可靠的评估途径，为疾病的诊断和治疗带来更多益处。针对靶向蛋白的定量分析已广泛应用于胰岛素样生长因子1、甲状腺球蛋白和单克隆抗体药物等领域。同时，非靶向质谱蛋白分析也取得重大进展，如淀粉样变性、单克隆免疫球蛋白疾病和膜性肾病的诊断。高分辨质谱技术使得致病蛋白得以鉴定和鉴别，同时揭示了参与疾病发病和进展的新蛋白质。因此，临床诊断和疾病鉴别得到改进，对这些疾病的认识也得到提高。

目的:探究以成纤维细胞生长因子受体(FGFR)非对称二聚化模型为结构基础设计成纤维细胞生长因子19(FGF19)的非促肿瘤型改构体,并对其增殖活性和代谢活性进行评估,使其成为治疗胆汁淤积症的候选药物之一.方法:利用pymol软件分析蛋白晶体结构并设计FGF19改构体,将构建好的FGF19改构体(FGF19F159A)与FGF19野生型(FGF19WT)的质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中,经过诱导表达、变性、复性获得正确构象的蛋白,经过镍柱亲和层析与分子排阻色谱方法纯化得到目的蛋白;通过蛋白邻位连接技术(PLA)对比FGF19WT和FGF19F159A诱导受体二聚化的程度;MTT实验检测细胞增殖活性;Western blot实验检测磷酸化成纤维细胞生长因子受体底物2(P-FRS2)、磷酸化细胞外调节蛋白激酶(P-ERK)、胆固醇7α-羟化酶(Cyp7Al)的蛋白表达水平;免疫组化法检测动物肝脏中促增殖指标Ki67和增殖细胞核抗原(PCNA)的蛋白表达水平;RT-qPCR法检测动物肝脏中肿瘤指标甲胎蛋白(AFP)、细胞周期蛋白A2(CCNA2)、表皮生长因子受体(EGFR)的相对mRNA水平;质谱法测定肝脏中胆酸(CA)、脱氧胆酸(DCA)、熊去氧胆酸(UDCA)、鹅去氧胆酸(CDCA)的含量;以db/db小鼠为模型,连续给药1个月,监测药物的慢性降糖效果,糖耐量实验检测其对糖耐量的改善能力.结果:以蛋白结构为基础成功构建了 FGF19F159A,经过表达纯化得到了高纯度的目的蛋白;PLA结果显示,与FGF19WT组相比,FGF19F159A诱导受体二聚化的能力明显减弱(P＜0.01);MTT实验显示,与FGF19WT组相比,FGF19F159A的促增殖活性明显减弱(P＜0.05);Western blot实验表明,与FGF19WT组相比,FGF19F159A明显下调P-FRS2和P-ERK的蛋白表达水平(P＜0.05);免疫组化结果显示,与FGF19WT组相比,FGF19F159A组Ki67和PCNA的蛋白表达水平显著降低(P＜0.01);与FGF19WT组相比,FGF19F159A组AFP、CCNA2、EGFR的mRNA水平明显降低(P＜0.01);与FGF19WT组相比,FGF19F159A组肝脏中Cyp7Al的蛋白表达水平,胆汁酸CA、DCA、UDCA、CDCA的含量差异无统计学意义(P＞0.05);与FGF19WT组相比,FGF19F159A组的降糖能力和改善糖耐量的能力差异无统计学意义(P＞0.05).结论:基于FGFR非对称二聚化模型设计的FGF19改构体FGF19F159A能够在极大减弱细胞增殖活性的同时保留其代谢活性,有望成为治疗胆汁淤积症的候选药物.

