细胞色素P450酶(CYP)1A1是CYP1A亚家族的主要成员之一,能够代谢活化多种间接致癌物.在特定情况下,CYP1A1可活化外源化合物,产生中间或活性代谢产物与生物大分子结合,从而诱导致癌作用.其中,CYP1A1对苯并(a)芘[B(a)P]的代谢活化起到核心作用,在诱导B(a)P产生毒性效应和致癌效应中起到关键作用.CYP1A1参与二甲基苯并蒽和2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑并[4,5-b]吡啶(PhIP)的代谢活化,且在PhIP诱导的遗传毒性中起重要作用.CYP1A1亦是代谢活化7H-甲基二苯并咔唑(DBC)的主要酶,是DBC发挥致癌作用的关键因素.CYP1A1还与黄曲霉毒素B1、3-硝基苯和萘等间接致癌物的代谢活化有关.抑制CYP1A1的催化活性有助于减缓CYP1A1介导的致癌物活化,起到防治恶性肿瘤的作用.

在过去的几十年,大量化学分析研究已经鉴定出烟草烟雾中众多化合物,且数量不断增加,截至2013年,烟草烟雾中已发现化合物达9582种,其中包含尼古丁、烟草烟雾特异性亚硝胺、苯并[α]芘等物质,以及可替宁、4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇等经体内代谢转化而成的产物,能够靶向心、肺等器官,诱发慢性阻塞性肺疾病、冠心病以及肺癌、食道癌等多种类型的癌症.中医对"毒性"的认识起源于《内经》,认为"毒邪"既可以作为外来致病因素,也可致五脏失和酿生痰瘀等病理产物蕴积成内毒.现代医学对烟草烟雾有毒物质及其代谢产物致病认识与中医"外毒""内毒"的认识颇相一致,因此笔者从烟草烟雾有害物质及其代谢产物出发,拟深入探析其主要成分及致病机制,明确烟毒"内毒""外毒"病因特点及病机转化特征,从而为中医探析"烟毒"致病现代化研究及烟草烟雾致病与中医理论相结合奠定理论基础.

目的 观察低水平铅(Pb2+)和1-硝基芘(1-nitropyrene,1-NP)联合染毒致小鼠下丘脑和垂体损伤中视黄酸通路的表达,探讨该通路改变与下丘脑和垂体损伤的关系.方法 将84只4周龄ICR小鼠按体重随机分为对照组、Pb2+染毒组(0.008 mg/L)、1-NP 染毒组(0.1 mg/kg)以及低(0.008 mg/L Pb2++0.004 mg/kg 1-NP)、中(0.008 mg/L Pb2++0.02 mg/kg 1-NP)、高剂量(0.008 mg/L Pb2++0.1 mg/kg 1-NP)联合染毒组,每组14只.其中Pb2+由醋酸铅提供,添加于去离子水中,小鼠自由饮水;1-NP经腹腔注射.记录每日饮水量和摄食量;连续染毒21天后称体质量,光镜下观察下丘脑和垂体组织学改变、原子吸收法测定脑组织中铅含量;实时荧光定量PCR检测视黄酸通路成员及Jnks基因的丰度;Western Blot法检测乙醛脱氢酶2(acetaldehyde dehydrogenase 2,ALDH2)、细胞色素 P450 家族成员 26A1(CYP26a1)蛋白的表达水平.结果 各组小鼠每周平均饮水量和摄食量无差异.Pb2+染毒各组小鼠脑组织Pb2+含量高于对照组.高剂量联合染毒组小鼠体重[(27.4±1.9g)]低于对照组[(29.8±2.3)g](P＜0.05).中、高剂量联合染毒组血清促卵泡激素水平[分别为(265.01±2.99)、(260.42±3.61)pg/mL]低于对照组[(279.00±1.30)pg/mL](P＜0.05).下丘脑和垂体组织中,中、高剂量联合染毒组Adh1、Adh2、Rar和Rxr基因丰度,ALDH2蛋白水平均高于对照组(P＜0.05),低、中、高剂量联合染毒组CYP26a1基因丰度及蛋白水平均低于对照组(P＜0.05),高剂量联合染毒组Jnks基因丰度均高于对照组(P＜0.05).结论 0.008 mg/L Pb2++0.1 mg/kg 1-NP连续染毒21天可致小鼠下丘脑和垂体损伤,并激活视黄酸信号通路.

