以黄独微型块茎为材料,进行了4℃低温离体保存,并对其进行了转录组分析.结果表明:原始数据进行质量预处理后,对照组(Con25)和处理组(Con4)的reads有效比分别为98.67％和98.69％;对拼接序列去重复后最终得到了219 792个长度大于200bp的transcripts(177 Mb)和161066个Unigenes (99 Mb);Unigenes的NR注释数目最多的10个物种分别为出芽短梗霉EXF-150、葡萄、可可、水稻粳稻组、无油樟、谷子、出芽短梗霉变种nami-biae CBS 147.97、麻疯树、短至生黑醋杆菌CBS 110374和无花果拟盘多毛孢w106-1;样本注释基因最多的5个KOG是一般的功能预测、信号转导机制、翻译后修饰和蛋白质周转以及伴侣、翻译和核糖体结构和生物合成、能源生产和转换;样本KEGG注释Unigenes最多的5个pathway分别为碳代谢、氨基酸生物合成、糖酵解途径、淀粉蔗糖代谢和丙酮酸代谢.注释到的Unigenes个数为26006,注释到的不同酶数为1 177,映射到的不同pathway数为327;样本基因的功能在Biological Process分类中主要聚集于cellular process和metabiolic process,在Cellular Component分类中主要聚集于cell和cell part,在Molecular Function分类中主要聚集于binding和catalytic activity;在黄独微型块茎低温离体保存中,共获得164 145个差异表达基因,其中有63 305个基因表达上调,有100 840个基因表达下调;差异表达基因部分极其显著的GO term有液泡继承、单链断裂修复、纺锤体伸长、麦芽糖分解代谢过程、甘露糖基转移酶的活性、甘露糖磷酸转移酶活性、细胞壁甘露糖蛋白的生物合成过程、G1期细胞有丝分裂周期早期细胞芽和有丝分裂纺锤体定位的建立;差异表达基因部分极其显著的pathway有原发性胆汁酸的生物合成、类固醇激素的合成、氯代环己烷和氯苯降解、双酚A降解、氟苯甲酸降解、糖胺聚糖合成硫酸软骨素、糖胺聚糖合成硫酸乙酰肝素、甲苯降解、萘的降解和核黄素代谢.本实验结果可为黄独微型块茎的种质保存和后续萌发提供理论依据.

建立并优化了一种土壤麻疯树核糖体失活蛋白curcin的提取方法.优化后的提取步骤和参数为:0.1g含curcin的土壤样品加入1 mL的提取缓冲液(5 mmol/L磷酸盐,0.1 mmol/L EDTA,0.2％ SDS(m/V),20 mmol/Lβ-巯基乙醇,pH7.2),在18 ℃以上的室温条件下振荡混匀1h,离心取上清液.重复该过程一次,合并上清液.上清液于4℃放置过夜,离心取上清液,即为样品粗提液.该样品粗提液即可用单克隆抗体间接酶联免疫吸附法(ELISA)进一步检测其中的curcin含量.该方法对curcin含量高于8 μ.g/g土壤可进行定性检测,对于curcin含量分别为100、500、1 000μg/g的土壤样品的回收率分别达到49.3％±2.8％、64.2％±3.62％和78.33％±4.24％.该方法的变异系数保持在5％左右,对来自四川3个样地的土壤有较好的适用性.本研究建立优化的提取方法可为评估curcin蛋白在农业领域应用的生态风险提供技术支持.

麻疯树(Jatropha curcas)种子含油率高,种子中的油类物质可作为生物柴油被开发和利用,是极具潜力的生物质能源树种之一.麻疯树雌雄异花,在自然条件下雄花数量通常远远大于雌花,这大大限制了种子和油的产量,因此开展麻疯树性别分化与花发育分子机理的研究具有重要意义.该研究选取10个麻疯树的MADS?BOX基因(JcAGL1,JcAGL6,JcAGL9,JcAGL11,JcAGL15,JcAGL61-3,JcAGL62-1,JcAGL62-6,JcA-GL62-7,JcAGL80-2),提取麻疯树早期发育各个阶段的雌雄花总RNA,并反转录成cDNA,采用实时荧光定量方法,探索早期发育不同阶段的麻疯树雌雄花目的基因的表达情况.结果表明:目的基因在发育起始的雌雄花中的表达具有差异,比如JcAGL6和JcAGL15在雄花中表达量要高于雌花,而JcAGL1,JcAGL9和JcAGL11在雌花中的表达量要高于雄花,这说明花原基中目的基因表达会直接或间接决定性别分化的方向;在之后的发育过程中,目的基因的表达情况在雌雄花中有所不同:随着花的发育,目的基因在雌雄花中的表达量变化存在差别,这反应出麻疯树雌雄花发育中目的基因表达模式上的差异;另外,也能看出在此过程中各个目的基因又发挥着不同的功能.该研究结果为进一步探究麻疯树雌雄花发育相关基因的表达提供了理论依据,为了解麻疯树性别分化和花发育的分子机理奠定了基础.