糖基化是蛋白质最重要的翻译后修饰之一,能够调控蛋白质的电荷态、结构及分子间相互作用等,进而影响其功能.糖基化的高度异质性导致传统的结构解析方法很难对糖蛋白进行全面表征.随着分析技术的发展,质谱在糖蛋白结构解析中发挥了重要作用.蛋白质组学质谱技术可在多肽水平上对复杂、低丰度蛋白质糖基化修饰的化学组成与位点信息进行鉴定.非变性质谱技术(native mass spectrometry,nMS)则直接在完整蛋白水平上揭示聚糖异质性及其对蛋白高级结构和相互作用的调控效应.作为结构质谱的代表性技术,基于离子淌度的nMS受益于离子淌度仪的构象分辨能力和构象去折叠功能,能够在非变性质谱的基础上提供离子的三维动态结构信息,为异构体结构快速鉴定提供不可替代的解决方案.本文重点介绍了两种新兴离子淌度质谱技术,即非变性动态构象分辨质谱技术和糖型分辨结构质谱技术,并以3种常见蛋白体系为例,介绍其在糖蛋白构象研究领域的最新进展.

腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)是一种基因治疗中常用的病毒载体.由于其安全性较高且能够靶向多种细胞,在临床前和临床研究中得到了较多的应用.不过在设计和生产的过程中,AAV载体有着诸多会影响其安全性和疗效的关键质量属性.生物质谱技术的发展和应用为生物大分子的研究提供了一个便捷的平台,尤其是在蛋白质序列、结构和相互作用方面.对于AAV载体而言,质谱技术可以实现衣壳蛋白比率、翻译后修饰、血清型、空衣壳比率的测定或表征,从而协助对AAV载体的质量控制.与现有方法相比,质谱技术具有样品需求量少、分析快速灵敏、适用于完整AAV载体的分析和质量分辨率高的优点,并且可以区分空衣壳、满衣壳和部分包封的衣壳.未来,通过将更加高效的蛋白质分离技术与质谱技术联用、开发新的信息处理软件平台和新的质谱检测方法,质谱技术有望在AAV载体的设计和生产中发挥更加重要的作用.

目的 使用蛋白质组学技术研究高脂饮食诱导下小鼠肾脏组织蛋白质的差异性表达.方法 22只雄性C57BL/6小鼠分为对照组(正常饮食,脂肪供能占比10％)、高脂组(高脂饮食,脂肪供能占比60％),每组11只,连续饲养24周.处死小鼠并眼眶取血,检测TC、TG、血糖(BG)、血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)等指标.收集肾脏组织并采用HE染色、糖原染色(PAS)和电子显微镜观察病理改变.提取肾脏组织总蛋白,使用质谱仪检测并分析两组小鼠肾脏组织中的差异表达蛋白(DEPs),采用4D非标记定量蛋白质组学技术,以差异倍数＞1.5(上调)或＜1/1.5(下调)且P＜0.05为标准筛选DEPs,对DEPs作功能注释和富集分析,通过蛋白质互作网络分析筛选核心蛋白.结果 高脂组体质量、TC、TG、BG、Scr、BUN水平均显著高于对照组(均P＜0.05).与对照组相比,高脂组肾小球体积稍大,系膜细胞和基质节段性略多,鲍曼囊壁层增厚,肾小管上皮细胞空泡变性明显.电镜检查显示高脂组小鼠足突部分融合,线粒体明显肿胀、畸形、大小不一,溶酶体样结构增多并出现自噬体.两组共鉴定出93种DEPs,其中上调蛋白49种,下调蛋白44种;DEPs主要参与脂质及碳水化合物的运输和代谢途径,显著富集的通路有过氧化物酶体和溶酶体相关通路以及初级胆汁酸生物合成、类固醇激素生物合成、肾素-血管紧张素系统等.与高脂诱导肾脏损害发生、发展密切相关的蛋白质主要有酰基辅酶A氧化酶2、载脂蛋白a4、植烷酰辅酶A羟化酶2、α-甲基酰基辅酶A消旋酶、载脂蛋白e、二羟基丙酮磷酸酰基转移酶、含胰蛋白酶域1.结论 高脂饮食诱导小鼠肾脏组织蛋白质发生改变,主要包括过氧化物酶体相关基质酶代谢通路.本研究为揭示脂质肾毒性提供了有价值的线索.