目的 探讨基于高内涵筛选(high-content screening,HCS)技术的体外微核(in vitro micronucleus,IVMN)检测方法应用于食品毒理学遗传毒性评价的可行性.方法 采用IVMN和HCS法,分别对10种化合物进行遗传毒性评价,其中5种已知遗传毒性化合物(染色体断裂剂和非整倍体诱发剂)、1种已知非遗传毒性化合物以及4种食品原料,每个受试物至少设置3个剂量组,每个剂量组设2个复孔,同时设置阴性对照组(无血清最小必需培养基)和阳性对照组(+S9为环磷酰胺20 μg/ml、-S9为丝裂霉素C 1.0μg/ml).以中国仓鼠肺细胞为细胞模型,在有和/或无代谢活化系统条件下,依次对上述受试物采用短时处理(4 h)后进行微核检测,并分析微核细胞率.结果 经IVMN和HCS法得到的IVMN试验结果显示:2.5 ～ 10 μg/ml苯并芘[B(a)P]、5～ 20 μg/ml甲磺酸甲酯(MMS)、0.01～0.04 μg/ml 4-硝基喹啉-N-氧化物(4NQO)、0.25～ 1.0 μg/ml秋水仙碱(COL)和0.5～2.0 μg/ml硫酸长春碱(VB)在各自浓度范围内,在有或无代谢活化系统的条件下,诱导产生的微核细胞率随着受试物浓度的升高而增加,呈明显剂量-反应关系,且微核细胞率与阴性对照组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05),试验结果为阳性;1 250～5 000 μg/ml氯化钠(NaCl)、1 250～5 000 μg/ml食品原料A、1 250～5 000 μg/ml食品原料B、312.5～1 250 μg/ml食品原料C和156.25～625 μg/ml食品原料D在各自浓度范围内,在有和无代谢活化系统的条件下,微核细胞率虽呈现一定的剂量依赖性增加趋势,但均维持在较低的水平,且与阴性对照组比较,差异均无统计学意义(P＞0.05),试验结果为阴性.结论 本试验条件下,两种方法对10种物质的检测结果均一致,提示将IVMNHCS法应用于食品毒理学遗传毒性评价具有一定的可行性.

目的 建立固相萃取-高效液相色谱串联质谱(high performance liquid chromatographic tandem mass spectrometric,HPLC-MS/MS)同时测定尿液中8种芳香化合物代谢物(苯巯基尿酸、甲基马尿酸、N-乙酰基-S-苯基-L-半胱氨酸、苯乙醛酸、苯乙醇酸、对氨基酚、对硝基酚和1-羟基芘)的方法.方法 取1 mL尿液,加入20μLβ-葡萄糖醛酸酶和1 mL乙酸铵缓冲溶液,在37℃孵箱中酶解20 h.酶解后混匀,取适量酶解液注入PrimeHLB固相萃取柱净化,4 mL乙腈洗脱,洗脱液氮吹至干,用0.20 mL甲醇复溶后进样HPLC-MS/MS系统分析.高效液相色谱分离采用反相C18色谱柱(2.1 mm×150 mm,3.5μm),流动相A为含体积分数0.1％甲酸的水,流动相B为甲醇,采用梯度洗脱,流速为0.2 mL/min.质谱采用正、负离子交替扫描方式,多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)模式检测,内标标准曲线法定量.结果 8种代谢物在1～100 ng/mL范围内线性良好,相关系数均大于0.995,测定的精密度(relative standard deviation,RSD)在0.05％～9.95％之间,8种代谢物的检出限在0.041～0.12 ng/mL范围内.将所建立的方法用于尿样分析,加标回收率为80.1％～114.0％.结论 所建立的方法灵敏、快速、准确,适用于普通人群和职业人群的芳香化合物生物监测评估.

