目的:探讨构建自交联重组胶原蛋白水凝胶的可行性及其对紫外线诱导的光老化模型修复作用。方法:2023年3—12月，于西北大学陕西省可降解生物医学材料重点实验室，使用不同浓度的重组胶原蛋白通过自交联制备重组胶原蛋白水凝胶，表征了水凝胶材料的物理机械性能，用MTT法、溶血试验检测水凝胶生物相容性；建立人皮肤成纤维细胞光老化模型，通过RT-qPCR检测炎症因子及ECM生成、降解相关基因表达量探究水凝胶分子水平改善光老化效果。建立紫外照射小鼠光老化模型，通过大体观察以评估水凝胶改善光老化效果，通过HE染色观察水凝胶的组织兼容性和降解性，通过RT-qPCR及免疫荧光染色探讨水凝胶作用机制。结果:4 mg/ml、20 mg/ml和40 mg/ml的GEL-Ⅰ水凝胶均表现出良好的物理机械性能。生物相容性研究显示不同浓度的水凝胶细胞存活率>100%，具有促细胞增殖作用，且与重组Ⅰ型胶原蛋白的浓度呈正相关；3组水凝胶溶血率均<5%。qPCR显示HSF光老化模型中，与模型组相比，3个浓度的水凝胶组细胞中Bcl-2和TGF-β1显著升高( P<0.05)，Caspase-3和Caspase-9显著下调( P<0.05)，细胞凋亡程度显著降低。MMP-9基因水平下调( P<0.05)，Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和Vimentin基因显著上调( P<0.05)。光老化小鼠模型中，与模型组相比，水凝胶组的小鼠皮肤形成的皱纹更少。HE染色显示胶原蛋白纤维表达量丰富且紧密、角质层更加光滑；与模型组相比，GEL-Ⅰ能更好地降低活性氧含量，提高SOD活性，降低MDA表达( P<0.05)，且呈浓度依赖性趋势，40 mg/ml组与对照组相比活性氧、SOD水平差异有统计学意义( P<0.05)；天狼猩红染色显示水凝胶组组织中胶原蛋白含量显著增加( P<0.05)，40 mg/ml组与对照组相比胶原含量显著增加( P<0.05)；免疫荧光染色显示肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、基质金属蛋白酶-9含量呈显著下降( P<0.05)，且呈浓度依赖性。 结论:重组Ⅰ型胶原水凝胶可改善氧化应激和炎症微环境，降低皮肤组织活性氧，下调促HSF凋亡细胞因子和基质金属肽酶9，促进皮肤光老化细胞的功能恢复，提升细胞外基质成分表达，可有效改善光损伤皮肤。

Ⅲ型胶原蛋白是一种重要的结构蛋白，广泛分布于皮肤、血管壁、大部分组织的网状纤维中；因其生物及物理性质方面的优点，已广泛用于生物医学组织工程和临床。临床应用的Ⅲ型胶原蛋白大多是动物源性胶原蛋白，因其不良反应和传播疾病的风险，存在应用局限性。通过基因组织工程合成的重组人源Ⅲ型胶原蛋白较好地解决了该问题，同时为临床应用Ⅲ型胶原蛋白安全性和推广性提供了保障，为疾病的治疗提供更多的思路。

目的:表达和纯化重组人Ⅲ型胶原蛋白（rhCol），并评价其性能。方法:构建重组基因工程菌pET30a（+）-1880/pACYCDuet-hy726/BL21（DE3），稳定共表达rhCol和脯氨酰羟化酶。通过大肠杆菌高密度发酵与盐析和柱层析蛋白纯化技术制备并纯化rhCol。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定rhCol的纯度，全自动蛋白质多肽测序仪测定rhCol的N端氨基酸序列，紫外分光光度法测定rhCol中的羟脯氨酸含量，噻唑蓝法评价rhCol的细胞相容性。结果:高密度发酵最终菌体湿重约200 g/L，表达量约3 g/L，通过亲和层析获得的rhCol的纯度大于95%。rhCol的羟脯氨酸含量为11.44%，其水溶性及细胞相容性良好。结论:本研究制备的rhCol可作为一种优良的生物材料广泛用于皮肤护理及生物医药等领域。