基于麻疯树RNA-Seq数据,利用RT-PCR技术成功从麻疯树花器官中克隆获得JcCXE7基因的开放阅读框,长度为957bp,编码318个氨基酸,预测该蛋白分子质量为35.55kDa.对JcCXE7基因的时空表达进行分析,结果表明,JcCXE7基因可能参与了麻疯树雌花大孢子母细胞发生和减数分裂;且在雌花中的表达水平大大高于雄花.利用原核表达体系对JcCXE7基因进行诱导表达,随后对获得的蛋白进行了LC-MS/MS鉴定,并对JcCXE7蛋白的氨基酸序列与同源家族进行多重比对及其结构进行分析,结果表明JcCXE7蛋白可能为GID1家族蛋白.

目的 克隆浙贝母Fritillaria thunbergii Miq.肌动蛋白(Actin)基因,并进行生物信息学分析.方法 提取浙贝母根、茎、叶、花、鳞茎总RNA,设计合成简并引物.以叶片总RNA为模板,通过RT-PCR和Ta克隆技术克隆Actin基因保守区序列片段.以该基因为内参基因,对3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因进行组织特异性表达分析.结果 经RT-PCR扩增和Ta克隆,得到1段基因序列(463 bp).浙贝母Actin基因与岷江百合、郁金香、虎眼万年青、铁皮石斛、柿子、光皮桦、玉米相似度较高(84％～98％),其氨基酸序列与阿帝露茅膏菜、甘蓝型油菜、香草兰、岷江百合、麻疯树、枸杞、红海榄的同源性均在89％以上,并且其Actin蛋白与百脉根、岷江百合、郁金香亲缘关系较近.HMGR基因在该植物各部位表达有显著差异,依次为鳞茎＞花＞叶＞茎＞根.结论 首次从浙贝母中克隆出Actin基因(命名为FtActin),可为其有效利用奠定基础.

肌醇半乳糖苷合成酶是植物中棉子糖系列寡糖合成中的关键酶,在植物抗性生理中扮演重要作用.本研究利用RT-PCR 技术从泡核桃中成功克隆获得一个受冷害诱导的肌醇半乳糖苷合成酶基因(JsGS1),其含有1 026 bp 的开放阅读框,编码341个氨基酸,登录号为:KX657831.该基因推断的蛋白与核桃(Juglans regia) GS蛋白的相似性为89％;系统进化树分析显示其与核桃、麻疯树(Jatropha curcas)、蓖麻(Ricinus communis)形成一个分支.半定量PCR 显示:低温4℃处理3 h 后有微弱表达,6 h 后大量表达.这说明JsGS1 是典型的受冷害诱导的GS 基因.本研究为揭示泡核桃抗寒机理以及肌醇半乳糖苷合成酶在冷害胁迫下的作用提供帮助,并为利用基因工程手段培育抗寒新品种提供理论依据.

为了资源化利用麻疯树籽壳,通过Fentons试剂诱导质粒pUC19 DNA损伤法分析了麻疯树籽壳乙醇提取物不同极性萃取部位(石油醚,氯仿,乙酸乙酯及正丁醇)的DNA损伤保护作用;采用DPPH、ATBS及超氧阴离子自由基清除能力与铁离子还原力评价了其抗氧化能力;利用GC/MS分析了其乙酸乙酯(JEE)和氯仿萃取物(JCE)的化学成分.结果显示,麻疯树籽壳提取物中,JEE的DNA损伤保护作用最强,其次为JCE和正丁醇萃取物(JBE),而JPE作用最弱;四个萃取部位都具有一定的抗氧化活性,且以JCE和JEE的抗氧化能力较强.JCE的DPPH和超氧阴离子自由基清除能力略高于JEE (IC50分别为4.88 μg/mL和3 506.59 μg/mL),但二者没有显著差异;而JEE的ABTS自由基清除能力和铁离子还原力却显著高于JCE(IC50分别为2.21μg/mL和33.76 μg/mL).此外,JCE和JEE化学成分GC/MS分析显示,二者均以酚类物质为主,相对含量分别为73.92％和49.01％,且二者主要酚类物质均为临香豆酸,相对含量分别为39.25％和20.77％.该研究结果显示麻疯树籽可以用作抗氧剂的生产原料,为其进一步开发利用提供了科学依据.