目的:评价雷公藤甲素(TPL)的潜在致Pig-a基因突变风险.方法:采用小鼠淋巴瘤L5178Y细胞分别进行非S9(-S9)代谢和S9(+S9)代谢条件下体外实验.-S9代谢条件实验中,L5178Y细胞分为对照组(1％二甲基亚砜)、阳性对照甲基磺酸乙酯(EMS,500μg·mL-1)组和TPL各质量浓度(6.3、12.5、25.0、50.0、100.0 ng·mL-1)组,受试物处理24 h后细胞计数,更换培养基培养8 d,表达结束后进行流式检测.+S9代谢条件实验中,L5178Y细胞分为对照组(1％二甲基亚砜)、阳性对照苯并芘[B(a)P,5μg·mL-1]组和TPL各质量浓度(12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 ng·mL-1)组,受试物处理4 h后更换培养基,24 h后计数,培养8 d,表达结束后进行流式检测.体内Pig-a基因突变实验中,KM小鼠按体质量随机分为对照组(0.5％羧甲基纤维素钠)、阳性对照N-乙基-N-亚硝基脲(ENU,100 mg·kg-1)组和TPL各剂量(50、100、200μg·kg-1)组.ENU组仅于首次给药日给药1次,TPL各剂量组连续给药28 d,分别于给药前和首次给药后14、28、42、56 d于小鼠眼内眦采血,血样经缓冲液洗脱后,进行anti-CD24-PE和anti-CD61-PE标记,采用免疫磁性分离架进行柱前和柱后样品的收集,利用流式细胞仪对样本进行检测计数,对突变率进行统计分析.结果:体外Pig-a基因突变实验结果表明,在-S9和+S9代谢条件下,与对照组比较,TPL各剂量组Pig-a基因突变率差异无统计学意义,且无剂量依赖性.体内Pig-a基因突变实验结果显示,与对照组比较,TPL组小鼠红细胞(RBC)和网织红细胞(RTC)CD24缺失差异无统计学意义,且无剂量依赖性.结论:TPL质量浓度为200 ng·mL-1及200μg·kg-1以下时不会引起L5178Y细胞及KM小鼠发生Pig-a基因突变.

目的:探讨polδ最小亚基POLD4在吸烟所致肺癌中的机制.方法:利用烟草中主要致癌物质苯并芘类似物4-硝基喹啉-1-氧化物(4NQO)处理肺癌细胞株A549,通过Western blotting方法检测POLD4蛋白的表达量,进而通过蛋白酶活性抑制剂MG132干预观察蛋白表达量的变化.通过siRNA技术下调POLD4表达水平观察对不同细胞毒性药物的敏感性,为进一步验证POLD4表达水平在细胞修复中的作用,利用已构建的Flag-POLD4-pcDNA3质粒转染POLD4低表达的小细胞肺癌细胞株SK3得到POLD4过表达的SK3-D4-1及SK3-D4-2稳定转染细胞进行挽救实验.结果:肺癌细胞株A549经4NQO处理后POLD4蛋白表达量下降,随着浓度的增高(0μmol/L、0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.4μmol/L),蛋白表达量逐渐下降了44％、57％及77％;通过蛋白酶活性抑制剂MG132能干预4NQO所致的POLD4蛋白表达量下降,使蛋白表达量上升约179％.利用siRNA技术下调A549细胞株POLD4表达水平增强对4NQO的敏感性,但对紫杉醇(Taxol)的敏感性却与POLD4的表达水平无关,在挽救实验中POLD4过表达的SK3呈现出对4NQO敏感性降低的结果.结论:吸烟可能导致POLD4表达下降进而削弱DNA修复能力最终导致肺癌.