目的:探讨面部皮肤微针注射重组Ⅲ型人源化胶原蛋白对皮肤年轻化的效果。方法:2021年7—12月，四川大学华西口腔医院医疗美容科招募志愿者25例，男1例、女24例；年龄30~58(38±9)岁，体质指数(22.23±1.36)kg/m 2。面部微针注射重组Ⅲ型人源化胶原蛋白，分别在治疗前及结束治疗后1、2、3个月采集图像，用VISIA图像分析系统进行对比分析，对受试者满意度进行评估，对治疗后并发症发生情况进行记录。 结果:VISIA图像分析治疗前及治疗后1个月各维度分值，斑点(32.06±6.92)比(27.59±7.69)分、红色区(32.79±11.80)比(27.74±9.49)分、毛孔(17.66±9.79)比(14.60±7.07)分、棕色斑(43.61±11.93)比(37.59±16.22)分，疗程结束后均低于治疗前，差异均有统计学意义( F＝3.44、4.21、7.47、7.11，均 P<0.05)；疗程结束后1个月，患者满意21例，占84%；结束后3个月，患者满意20例，占80%；无严重不良反应。 结论:面部注射重组Ⅲ型人源化胶原蛋白对皮肤年轻化有较好效果，受试者满意度较高、安全性较高，值得临床应用。

目的:评价急性肾损伤小鼠肾纤维化时CXCL16与自然杀伤T细胞的关系。方法:清洁级健康雄性C57BL/6小鼠24只，8～10周龄，体重20～30 g，采用随机数字表法分为4组( n＝6)：对照组(C组)、急性肾损伤组(AKI组)、对照+重组CXCL16蛋白组(C-rCXCL16组)和急性肾损伤+重组CXCL16蛋白组(AKI-rCXCL16组)。AKI-rCXCL16组和AKI组腹腔注射叶酸250 mg/kg制备急性肾损伤小鼠肾纤维化模型，分别于注射叶酸后第3、6、9、12天时腹腔注射rCXCL16 0.1 mg/kg和等容量溶剂；C组和C-rCXCL16组分别于相应时点腹腔注射等容量溶剂和rCXCL16。注射叶酸后第14天时采集眼眶血标本，检测血清BUN和Cr浓度；采用天狼星红染色和Masson染色观察肾纤维化面积；采用免疫荧光法测定肾组织纤维连接蛋白(FN)、Ⅲ型胶原蛋白(Col-Ⅲ)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达；采用流式细胞术检测CD1d Tetramer +-IL-4 +双阳性细胞比例；采用RT-PCR法检测肾组织IL-4、甘露糖受体(CD206)和精氨酸酶-1(Arg-1) mRNA的表达。 结果:与C组比较，AKI组和AKI-rCXCL16组血清BUN和Cr浓度升高，肾组织纤维化面积增加，IL-4、CD206、Arg-1 mRNA和FN、Col-Ⅲ、α-SMA表达上调，CD1d Tetramer +-IL-4 +细胞比例增加( P<0.05)，C-rCXCL16组上述各指标差异无统计学意义( P>0.05)；与AKI组比较，AKI-rCXCL16组血清BUN和Cr浓度升高，肾组织纤维化面积增加，IL-4、CD206、Arg-1的mRNA和FN、Col-Ⅲ、α-SMA表达上调，CD1d Tetramer +-IL-4 +细胞比例增加( P<0.05)。 结论:CXCL16参与急性肾损伤小鼠肾纤维化过程的机制与其募集自然杀伤T细胞分泌IL-4调控巨噬细胞向M2型极化有关。

目的:确定问号钩端螺旋体vWF-A基因产物结合人胶原蛋白的作用与机制。方法:采用生物信息学软件分析问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株vWF-A基因(LA_0012、LA_0697和LA_4207)产物结构与功能。构建上述基因vWF-A功能结构域片段原核表达系统，采用SDS-PAGE和Ni-NTA亲和层析法检查目的重组蛋白rLep0012、rLep0697和rLep4207表达情况和提纯效果。采用ELISA和表面等离子共振法(SPR)检测目的重组蛋白与人Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅵ型胶原蛋白(hCOL1/3/4/6)的结合能力。采用实时荧光定量RT-PCR和Western blot检测问号钩端螺旋体赖株感染人和小鼠血管内皮细胞(HUVEC和EOMA)时vWF-A基因转录和表达水平变化。结果:vWF-A基因产物均为含vWF-A超家族结构域表面或跨膜蛋白，但LA_0697和LA_4207基因还含有金属离子依赖性黏附位点(MIDAS)。所构建的原核表达系统能有效表达目的重组蛋白，Ni-NTA亲和层析法提纯后SDS-PAGE检测均显示为单一蛋白条带。ELISA结果显示rLep0697与hCOL3/6、rLep4207与hCOL1/4呈强结合。SPR结果显示rLep0697快速结合hCOL3/6但快速解离( KD值＝5.71×10 -8和5.89×10 -8 mol/L)，rLep4207快速并稳定结合hCOL1/4( KD值＝6.4×10 -9和3.2×10 -9 mol/L)。感染HUVEC和EOMA细胞时，上述vWF-A基因转录和表达水平均显著升高( P<0.05)。 结论:LA_0697和LA_4207基因产物可作为问号钩端螺旋体感染过程中的黏附因子。

