目的 探讨温胆汤含药血清对10 mmol/L谷氨酸诱导的大鼠星型胶质细胞凋亡、周期及磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)、蛋白激酶 B(protein kinase B,Akt)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of ra-pamycin,mTOR)表达的影响.方法 将60只SPF级SD雄性大鼠随机分为5组,其中正常组20只,氯氮平组和温胆汤高、中、低剂量组各10只.正常组予20 g/kg 0.9％氯化钠溶液灌胃,氯氮平组予氯氮平原药20 mg/kg灌胃,温胆汤高、中、低剂量组分别予40、20、10 g/kg温胆汤灌胃,1次/d,共8 d.处死大鼠后取血,离心取血清,灭活除菌,EP管分装备用.将大鼠星型胶质细胞分为正常血清组、模型血清组,氯氮平含药血清组和温胆汤高、中、低剂量含药血清组,除正常血清组外,其余各组予10 μmol/mL谷氨酸处理48 h后,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期;Western bloting、Real-time PCR分别测定细胞PI3K、Akt、mTOR蛋白和mRNA表达.结果 温胆汤含药血清可明显降低谷氨酸环境下大鼠星型胶质细胞凋亡率(P＜0.01)和G0/G1期细胞占比(P＜0.05),升高S期及G2/M期细胞占比;降低细胞P-P13K/P13K、P-ATK/AKT、P-mTOR/mTOR蛋白表达比值(温胆汤低剂量血清组除外,P＜0.05)和细胞PI3K、Akt、mTOR mR-NA表达(温胆汤低剂量血清组除外,P＜0.01).结论 温胆汤含药血清可有效调节大鼠星形胶质细胞PI3K、Akt、mTOR表达,达到保护神经细胞的目的,这可能是温胆汤治疗精神分裂症的作用机制之一.

目的 观察香芹酚对2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)小鼠损伤肝脏的保护作用,并从Toll样受4(Toll-like receptor4,TLR4)/核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)、蛋白激酶 B1(protein kinase B1,AKT1)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路的角度探讨其可能的分子机制.方法 将自发性2型糖尿病db/db小鼠随机分为模型组、香芹酚组,并将db/m小鼠设置为对照组.给药6周后检测小鼠空腹血糖(fasting blood glucose,FBG);酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法检测 空腹胰岛素、糖化血清蛋白(glycated serum protein,GSP)、谷草转氨酶(aspartate transaminase,AST)、谷丙转氨酶(alanine aminotrans,ALT)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C);苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)及碘酸雪夫氏染色(periodic Acid-Schiff stain,PAS)观察肝组织病理形态学变化;蛋白免疫印迹法(Western Blot,WB)检测小鼠肝组织中TLR4、NF-κB、核苷酸结合寡聚化域蛋白样受体3(Nod-like receptor protein 3,NALP3)、AKT1、磷酸化蛋白激酶B1(phospho-protein kinase B1,p-AKT1)、胰岛素受体(Iusulin receptor,INSR)、磷酸化胰岛素受体(phospho-Iusulin recep-tor,p-INSR)、mTOR、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phospho-mammalian target of rapamycin,p-mTOR)、胰岛素受体底物 1(Iusulin receptor substrate 1,IRS1)和磷酸化胰岛素受体底物 1(phospho-Iusulin receptor substrate 1,p-IRS1)蛋白表达.结果 香芹酚组小鼠的空腹血糖、GSP、AST、ALT、TC、LDL-C、TG 水平、TLR4、NF-κB、NALP3、INSR、p-INSR、IRS1、p-IRS1蛋白水平明显下降(P＜0.05),HDL-C水平明显升高(P＜0.05),香芹酚组肝脏组织病理损伤较模型组明显减少.结论 香芹酚对T2DM小鼠损伤的肝脏具有保护作用,其机制可能与抑制TLR4/NF-KB、ATK1/mTOR炎症信号通路有关.