目的 研究1-硝基芘(1-nitropyrene,1-NP)对小鼠精母细胞株GC-2的损伤效应及芳香烃受体(aryl hydro-carbon receptor,AhR)信号通路的影响.方法 建立不同剂量1-NP染毒的GC-2细胞模型,采用CCK-8法检测细胞活性,流式细胞术检测细胞周期,Western blot分析各组细胞DNA双链断裂损伤标志物γ-H2AX、DNA损伤反应通路蛋白以及AhR通路蛋白的表达.实时荧光定量PCR检测细胞色素450(CYP)1a1和1b1 mRNA表达水平.结果 1-NP处理可导致GC-2细胞活性降低及G2/M期细胞比例升高,同时诱导γ-H2AX蛋白表达升高,DNA损伤反应及细胞周期G2/M期检测点蛋白ATM、Chk1、Cdc25c、Cdc2的磷酸化表达水平升高,Cyclin B1表达降低.1-NP染毒也提高了GC-2细胞中AhR核蛋白及下游靶基因CYP1A1的蛋白表达,提高了 Cyp1a1和Cyp1b1的转录表达水平.结论 1-NP暴露造成小鼠生精细胞的DNA损伤、细胞周期阻滞和细胞活性抑制,其效应可能与AhR信号通路的活化及对化学物的代谢活化有关.

目的 探讨1-硝基芘(1-nitropyrene,1-NP)通过诱导线粒体损伤对人卵巢颗粒细胞KGN的增殖、周期进展及性激素合成的影响.方法 采用不同浓度(0.625、1.25、2.5、5、10μmol/L)1-NP染毒KGN细胞48 h,EdU掺入法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期,ELISA检测细胞培养上清中雌二醇及孕烯醇酮浓度,DCFH-DA探针检测细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,MitoSOX探针检测线粒体超氧化物(mitochondrial superoxides,MitoSOX)水平,JC-1探针检测线粒体膜电位,ATP试剂盒检测细胞内ATP含量,Western blot检测细胞增殖、周期进展、DNA损伤反应以及性激素合成相关蛋白的表达.采用线粒体抗氧化剂IDE、1-NP单独和联合处理细胞,再次检测上述指标.结果 不同浓度1-NP染毒后KGN细胞增殖显著降低(P＜0.05).2.5、5、10 μmol/L的1-NP处理细胞后,细胞增殖标志物PCNA蛋白表达显著降低,5、10 μmol/L的1-NP处理后G2/M期细胞比例显著升高(P＜0.05).1-NP(10 μmol/L)处理3 h即可诱导γ-H2AX表达增加(P＜0.01);不同浓度1-NP处理后,DNA损伤反应通路蛋白p-ATM、p53和p21cip1表达明显升高(P＜0.05),G2/M期阻滞相关蛋白CDK-1和CyclinB1表达明显降低(P＜0.05).此外,1-NP处理后KGN细胞的雌二醇、孕烯醇酮浓度显著下降(P＜0.05),性激素合成相关蛋白CYP19、CYP11A1的表达也受到抑制(P＜0.05).线粒体及氧化应激相关指标检测结果显示,1-NP导致KGN细胞中ROS、MitoSOX水平显著升高,线粒体膜电位和ATP水平呈剂量依赖性下降.与10 μmol/L 1-NP单独染毒组相比,IDE与1-NP联合处理组G2/M期细胞比例显著下降,雌二醇、孕烯醇酮水平出现一定程度升高,DNA损伤反应、细胞周期进展以及性激素合成相关蛋白的表达也出现明显恢复.同时,IDE与1-NP联合处理显著改善1-NP诱导的线粒体损伤,包括降低细胞ROS和MitoSOX水平,提高线粒体膜电位和ATP水平.结论 1-NP可诱导线粒体损伤,造成卵巢颗粒细胞KGN的增殖抑制、周期阻滞、性激素合成障碍,而提高线粒体功能则能部分缓解1-NP诱导的KGN细胞功能障碍.