目的 研究白藜芦醇抑制肾纤维化对单侧输尿管梗阻诱导的肾损伤的减轻作用及相关机制.方法 以Sprague-Dawley(SD)大鼠和成纤维细胞NRK-49F为实验对象,分别进行体内研究和体外验证,体内:SD大鼠行单侧输尿管梗阻诱导建立TIF大鼠模型,将大鼠随机分为4 组(假手术+空白组、假手术+白藜芦醇组、模型+空白组和模型+白藜芦醇组),每组 12 只大鼠.体外:将NRK-49F细胞用重组TGF-β1(5 ng/mL)或白藜芦醇(10 和100 μmol/L)处理后随机分为 4 组(对照组、TGF-β1 组、TGF-β1 +白藜芦醇低剂量组和TGF-β1 +白藜芦醇高剂量组).Masson's染色检测肾脏中总胶原蛋白沉积;免疫组织化学染色检测组织中E-cadherin、GFAP和Ki67 阳性细胞的表达;免疫荧光染色检测细胞中Ki67 阳性细胞的表达;蛋白质印迹检测组织中E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、Rac1、c-Myc、Bcl-2、Cyclin D1、α-SMA、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的表达.结果 与对照组比较,白藜芦醇可以抑制大鼠体内单侧输尿管梗阻(unilater-al ureteral obstruction,UUO)肾脏中总胶原蛋白的过度沉积,下调α-SMA阳性成肌纤维细胞减少波形蛋白、Ⅰ型和Ⅲ型胶原,抑制Rac1、GFAP和N-cadherin的上调以及E-cadherin的下调;与假手术组比较,白藜芦醇可显著降低UUO大鼠中Ki67 阳性细胞比率,并抑制c-Myc,Bcl-2 和cyclin D1 的表达;白藜芦醇抑制体内增殖相关途径Wnt/β-catenin的激活;体外实验表明白藜芦醇治疗可减少成纤维细胞和TECs的增殖,从而抑制TGF-β1 介导的表型转化和ECM积累.结论 白藜芦醇通过抑制Wnt/β-catenin通路的活性,抑制成肌纤维细胞的积累,并减轻了肾小管间质纤维化.

目的 建立以成纤维细胞激活蛋白(FAP)基因启动子为响应元件的新双荧光素酶报告基因系统建的心肌纤维化防治药物筛选方法.方法 体外扩增小鼠FAP基因启动子片段,克隆至psiCHECK2质粒替换HSV-TK启动子,获得新的重组质粒psiCHECK2-FAP.重组质粒经限制性内切核酸酶HindⅢ消化后,进行琼脂糖凝胶电泳鉴定并纯化片段测序验证;将psiCHECK2-FAP瞬时转染至小鼠心肌成纤维细胞(MCF)培养24h后,分别给予转化生长因子β1(TGF-β1)5 μg·L-1,血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)1 μmol·L-1或棕榈酸(PA)100 μmol·L-1 处理 0,12,24 和 48 h,双荧光素酶报告基因实验检测荧光素酶活性.将psiCHECK2-FAP瞬时转染至MCF细胞培养24h后,达格列净(Dapa)1 μmol·L-1预处理1h,再分别添加TGF-β1(5 μg·L-1),Ang Ⅱ(1 μmol·L-1)或PA(100 μmol·L-1)处理24 h,双荧光素酶报告基因实验检测荧光素酶活性,Western印迹法检测MCF细胞中Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)和ColⅢ的蛋白表达.结果 HindⅢ将psiCHECK2-FAP切成2个片段且条带大小符合预期,测序结果与理论序列完全一致.与空白对照组相比,TGF-β1,AngⅡ和PA组均可显著增加MCF细胞中ColⅠ和ColⅢ表达(P<0.05,P<0.01);分别与TGF-β1,AngⅡ或PA组相比,Dapa干预后则显著降低ColⅠ和ColⅢ表达(P<0.05,P<0.01);与空白对照组相比,TGF-β1,AngⅡ或PA均可显著增加荧光素酶活性(P<0.05,P<0.01),24 h达最大值;分别与TGF-β1,AngⅡ或PA相比,Dapa干预后则显著降低荧光素酶活性(P<0.05,P<0.01).结论 以FAP基因启动子为响应元件的新双荧光素酶报告基因系统在MCF细胞中对促心肌纤维化因子表现出较好的敏感性,为心肌纤维化防治药物的研发提供策略.

