磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)是甲羟戊酸(MVA)途径的关键酶.在真菌中,MVA途径是麦角甾醇生物合成的上游,因此PMK也被称为Erg8.为了研究磷酸甲羟戊酸激酶在米曲霉(Aspergillus oryzae)麦角甾醇合成通路中的作用,对米曲霉AoErg8 基因功能进行研究.采用生物信息学方法鉴定米曲霉中的该基因,通过系统发育树和酵母异源互补分析其是否保守,利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测其表达模式,同时通过荧光蛋白标记对其亚细胞定位进行分析,最后测定AoErg8基因过表达对米曲霉生长和麦角甾醇含量的影响.结果表明,AoErg8 进化保守,其表达量在不同生长时间和不同非生物胁迫下均发生了改变;AoErg8 能恢复酿酒酵母erg8 突变体的温度敏感表型;AoErg8 定位于细胞质中;米曲霉中AoErg8 过表达导致麦角甾醇含量降低,并且影响米曲霉生长和孢子形成.因此,米曲霉AoErg8的功能相对保守,其过表达可以降低麦角甾醇含量并影响菌落生长和孢子形成.该研究进一步揭示丝状真菌米曲霉麦角甾醇生物合成和调控机理,为米曲霉或其他真菌脂质代谢的基因工程奠定基础.

本文以肺形侧耳栽培菌株X57为研究对象,对其低温胁迫时期进行转录组分析,发现差异基因显著地富集到麦角甾醇合成通路.根据麦角甾醇合成通路的相关信息,在肺形侧耳中筛选出该通路的17个基因,并推测了肺形侧耳的麦角甾醇合成通路.利用荧光定量研究了X57栽培袋在低温处理下该通路上各个基因的表达,结果显示随着低温胁迫时间的增加,该通路上大部分基因的表达量持续上升,且差异显著.检测栽培袋中菌丝麦角甾醇含量发现,低温胁迫显著提高麦角甾醇的含量,与RNA-Seq分析结果一致.此外,以无需打冷也能整齐出菇的野生菌株X1为对照,比较X57与X1的麦角甾醇基因对冷胁迫的响应情况,探究麦角甾醇合成通路是否在肺形侧耳低温诱导形成原基时期具有关键性作用.将X57与X1菌株置于PDA平板上培养并进行低温胁迫,利用荧光定量PCR对各个基因表达进行验证,结果显示两个菌株的麦角甾醇合成通路相关基因均对低温胁迫有响应,X57低温胁迫时通路中绝大多数基因的表达量上升,且大部分基因表达量提高2倍以上;X1菌株的通路中的表达量变化较小.由此推测麦角甾醇通路在肺形侧耳变温结实中低温刺激形成原基有一定作用,为深入研究肺形侧耳低温胁迫调控分子机理提供了重要的基础.

目的 筛选藿朴夏苓汤治疗早期新型冠状病毒肺炎(COVID-19)湿邪郁肺证的物质基础,预测其作用机制.方法 查阅文献及临床报道分析藿朴夏苓汤与早期COVID-19湿邪郁肺证的方证关系.运用TCMSP数据库筛选藿朴夏苓汤中潜在活性成分,将活性成分与新型冠状病毒(SARS-CoV-2) 3CL水解酶、血管紧张素转化酶Ⅱ (ACE2)进行分子对接,根据结合能筛选与两者均有较好结合作用的核心成分.借助Cytoscape软件构建关键成分靶点蛋白互作网络,筛选出核心靶点;通过STRING数据库进行核心靶点的GO分析,Cytoscape软件ClueGO插件进行Pathway、KEGG富集分析.结果 方证关系分析藿朴夏苓汤用于治疗早期COVID-19湿邪郁肺证,筛选出藿朴夏苓汤中潜在作用成分12个,核心靶点67个.其中通草中的通脱木皂苷元I,茯苓、猪苓中的过氧麦角甾醇,半夏中的黄芩苷与SARS-CoV-2 3CL水解酶、ACE2均具有较好的结合活性.GO、Pathway、KEGG富集分析结果显示藿朴夏苓汤中12个潜在作用成分参与调节刺激反应、信号转导、细胞死亡等生物过程以及白介素信号通路、癌症EGFR信号通路、酪氨酸激酶信号转导途径、编程性细胞死亡途径、MAPK信号通路等.结论 藿朴夏苓汤以化湿解毒、宣肺透邪治疗早期COVID-19湿邪郁肺证患者,菲酮、黄芩苷、酸枣仁皂苷、啤酒甾醇、常春藤皂苷元、过氧麦角甾醇、柠檬二烯醇、麦角甾-7,22-二烯-3-酮、通脱木皂苷元Ⅰ、泽泻醇B-23-醋酸酯、泽泻醇B、新橙皮苷可能为其主要的物质基础,通过阻断SARS-CoV-2病毒蛋白合成,阻止病毒进入宿主细胞,通过调控白介素信号通路、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、T细胞受体信号通路、C型凝集素受体信号通路,抑制相关炎症因子的表达发挥作用.

