为探讨经典名方散偏汤对慢性偏头痛的作用机制,该研究采用4D-DIA蛋白质组学技术分析其对慢性偏头痛模型大鼠的干预影响,并对关键差异蛋白进行实验验证.首先将SD雄性大鼠随机分组,反复注射硝酸甘油制备慢性偏头痛模型.连续灌胃7 d后,采用大鼠痛苦面容量表(RGS)评估药效.取三叉神经节进行4D-DIA相对定量蛋白质组学检测,筛选各组差异蛋白,结合多个数据库进行基因本体论(Gene Ontology,GO)功能和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析;使用STRING数据库及Cytoscape软件进行蛋白-蛋白互作(PPI)网络分析,并对关键差异表达蛋白TRPV1进行蛋白免疫印迹法(Western blot)检测.结果显示,空白组与模型组间有517个差异表达蛋白,模型组与散偏汤中剂量组间有221个差异表达蛋白.GO功能和KEGG通路富集分析显示,差异表达蛋白主要与炎症反应、伤害性感受刺激、甘油三酯代谢、免疫调节等相关,主要集中在炎症相关TRP通路、AMPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、TGF-β信号通路等.PPI 网络显示,IGF、TOP2A、APOA1、CDK1、TTN、RYR1、CSRP3 等靶蛋白具有较高的度值(degree).Western blot 结果显示,与模型组比较,散偏汤中、高剂量组TRPV1表达水平差异有统计学意义(P＜0.05).综上,散偏汤可能通过调节TRP、AMPK、PI3K-Akt等炎症相关通路治疗慢性偏头痛,其对TRPV1蛋白的调节发挥了重要作用,并对伤害性刺激感受、脂代谢和免疫反应等具有潜在的调节作用.

目的:基于深度血液4D-DIA蛋白质组学分析,寻找肺腺癌骨转移组与非骨转移组的差异蛋白,为肺腺癌骨转移诊断治疗提供新线索.方法:采用4D-DIA蛋白质组学技术,纳入6例肺腺癌非骨转移(lung adenocarcinoma non-bone metastases,LUADNBM)及 6 例肺腺癌骨转移(lung adenocarcinoma bone me-tastasis,LUADBM)患者进行血清蛋白质组学分析.以表达倍数(fold change,FC)＞1.5倍(上调大于1.5倍或下调小于0.67倍)且P值＜0.05(T-test或其他)为标准,得到比较组间的上调、下调蛋白质数目.对两组间的可定量蛋白进行基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA).应用String网站和R语言对差异蛋白进行主成分分析(principal component analysis,PCA)、基因本体论(gene ontology,GO)分析和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路数据库分析.结果:LUADNBM组与LUADBM组间比较发现2 585个可定量蛋白,其中18个差异蛋白.GSEA结果显示,可定量蛋白主要富集在真核翻译延伸阶段、SARS-CoV-2主要翻译机制通路(P＜0.05).PCA结果显示,差异蛋白可明显区分LUADNBM与LUADBM患者.GO分析结果表明,差异蛋白主要富集在高尔基管腔和细胞外基质,在皮肤硫酸盐蛋白聚糖的生物合成和代谢过程以及硫酸软骨素的分解代谢和生物合成中发挥重要作用;KEGG结果表明:上调蛋白主要富集在近端小管碳酸氢盐回收、胆汁分泌、N-聚糖生物合成、胰岛素分泌、醛固酮的合成和分泌等通路;下调蛋白主要富集在神经退行性疾病的途径,如阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病、脊髓小脑性共济失调等.结论:肺腺癌骨转移组与非骨转移组蛋白存在明显差异,通过发现新型蛋白标志物为早期筛查诊断骨转移提供新线索.