猴头菇是一种珍贵的食药两用大型真菌,常用于慢性胃炎、胃溃疡的治疗.为了探究猴头菇治疗慢性胃炎、胃溃疡的作用机制,本研究采用网络药理学方法筛选出猴头菇的活性成分、潜在作用靶点及相关信号通路,并通过分子对接技术对关键的化合物与潜在作用靶点的结合能力进行验证.研究结果表明,猴头菇中 121 个次级代谢产物和 163 个靶点共同参与慢性胃炎、胃溃疡治疗,蛋白质互作网络分析显示 VEGFA、JUN、STAT3、TNF、IL6、ALB、AKT1 和 EGFR 等为关键靶点,KEGG 通路富集筛选得到 28 条信号通路.分子对接结果显示,猴头菇治疗慢性胃炎、胃溃疡的潜在关键化合物 fomentarol A(24)、erinarol H(21)、(22E,24R)-6-O-acetylergosta-7,22-diene-3β,5α,6β-triol(14)和染料木素(genistein,110)分别与 AKT1、JAK2、PTGS2、PPARG、EGFR、ALB 和 TNF 等靶点具有十分良好的结合性能.本研究首次采用网络药理学方法对猴头菇治疗慢性胃炎、胃溃疡可能的作用机制进行了研究.结果表明猴头菇的活性成分可以通过多通路作用于多个靶点来治疗慢性胃炎、胃溃疡,为其临床使用提供了一定的科学依据.

目的 探讨参桃软肝方抗肝癌的作用及机制.方法 四甲基噻唑蓝(Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测参桃软肝方对人肝癌细胞HepG2活性及胞内磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B/丝裂原活化蛋白激酶(Phosphatidylinositol-3-kinase/Protein Kinase B/mitogen-activated protein kinase,PI3K/Akt/MAPK)抑制剂:LY294002、Atk抑制剂(Akt inhibitor,Akti)、分裂原活化抑制剂(MEK inhibitor,MEKi)、c-Jun氨基末端蛋白激酶抑制剂(c-Jun N-terminal protein kainse inhibitor,JNKi)、凋亡抑制剂(Z-VAD)、自噬抑制剂(Wortmanin)、铁死亡抑制剂(Ferrostatin-1)、细胞坏死抑制剂(Necrostatin-1)对参桃软肝方抑制人肝癌细胞HepG2活性的影响;乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)法检测参桃软肝方对人肝癌细胞HepG2的毒性作用;实时荧光定量(Real-time PCR)检测参桃软肝方对人肝癌细胞HepG2焦亡标志物白介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)的影响;蛋白质印迹法(Western blot)检测参桃软肝方对人肝癌细胞HepG2中Akt/ERK信号通路关键蛋白Akt、ERK、P-ERK蛋白表达的影响,凋亡信号通路关键蛋白半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(Caspase 3)、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl2)、Bcl2-Associated X的蛋白质(Bax),细胞焦亡标志物卵裂半胱天冬酶1(Cleavaged Caspase-1)蛋白表达的影响.结果 参桃软肝方及醇提上清和沉淀都能有效抑制人肝癌细胞HepG2的活性(P<0.05),LY294002、Wortmanin、Akti、MEKi、JNKi、Z-VAD、Ferrostatin-1、Necrostatin-1对参桃软肝方、醇提上清和沉淀抑制人肝癌细胞HepG2活性没有显著的影响;参桃软肝方促进人肝癌细胞HepG2中LDH的释放,引起细胞毒性;参桃软肝方抑制人肝癌细胞HepG2焦亡标志物IL-1β和Cleavaged Caspase-1的表达;参桃软肝方降低人肝癌细胞HepG2中Akt的蛋白表达,升高Caspase3蛋白表达量.结论 参桃软肝方具有抑制肝癌细胞活性、抗肝癌的作用,其作用机制可能与自噬、坏死性凋亡等程序性死亡方式及PI3K/Akt/MAPK信号传导无关;能抑制Akt的表达和促进Caspase3表达有关.同时,能降低焦亡标志物IL-1β和Cleavaged Caspase-1表达,很可能通过阻断细胞焦亡过程起作用.参桃软肝方抗肝癌活性优于总提物醇提上清和沉淀,醇提上清和沉淀很可能存在协同抗肝癌的作用.