药用真菌猪苓菌核的发育代谢过程一直备受关注.为了解猪苓菌核的发育历程,该研究对3个不同时期的猪苓菌核进行了转录组学分析,共得到88.12 Gb测序数据,包含85 235条unigene.对差异基因进行深度挖掘,筛选了有关跨膜运输、防御、极性生长、形态发育、黑色素合成、细胞壁合成、药效成分麦角甾醇和猪苓多糖合成功能的DEGs,从而推测了菌核发育的分子机制.根据DEGs的通路富集注释结果和相关报道,进一步推测猪苓菌核的发育是由于非生物胁迫(温差和缺氧)和生物胁迫(共生菌蜜环菌和伴生菌的入侵)诱导所致,造成菌核的氧化应激状态,加速合成膜转运蛋白和麦角甾醇从而实现物质的跨膜运输和转换,并通过WD40蛋白实现自身的防御机制.小GTPase和细胞色素P450响应环境信号,进而调控细胞的极性生长和形态发生,期间表皮黑色素沉积,细胞壁加厚,猪苓多糖合成,最终使得猪苓菌核的发育成熟.猪苓菌核不同时期转录组的研究为今后解析其发育历程和相关代谢过程的分子机制奠定了坚实的基础.

目的 探究白色念珠菌(C.albicans)对变异链球菌(S.mutans)生长及毒力的影响,验证麦角甾醇通路在其中的作用.方法 将S.mutans菌株UA159、C.albicans野生型5314单独培养及共培养(体积比1:1混合)24 h后,检测各组菌液光密度(OD)600 nm值,并利用菌落形成单位(colony-forming units,CFU)计数检测S.mutans浓度,以反映C.albicans对S.mutans生长的影响;利用蒽酮法检测生物膜胞外多糖产量,pH计检测菌液产酸能力,以反映C.albicans对S.mutans毒力的影响;将不同C.albicans麦角甾醇合成相关通路突变株与S.mutans共培养后,检测突变株对S.mutans生长的影响;利用0 mg/L、0.0125 mg/L、0.025 mg/L氟康唑抑制C.albicans麦角甾醇合成相关通路,24 h后检测C.albicans野生型和S.mutans在单独培养和混合培养下CFU的变化,以验证该通路作用.结果 C.albicans野生型与S.mutans共培养后,与S.mutans单独培养组相比,混合菌液中OD600值和CFU升高(P<0.05),S.mutans胞外多糖产量增加(P<0.05),pH下降更明显(P<0.05).42株C.albicans突变株与S.mutans共培养后,有14株菌对S.mutans促进生长的作用消失(P<0.05),其中包含6株C.albicans麦角甾醇合成相关通路的突变株,这6株与S.mutans共培养后,菌液中S.mutans的CFU不变或下降.添加0.0125 mg/L、0.025 mg/L氟康唑抑制麦角甾醇通路后,C.albicans野生型与S.mutans混合培养的菌液中,S.mutans的CFU较未添加氟康唑组降低(P<0.05),而C.albicans单独培养组、S.mutans单独培养组的CFU无明显变化(P>0.05),C.albicans野生型与S.mutans混合培养的菌液中C.albicans的CFU也无明显改变(P>0.05).结论 C.albicans能通过麦角甾醇相关通路增强S.mutans生长能力及毒力,此过程可被氟康唑抑制,有望成为防治龋病的新策略.

目的:利用生物信息学和网络药理学方法研究冬虫夏草治疗黑色素瘤的作用机制.方法:通过中药系统药理数据库和分析平台(TCMSP)获取冬虫夏草的活性成分,并利用Pubchem和SwissTargetPrediction平台预测药物作用靶点;由GSE3189数据集筛选黑色素瘤差异表达基因(DEGs);构建"活性成分-预测靶点""活性成分-共有靶点"和蛋白质互作(PPI)网络,用Cytoscape软件将网络可视化;利用R包clusterprofiler对靶点和基因进行基因本体(GO)富集分析和京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路富集分析.结果:共筛选得到7种冬虫夏草活性成分:花生四烯酸、乙酸亚油酸酯、β-谷甾醇、过氧麦角甾醇、谷维甾醇、胆甾醇棕榈酸酯、胆酯醇,作用于SRC、PPARG、MMP9、EZH2、AKR1C3等46个黑色素瘤靶点,这些靶点主要富集于PPAR信号通路和类固醇激素生物合成通路.PPAR信号通路中包含7个靶点,其中FABP3、FABP4、RXRG与黑色素瘤患者生存密切相关.结论:研究结果显示出冬虫夏草治疗黑色素瘤多成分、多靶点、多通路的作用特点,为进一步的基础实验和临床研究提供参考.