目的 构建高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝(NAFLD)大鼠模型,分析该模型大鼠肝脏的差异代谢物,探究NAFLD大鼠模型代谢特征.方法SPF级SD大鼠12只,雌雄各半,体重90～110 g,根据体重随机分为模型组和正常组.采用高脂饮食诱导法建立NAFLD大鼠模型,正常组给予普通维持饲料,模型组给予高脂饲料(配方为:78.8％基础饲料+10％猪油+10％蛋黄粉+1％胆固醇+0.2％胆酸钠),造模第8周取材,生化法检测谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)等指标;HE染色观察肝脏病理变化;运用高效液相色谱-质谱联用技术分析大鼠肝脏非靶向代谢物变化.结果 与正常组比较,模型组大鼠肝脏指数和肥胖指数显著升高(P＜0.05或0.01),血清TC、TG、LDL-C、ALT显著升高(P＜0.05或0.01),肝脏TC、TG、LDL-C显著升高(P＜0.01),HDL-C显著降低(P＜0.05).HE染色结果显示,模型组大鼠肝组织脂肪变性、气球样变和炎细胞浸润,NAS评分显著升高(P＜0.01).肝脏代谢组学共筛选出253个差异代谢物,获取了视黄醇代谢、不饱和脂肪酸的生物合成等代谢通路.结论 高脂饮食8周可成功建立NAFLD大鼠模型,其代谢组学变化涉及视黄醇代谢、不饱和脂肪酸的生物合成等多个代谢途径.

目的 对1例急性感染性腹膜炎继发毗邻颗粒链菌败血症患者进行菌种鉴定及临床资料分析.方法 采用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术、全自动微生物鉴定系统(Vitek 2 compact)、16S rRNA序列分析技术及API20 Strep结合细菌的菌体形态及生长特征等多种方法对1例毗邻颗粒链菌败血症患者进行菌种鉴定,并对临床资料进行分析.结果 MALDI-TOF-MS技术、Vitek 2 compact及16S rRNA均鉴定为毗邻颗粒链菌,可信度均为98％以上.而API20 Strep则出现没有可信的鉴定结果.结合菌落形态、生长特点及临床特征,最终鉴定为毗邻颗粒链菌.结论 毗邻颗粒链菌为兼性厌氧菌,具有形态多形性、染色可变性及生化特性的非典型性、在普通培养基上生长不良等特点,临床表现与大多数病原体引起的败血症无明显差异,常规方法鉴定困难.本研究结果表示MALDI-TOF-MS技术、Vitek 2 compact及16S rRNA三种方法均可将对毗邻颗粒连菌准确,而MALDI-TOF-MS技术对毗邻颗粒链菌的鉴定具有简便、快速、准确等特点.

目的 探讨分析血液3-羟基异戊酰肉碱(C5-OH)增高的遗传代谢病类型、代谢指标及临床表现,并通过受试者工作特征(ROC)曲线法,评价串联质谱(LC-MS/MS)技术非衍生法对C5-OH增高疾病诊断价值并建立本中心C5-OH的阈值.方法 选取确诊患儿20例为阳性组,正常健康儿童281例为正常对照组,通过LC-MS/MS测定血液C5-OH浓度,气相色谱质谱(GC-MS)检测尿液有机酸.同时绘制ROC曲线,确定C5-OH的最佳阈值.结果 确诊3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症6例,多种羧化酶缺乏症8例,甲基丙二酸2例,多种酰基辅酶A脱氢酶缺乏症1例,中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症1例,3-甲基戊烯二酸尿症1例,肝豆状核变性合并糖原贮积症Ⅸ1例.阳性组血液C5-OH浓度显著高于正常对照组,差异有统计学意义(P＜0.01);血液C5-OH ROC曲线下面积为0.937,最佳阈值为0.769 μmol/L,敏感度和特异度分别为95.00%、80.07%.结论 3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶和多种羧化酶缺乏症是临床上最常见的血液C5-OH增高的遗传代谢病,LC-MS/MS非衍生法具有较高的诊断价值,建立最佳阈值有利于提高疾病的诊断率.