目的:回顾分析滚针联合重组人酸性成纤维细胞生长因子(Recombinant human acidic fibroblast growth factor,rh-aFGF)及Ⅲ型胶原蛋白导入治疗毛孔粗大的临床疗效.方法:回顾性分析2020年11月-2022年2月于笔者医院接受滚针联合rh-aFGF及Ⅲ型胶原蛋白导入治疗毛孔粗大的125例就医者临床资料.根据皮损特点将就医者分为堵塞型(n=95)、松弛型(n=13)、混合型(n=17),再根据就医者接受治疗次数将各型就医者分为单次组和多次组.分析不同毛孔分型各组就医者治疗前后的毛孔可见度评分、临床疗效,并回访统计就医者舒适度及满意度.结果:治疗后各类型毛孔可见度评分均较治疗下降,且堵塞型及混合型显著低于治疗前(P＜0.05).与治疗前相比,堵塞型单次组与多次组治疗后毛孔可见度评分均显著降低(P＜0.01).松弛型、混合型多次组治疗后毛孔可见度评分均显著低于治疗前(P＜0.01).治疗总有效率为72.80％,不同毛孔类型间疗效比较差异无统计学意义(P＞0.05).就医者总满意度为68.00％,治疗舒适度为99.20％.多次治疗可提高就医者满意度.结论:滚针联合rhaFGF及Ⅲ型胶原蛋白导入治疗堵塞型毛孔粗大单次即可见显著疗效,松弛型、混合型多次治疗后疗效较好.整体治疗舒适度较好,适合临床推广.

目的 探究脂肪源性间充质干细胞外泌体(hADSC-Exo)在大鼠全层皮肤缺损创面愈合中的作用机制.方法 分离并鉴定hADSC与hADSC-Exo.将人真皮微血管内皮细胞(hMECs)分为对照组、200μg/L重组人表皮生长因子处理的阳性对照组与100μg/mL hADSC-Exo处理的hADSC-Exo组,通过CCK-8、划痕实验、血管形成实验,检测hMECs增殖、迁移与血管形成能力.60只大鼠随机分为对照组、阳性对照组、hADSC组与hADSC-Exo组,每组15只.所有大鼠于背部制备全层皮肤缺损创面,每组分别于大鼠尾静脉注射200μL 1×PBS、100μg/kg重组人表皮生长因子、200μL约含1×106个hADSC的1×PBS、200μL含200μg hADSC-Exo的1×PBS.每组随机保留3只大鼠,分别于0、3、7、10、12 d拍摄创面图像并计算创面面积.每组其余大鼠随机分为4组,每组3只,分别于3、7、10、12 d采集未愈合创面组织并制成石蜡切片,HE、Masson染色观察创面愈合情况,免疫组化检测炎症与创面愈合相关蛋白表达情况.结果 细胞实验结果显示,与对照组相比,阳性对照组、hADSC-Exo组细胞增殖活性、细胞迁移率升高(P<0.05),管腔长度与分支点数量增加(P<0.05);与阳性对照组相比,hADSC-Exo组细胞增殖活性、细胞迁移率进一步升高(P<0.05),管腔长度与分支点数量进一步增加(P<0.05).动物试验结果显示,与对照组相比,阳性对照组、hADSC组与hADSC-Exo组皮肤创面愈合率、CD206、Ⅰ型胶原蛋白(Collagen Ⅰ)、Collagen Ⅲ、水通道蛋白3(AQP3)表达水平升高(P<0.05),肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6、CD68、角蛋白1(KRT1)表达水平与Collagen Ⅰ/Collagen Ⅲ比例下降(P<0.05),新生表皮组织更为完整,厚度增加,表皮下可见成纤维细胞增殖,创面新生胶原沉积明显增加;与阳性对照组相比,hADSC组与hADSC-Exo组CD206、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、AQP3表达水平进一步升高(P<0.05),TNF-α、IL-6、CD68、KRT1表达水平进一步下降(P<0.05).结论 hADSC-Exo能够增强hMECs增殖、迁移、血管生成能力,降低创面炎症反应水平,促进创面细胞增殖、胶原重塑,加速创面愈合,具有成为皮肤创伤治疗药物的潜力.