目的 基于血管内皮保护的关键药效环节,发现能够反映注射用丹参多酚酸(SAFI)的质量生物标志物(Q-biomarkers),为完善其质量控制评价提供参考.方法 90 ℃加热处理SAFI 4、18、60 h,得到不同化学质量的SAFI(SAFI4、SAFI18、SAFI60),高效液相色谱(HPLC)法分析紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸Y、丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸变化趋势.体外培养小鼠脑微血管内皮细胞(bEnd.3),建立氧糖剥夺/复氧(OGD/R)模型,给予SAFI、SAFI4、SAFI18、SAFI60处理18h,CCK-8法检测细胞相对存活率,试剂盒法检测上清液乳酸脱氢酶(LDH)、NO水平,划痕实验检测细胞迁移率;通过DIA蛋白质组学分析不同化学质量的SAFI给药后产生的差异蛋白,结合药效学及偏最小二乘回归(PLSR)分析筛选SAFI的Q-biomarkers.结果 与SAFI相比,SAFI4、SAFI18、SAFI60样品中的紫草酸、丹酚酸B和丹酚酸Y含量下降,丹参素钠含量上升,原儿茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸变化不明显.药效学结果表明,与模型组相比,SAFI、SAFI4及SAFI18组细胞相对存活率显著上升、LDH泄漏量显著下降、NO水平显著下降、细胞迁移率显著升高(P＜0.05、0.01、0.001),对细胞具有显著保护作用;而SAFI60组无明显保护作用.蛋白质组学结果表明,18个差异蛋白的含量随药效学和成分的变化而发生一致性上升或下降,与药效进行相关性分析发现Kdr、Cxcl12的变量重要性投影值(VIP)皆大于1,尤其Kdr[血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)]与血管内皮功能高度相关,可能是潜在的SAFI的Q-biomarkers.结论 通过不同化学质量的SAFI的内皮保护药效及差异蛋白关联分析发现,VEGFR2可以作为SAFI的 Q-biomarker.

目的 采用血清蛋白质组学方法探讨培土清心颗粒(白术、连翘、白茅根、太子参等)治疗特应性皮炎的作用靶点.方法 选择特应性皮炎患者 5 例,以培土清心颗粒治疗 12 周,并以健康志愿者 5 例作为对照.对特应性皮炎患者治疗后的临床核心评价指标包括病情严重程度评分(EASI、SCORAD)、瘙痒程度评分、患者自评(POEM)、生活质量指数等进行评估.采用数据非依赖采集质谱(DIA-MS)技术检测血清样本,并根据P＜0.05、变化倍数(Fold Change)＞1.2 筛选出特应性皮炎患者与健康人群的血清差异蛋白,以及培土清心颗粒治疗前后特应性皮炎患者的血清差异蛋白.对差异蛋白进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析.结果 (1)与治疗前比较,特应性皮炎患者治疗后的临床核心评价指标包括病情严重程度评分(EASI、SCORAD)、瘙痒程度评分、患者自评(POEM)、生活质量指数等均得到明显改善,差异均有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01).(2)健康对照组及特应性皮炎组共分析出 28 个差异性蛋白,其中 12 个蛋白表达水平上升,16 个蛋白表达水平下降,包括ALAD(δ-氨基乙酰丙酸脱水酶)、LTA4H(白三烯A-4 水解酶)、CA1(碳酸酐酶 1)、F11(凝血因子XI)、LCP1(淋巴细胞胞浆蛋白 1)等.主要涉及PI3K-AKT信号通路、脂质与动脉粥样硬化、ECM-受体相互作用、血小板活化、NF-κB信号通路、中性粒细胞外陷阱形成等信号通路.(3)特应性皮炎患者经培土清心颗粒治疗前后共分析出 12 个差异蛋白,其中 8 个蛋白表达水平上升,4 个蛋白表达水平下降,包括ALAD、FGA(纤维蛋白原α链)、IGHV3-64D及IGHV3-38 等.主要涉及脂质与动脉粥样硬化、补体途径、金黄色葡萄球菌感染、NF-κB信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化等信号通路.(4)ALAD、FGA、IGHV3-64D等 3 个蛋白靶点在特应性皮炎患者中的表达显著下调,而在培土清心颗粒治疗后显著上调.结论 差异表达蛋白ALAD、FGA、IGHV3-64D可能是培土清心颗粒治疗特应性皮炎的作用靶点,为进一步实验验证奠定了基础.