目的 探讨丙戊酸钠联合紫杉醇对荷瘤裸鼠的抗肿瘤作用及其机制.方法 构建裸鼠移植瘤模型(将MKN45细胞移植于裸鼠右上腋,使成为荷瘤裸鼠)共48只,并随机分为4组(每组12只):对照组(给予生理氯化钠溶液)、丙戊酸钠组(丙戊酸钠治疗),紫杉醇组(紫杉醇治疗),联合治疗组(给予丙戊酸钠+紫杉醇).用药21d后将裸鼠处死,取瘤体组织进行HE、TUNEL染色,并用Western blotting检测MKN45肿瘤细胞中线粒体信号通路及P13K/AKT/mTOR信号通路相关凋亡因子的变化情况.结果 与对照组比较,丙戊酸钠组、紫杉醇组均表现出较多死亡细胞及凋亡细胞数,联合治疗组死亡细胞及凋亡细胞数均多于单独用药组;单独用药组与对照组比较,促凋亡蛋白t-Bid(丙戊酸钠组除外)、Bax、Puma、Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9表达水平明显上调,Bcl-2、Mcl-1、Bcl-xL抗凋亡蛋白表达水平有明显下调(P＜0.05);联合治疗组与对照组比较,促凋亡蛋白t-Bid、Bax、Puma、Cleaved-easpase3、Cleaved-caspase9表达水平下调更明显(P＜0.01);与对照组比较,联合治疗组p-p70S6K、Raptor、P13Kp110α、p-AKT-Ser473蛋白水平下调明显,有显著性差异(P＜0.01),下调幅度优于单独用药组(P＜0.05).结论 丙戊酸钠联合紫杉醇用于荷瘤裸鼠抗肿瘤的治疗,能促进MKN45肿瘤细胞的凋亡,其机制主要是通过调节线粒体信号通路和P13K/AKT/mTOR信号通路的相关凋亡蛋白共同作用的结果.

目的 研究蒙药乌力地格对胶质瘤生长的影响并初步探讨作用机制.方法 建立人胶质瘤细胞系U251裸鼠移植瘤模型,待肿瘤细胞接种后第7天,将裸鼠随机分为3组:对照组、10 mg/kg给药组、20 mg/kg给药组、40 mg/kg给药组.灌胃给予不同剂量的蒙药乌力地格,每隔1天测量肿瘤体积,持续给药14 d后处死裸鼠,取出肿瘤,分析蒙药乌力地格对胶质瘤生长的影响.ELISA检测肿瘤组织凋亡情况.qRT-PCR和WB检测不同组肿瘤组织中PI3K、AKT和mTOR的mRNA和蛋白表达水平.WB检测不同组肿瘤组织中自噬相关蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和Bec-lin-1的表达情况.结果 蒙药乌力地格呈剂量依赖性的抑制胶质瘤裸鼠移植瘤生长,促进胶质瘤组织中细胞凋亡.蒙药乌力地格呈剂量依赖性抑制PI3K、AKT和mTOR的mRNA和蛋白表达水平.蒙药乌力地格促进胶质瘤细胞自噬.结论 蒙药乌力地格抑制胶质瘤生长,其通过PI3K/Atk/mTOR信号通路促进胶质瘤细胞的凋亡,并诱导胶质瘤细胞发生自噬作用.