目的:探讨祛湿化瘀方对高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝(NAFLD)模型大鼠血清游离脂肪酸谱的影响.方法:30只雄性SD大鼠按计算机随机数字表分为正常组、模型组、祛湿化瘀方组,每组10只.模型组和祛湿化瘀方组大鼠饲喂高脂饲料建立NAFLD模型,正常组大鼠饲喂普通饲料,持续8周;自第5周起,祛湿化瘀方组大鼠按0.1 mL/kg灌胃祛湿化瘀方药液,正常组和模型组大鼠灌胃等量生理盐水,连续给药4周.8周后处死大鼠,取肝组织样本,采用苏木精-伊红染色法观察肝组织病理学变化;取血清样本采用气相色谱-质谱联用技术,以水杨酸甲酯为内标进样测定,按标准曲线法计算血清中游离脂肪酸的含量.结果:与正常组比较,模型组大鼠肝组织多发坏死肝细胞,肝细胞出现脂肪样变性和空泡变性;血清中月桂酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸、花生酸、二十一烷酸、榆树酸等饱和脂肪酸含量均显著升高(P<0.05);顺-10-十七碳烯酸、油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、芥酸、亚油酸、顺-11-二十碳烯酸、花生四烯酸、顺-11,14,17-二十碳三烯酸、顺-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸(DHA)等不饱和脂肪酸含量均显著降低(P<0.05或P<0.01).与模型组比较,祛湿化瘀方组大鼠肝组织病理学变化程度明显减轻;血清中上述饱和脂肪酸含量均显著降低,不饱和脂肪酸含量均显著升高(P<0.05).结论:祛湿化瘀方干预能显著改善高脂饮食诱导的NAFLD模型大鼠的肝组织病理学变化,且能显著改善其血清中饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸含量的异常变化,调节紊乱的游离脂肪酸谱趋于正常.建议通过膳食补充ω-3多不饱和脂肪酸或采用祛湿化瘀方等药物干预脂肪酸代谢,从而有效预防和治疗NAFLD.

目的 探讨单个儿童肝病中心非病毒性肝病的疾病谱及变化趋势.方法 收集2011年1月—2017年12月在我院青少年肝病诊疗中心住院诊治的0～16岁儿童非病毒性肝病患者数据,统计并分析其在同期收治的儿童肝病患者中的占比、疾病谱及病种分布.并与1983年6月—2000年12月、2001年1月—2010年12月同类病例数据作比较.结果 2011年1月—2017年12月儿童非病毒性肝病患者占同期儿童肝病患者总数的23.30％(925/3967),较2001年1月—2010年12月的17.53％(703/4010)有所上升.2011年1月—2017年12月儿童非病毒性肝病疾病共72种,病例中以药物性肝损害(31.0％)最多,其次为肝豆状核变性(13.7％)和非酒精性脂肪性肝炎(11.0％);而2001年1月—2010年12月构成比前三名的疾病为肝豆状核变性(22.62％)、药物性肝损害(10.53％)和糖原累积病(9.53％).不同年龄段居于前三位的病种分别为,1岁以下:药物性肝损害(31.3％),糖原累积病(13.4％),胆汁淤积型肝病(11.9％).1～6岁:药物性肝损害(28.8％),肝豆状核变性(16.8％),糖原累积病(12.2％).7～16岁:药物性肝损害(32.9％),非酒精性脂肪性肝炎(19.8％),肝豆状核变性(12.5％).儿童非病毒性肝病重叠病毒性肝炎的发生率为11.6％(107/925),值得关注.7.8％(72/925)的儿童非病毒性肝病疑难病例通过基因检测等特殊检查得到确诊,但仍有2.9％(27/925)目前无法确诊.结论 近30年来儿童非病毒性肝病占比逐渐增多,药物性肝损害和非酒精性脂肪性肝病增长迅速.质谱基因检测技术的应用进一步扩展了疾病谱.