通过脑脊液(cerebrospinal fluid,CSF)蛋白质组学探讨二仙汤抗迟发性抑郁症(late-onset depression,LOD)神经发生障碍的机制.66只20～21月龄自然衰老Wister大鼠,分为自然衰老(AGED)组、LOD组和二仙汤(EXD)治疗组.以自然衰老结合慢性不可预知轻度应激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)连续造模6周制备LOD模型.造模期间EXD组给予EXD(4 g·kg-1,每日2次)灌胃,AGED组和LOD组给予生理盐水灌胃.造模结束进行糖水偏好、旷场、强迫游泳、水迷宫等行为学检测.运用免疫荧光法观察各组大鼠海马DG区Ki-67/Nestin、BrdU/DCX阳性细胞数.体外实验采用高浓度皮质酮(CORT)合并D-氨基半乳糖胺(D-gal)模拟LOD相关应激和衰老的改变,观察各组大鼠CSF对高浓度CORT合并D-gal条件下原代海马神经干细胞增殖、分化的影响.采用数据非依赖性采集(data-independent acquisition,DIA)蛋白组测序技术分析各组大鼠CSF差异蛋白,并对差异蛋白进行生物信息学分析.行为学结果显示,与AGED组相比,LOD组糖水消耗量、旷场总路程、水迷宫寻找站台次数均显著下降(P＜0.01),强迫游泳不动时间显著延长(P＜0.01),提示LOD大鼠出现快感丧失、自主活动能力下降以及认知功能障碍.与LOD组相比,EXD组行为学异常均明显改善(P＜0.01,P＜0.05).免疫荧光显示LOD大鼠海马DG区Ki-67/Nestin、BrdU/DCX阳性细胞数显著下降(P＜0.05),与LOD组比较,EXD组大鼠DG区阳性细胞数显著增多(P＜0.05).体外实验显示,CORT合并D-gal模型下,原代海马神经干细胞增殖、分化能力显著降低(P＜0.01),LOD大鼠CSF进一步恶化高浓度CORT合并D-gal模型下原代海马神经干细胞增殖、分化能力(P＜0.01),EXD组CSF可有效缓解CORT合并D-gal模型的损伤(P＜0.01).DIA蛋白组学在大鼠CSF中检测出2620个蛋白,其中AGED组与LOD组存在显著差异蛋白135个;经EXD干预后,与LOD组比较,共有176个显著差异蛋白;其中与神经发生密切相关的有GDF 11、NrCAM、NTRK2、GhR等;而同时被LOD和EXD调控的蛋白共有39个.实验结果表明,EXD具有良好的抗LOD功效,改善LOD大鼠自主活动能力、改善其认知功能以及维持其海马神经干细胞增殖分化.EXD可能通过调控CSF中与神经发生有关的蛋白如GDF11、NrCAM、NTRK2、GhR,维持海马神经发生,发挥抗LOD的作用.

数据非依赖采集(DIA)是蛋白质组学领域近年来快速发展的质谱采集技术,其通过无偏碎裂隔离窗口内的所有母离子采集二级谱图,理论上可实现蛋白质样品的深度覆盖,同时具有高通量、高重现性和高灵敏度的优点.现有的DIA数据采集方法可以分为全窗口碎裂方法、隔离窗口序列碎裂方法和四维DIA数据采集方法(4D-DIA)3大类.针对DIA数据的不同特点,主要数据解析方法包括谱库搜索方法、蛋白质序列库直接搜索方法、伪二级谱图鉴定方法和从头测序方法4大类.解析得到的肽段鉴定结果需要进行可信度评估,包括使用机器学习方法的重排序和对报告结果集合的假发现率估计两个步骤,实现对数据解析结果的质控.本文对DIA数据的采集方法、数据解析方法及软件和鉴定结果可信度评估方法进行了整理和综述,并展望了未来的发展方向.