目的 利用高通量测序平台研究非小细胞肺癌(NSCLC)热点基因突变情况,系统性分析突变位点的分布、类型以及频度,评估突变位点致病性.方法 本研究共纳入94例NSCLC组织样本,均为2015年7月至2017年4月在山东大学齐鲁医院胸外科收集的非小细胞肺癌(NSCLC)石蜡包埋(FFPE)和新鲜组织样本.患者年龄在35～82岁之间,年龄中位数是61岁.男性63例,女性31例.选择22个基因:KRAS、EGFR、BRAF、PIK3CA、AKT1、ERBB2、PTEN、NRAS、STK11、MAP2K1、ALK、DDR2、CTNNB1、MET、TP53、SMAD4、FBXW7、FGFR3、NOTCH1、ERBB4、FGFR1和FGFR2.用Thermo fisher公司Ion Torrent测序平台的Ion Ampli Seq Colon and Lung Cancer Panel进行测序.Ion Torrent平台测序数据使用Ion torrent suite v4.4.2软件进行分析.结果 在NSCLC常见的22个突变基因中,TP53基因突变频率最高,约占所有突变的46.9％,其次是EGFR基因(占28.1％);共检测出89种突变,包括63种热点突变(已报道的位点)和26种新发突变(未见报道的位点),其中检出频率最高的是EGFR基因的19号外显子缺失突变,其次是EGFR基因的Leu858Arg;分析EGFR基因的靶向用药位点的突变情况,结果显示EGFR的19号外显子的缺失突变检出次数最高,其次是21号外显子L858R突变;利用生物信息学软件分析了26种新发突变的致病性,结果显示除ATK1:c.47-12G>A和TP53:c.214C>G这两个位点以外,剩余的24种新发突变位点在基因保守性、氨基酸序列变化、蛋白结构影响三个方面至少有一项会对基因的功能产生重大影响.结论 本研究通过NGS对NSCLC多个敏感基因的突变位点进行联合检测,更能全面覆盖基因变异情况,为筛选最适宜靶向治疗的群体提供依据.新发突变的致病性预测以及所涉及的肿瘤相关信号通路的改变,为后续为进一步研究NSCLC致病机制提供参考.

目的 探讨红毛五加多糖(AGP)对心衰大鼠心肌细胞凋亡及PI3K/AKT信号通路的影响.方法 将120只2～3月龄SPF级SD大鼠(雌雄各半)随机分为假手术组、心力衰竭模型组和AGP低、中、高剂量组,每组20只.AGP低中高剂量组皮下注射AGP(10、20、30 mg· kg-1·d-1),假手术组和模型组皮下注射等量生理盐水.预给药4d后采用左冠状动脉前降支结扎术建立大鼠心衰模型.建模42 d后,通过超声检测左室短轴缩短率(FS)及左室射血分数(EF);邻苯三酚法及硫代巴比妥酸法分别测定超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量;TUNEL试剂盒测定心肌细胞凋亡率;免疫印迹检测Bcl-2、Bax、PI3K和p-ATK蛋白表达.结果 与假手术组比较,模型组EF值和FS值明显降低[(31.88±2.56)％比(99.71±0.42)％、(18.02±1.52)％比(91.12±3.44)％,均P＜0.05)],SOD活性明显降低[(90.21±6.12)nU/ml比(124.93±8.87) nU/ml,P＜0.05)],MDA含量明显升高[(6.47±0.68) nmol/ml比(3.68±0.39) nmol/ml,P＜0.05)],心肌细胞凋亡率明显升高[(22.38±1.42)％比(5.02±0.51)％,P＜0.05)],Bcl-2、PI3K和p-ATK蛋白表达明显降低(0.087±0.010比0.762±0.059、0.052±0.005比0.859±0.072、0.021±0.005比0.151±0.016,均P＜0.05),Bax蛋白表达明显升高(0.087±0.010比0.762±0.059,P＜0.05).与模型组比较,低、中、高剂量AGP组EF值、FS值、SOD活性均明显升高(均P＜0.05),MDA含量、心肌细胞凋亡率明显降低(均P＜0.05),Bcl-2、PI3K和p-ATK蛋白表达明显升高(均P＜0.05),Bax蛋白表达明显降低,且有浓度依赖性(P＜0.05).结论 AGP可降低心衰大鼠心肌细胞凋亡,机制可能与抑制氧化应激及激活PI3K/AKT信号通路有关.