该研究以Cu2+、Zn2+、Cd2+单一胁迫为对照,探讨不同浓度的Cu2+、Zn2+、Cd2+复合胁迫对麻疯树幼苗生理生化指标的影响.结果表明:随着Cu2+、Zn2+、Cd2+浓度的增加,麻疯树幼苗叶片中的蛋白质(Pro)、丙二醛(MDA)含量均逐渐增加,其叶片叶绿素含量随着Zn2+胁迫浓度的增加呈现出先降后升的趋势,在中等浓度(100 mg?L-1)的Zn2+胁迫时含量最低、随着Cu2+胁迫浓度的增加叶绿素含量先升高后降低,在Cu2+浓度为200 mg?L-1时含量最高,达到1200 mg?g-1 FW;Cd2+胁迫对叶绿素含量和根系活力无明显影响.根系活力在Zn2+浓度为100 mg?L-1时最强,随着Cu2+浓度的增加而减弱.低浓度的Cu2+、Zn2+、Cd2+对过氧化物酶活性和可溶性糖含量都具有促进作用.Cu2+、Zn2+、Cd2+复合胁迫时对可溶性蛋白、叶绿素和丙二醛含量均无明显影响,随着复合胁迫时浓度的增加,可溶性糖含量和根系活力先增后减.这表明麻疯树对三种重金属的胁迫具有一定的抗性,过高浓度的胁迫会影响麻疯树幼苗生理生化的一些指标,但是麻疯树可以通过自身的防御系统使伤害降到最小.此外,重金属复合胁迫可以在一定程度上减轻单一胁迫对麻疯树幼苗造成的毒害作用.

本文从续随子发育种子中分离编码二酰甘油酰基转移酶2的cDNA克隆(ElDGAT2),采用生物信息学工具解析ElDGAT2酶蛋白的理化性质、高级结构、亚细胞定位及系统发育等特性.利用qRT-PCR研究该基因在续随子不同器官组织的表达谱.构建lDGAT2的组成型植物表达栽体(pCAMBIA1303-ElDGAT2),通过农杆菌介导烟草瞬时表达鉴定lDGAT2基因的功能.结果 显示,续随子ElDGAT2 cDNA全长l 939 bp,ORF为984 bp,编码327个氨基酸.ElDGAT2蛋白定位于内质网上,二级结构主要结构元件为α-螺旋(37.00％)和无规则卷曲(34.25％).DGAT2蛋白系统发育树分析揭示,续随子ElDGAT2与同科植物蓖麻、油桐、麻疯树的DGAT2蛋白亲缘关系较近.基因表达分析表明,ElDGAT基因在续随子不同器官中均有表达,而且在种子中的表达量显著高于其他器官.在种子发育中期(花后30 d)即油脂快速合成积累时期的表达量最高,ElDGAT2表达量约为叶片的12.83倍.与野生型和空载体转化烟叶相比,ElDGAT2瞬时表达的烟叶组织总油脂含量提高1.59％,饱和脂肪酸减少,油酸等不饱和脂肪酸增加.研究表明,ElDGAT2编码一个具有催化活性的DGAT2酶蛋白,异源表达可提高宿主组织总油脂和不饱和脂肪酸的合成积累,显示ElDGAT2对油酸等不饱和脂肪酸有底物偏好性.

CAULIFLOWER (CAL)是与花分生组织的形成有关的基因,通过RACE-PCR技术从麻疯树花蕾中成功获得了1个CAL(JcCAL-Like)基因cDNA的全长序列,并对其原核表达产物进行质谱鉴定,分析了其亚细胞定位情况及其在麻疯树花不同发育时期的表达情况.结果 表明:JcCALA-Like cDNA全长1 021 bp,开放阅读框长603 bp,编码200个氨基酸,蛋白质的大小约为23.368 kDa,等电点pI为9.63;表达情况提示该基因可能参与了麻疯树雄花单核花粉粒的形成及雌花的胚囊成熟;此外,亚细胞定位分析显示该基因定位于细胞核中,这表明JcCALA-Like发挥功能的场所是在细胞核.