目的:从PI3K/AKT信号转导通路探讨当归多糖、黄芪多糖及其配伍对化疗性骨髓抑制小鼠骨髓干细胞的调控机制.方法:C57BL/6小鼠20只,雌雄各半,28～ 32 9.给模型组小鼠每日腹腔注射1次环磷酰胺380 mg· kg-1,正常小鼠腹腔注射等量生理盐水,连续3d.造模后,以脱颈椎法处死各组小鼠,取出股骨,剔除肌肉和结缔组织,剪开股骨两端,用6号针头以生理盐水反复冲洗骨髓腔,并将冲出的骨髓打碎,再用4号针头过滤制成单个细胞悬液,在离心机上2000r/min,离心10 min,去上清液,加入4 mL冷70％乙醇固定,上振荡器摇匀制成骨髓干细胞样本.细胞实验分为6组,包括正常组、模型组、EPO组、EPO+(G-CSF)组、当归多糖组、黄芪多糖组、两药配伍组.直接给药当归多糖0.2 mg/mL,黄芪多糖0.2 mg/mL,EPO 50 U/mL,(G-CSF)50 U/mL于骨髓干细胞体外培养体系中,培养3d,室内18 ～20℃,20％相对湿度,5％CO2,37℃孵育箱.采用MTT法检测骨髓干细胞生长和增殖的情况;采用ELISA检测骨髓干细胞中pPI3K和p-AKT的蛋白含量;采用RT-qPCR法检测骨髓干细胞中PBK、AKT、PTEN的mRNA表达.结果:(1)对小鼠骨髓干细胞生长和增殖的影响.①造模后24 h,各给药组与模型组比较均有明显差异.当归多糖与黄芪多糖有交互作用,合用不如单用当归多糖.②造模后48 h,各给药组与模型组比较均有明显差异,药物组之间差异均没有统计学意义.当归多糖与黄芪多糖有交互作用,合用比单一用药好.③造模后72 h,各给药组与模型组比较均有明显差异.当归多糖与黄芪多糖有交互作用,合用比单一用药好.(2)对PI3K、AKT的mRNA表达的影响.各给药组与模型组PI3K、Akt的mRNA比较均有明显差异,当归多糖与黄芪多糖均有提升PI3K、Akt的mRNA作用,两药交互作用无统计学意义.(3)对pPI3K、p-AKT蛋白含量的影响.各给药组与模型组pPI3K、p-ATK的蛋白含量比较均有明显差异,当归多糖与黄芪多糖有交互作用,合用比单一用药好.(4)对PTEN mRNA表达的影响.各给药组与模型组PTEN mRNA比较均有明显差异,当归多糖与黄芪多糖交互作用明显,合用比单一用药好.结论:(1)当归多糖、黄芪多糖及其配伍能够促进化疗性骨髓抑制小鼠骨髓干细胞增殖,两药配伍的作用优于单一用药.(2)当归多糖、黄芪多糖及两药配伍能够上调PI3K、AKT mRNA的表达,增加pPI3K和p-AKT的蛋白含量,下调PTEN mRNA的表达,两药配伍的作用优于单一用药.(3)当归多糖、黄芪多糖及两药配伍激活了PI3 K/AKT信号转导通路,两药治疗化疗性骨髓抑制的作用可能与PI3K/AKT通路有关.

造血干细胞、巨核系祖细胞在细胞因子、激素、趋化因子的作用下增殖、分化为成熟巨核细胞并释放血小板.血小板计数(PLT)正常范围是(125～350)×109/L,低于正常值下限即血小板减少症.常见原因有自身免疫、药物毒性引起血小板破坏或骨髓恶性疾病、病毒、机会性感染等直接影响巨核细胞而导致血小板生成减少.控制原发疾病和细胞因子是治疗血小板减少症的主要手段.目前治疗血小板减少的细胞因子主要有白介素(IL)-11、重组人血小板生成素(recombinant human thrombopoietin,Rh-TPO)、罗米司亭(TPO拟肽)及艾曲波帕.RhTPO、罗米司亭直接与血小板生成素受体(MPL)结合发挥作用,IL-11则通过与IL-3、TPO协同作用发挥作用.艾曲波帕是一种非肽类TPO类似物,通过结合MPL跨膜区H499残基,激活并增强STAT3/5、ATK及MAPK通路促进巨核细胞增殖、成熟[1].研究显示,艾曲波帕对MPL下游通路的活化能力要高于TPO及罗米司亭,促进多能造血干细胞及巨核系祖细胞增殖、分化,同时参与巨核细胞的存活及抗凋亡[2].本文对艾曲波帕的临床应用进行综述.