目的:观察不可逆电穿孔技术对5-氟尿嘧啶(5-Fu)耐药的人肝癌细胞(BEL-7402/5-Fu，购自南京凯基生物科技发展有限公司)生长、细胞膜完整性以及荷瘤鼠肿瘤生长的影响。方法:细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞存活率。透射电镜、扫描电镜拍照以及乳酸脱氢酶(LDH)检测来评价细胞膜完整性。构建BEL-7402/5-Fu细胞裸鼠异种移植瘤模型来评价体内抗肿瘤效果。采用单因素方差分析。结果:高压电场显著抑制BEL-7402/5-Fu细胞生长并且呈场强依赖性，高压电场处理24 h后，500、750、1 000、1 500、2 000 V/cm组的细胞存活率为(89.56±12.37)%、(66.29±7.47)%、(29.19±3.62)%、(17.66±1.64)%、(11.74±1.08)%( F＝77.730， P<0.01)。扫描电镜以及透射电镜结果表明，在场强为1 000 V/cm时，实验组的细胞膜完整性以及细胞器结构损伤严重。高压电场500、750、1 000、1 500、2 000 V/cm各组的细胞培养基上清中LDH分泌水平分别为(35.33±8.74)、(64.33±7.67)、(144.02±12.16)、(194.33±5.13)、(207.33±11.01)、(213.33±20.81) U/L( F＝122.690， P<0.01)，呈场强依赖性。高压电场能够抑制BEL-7402/5-Fu荷瘤鼠肿瘤的生长，模型组的瘤重为(1.51±0.32) g，高压电场治疗组小鼠的瘤重为(0.28±0.05) g( F＝619.870， P<0.01)，抑瘤率达81.45%。 结论:高压电脉冲能显著抑制BEL-7402/5-Fu细胞生长。

目的:探讨蜂毒肽Melittin突变体Melittin-K1逆转人肝癌耐药细胞株BEL-7402/5-FU多药耐药性的作用及机制。方法:采用CCK-8法检测细胞活率评价Melittin-K1对BEL-7402/5-FU细胞生长的影响以及Melittin-K1能否逆转BEL-7402/5-FU细胞的耐药性。实时荧光定量PCR技术对Melittin-K1处理后BEL-7402/5-FU细胞多药耐药基因MDR1表达的改变进行测定。流式细胞术检测细胞表面P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的表达以及细胞内罗丹明-123的蓄积水平评价Melittin-K1对P-gp蛋白表达及其功能的影响。结果:细胞体外增殖实验结果表明，Melittin-K1显著抑制BEL-7402/5-FU细胞生长。Melittin-K1下调BEL-7402/5-FU细胞MDR1基因的表达并抑制细胞膜表面P-gp的表达水平及功能。结论:新型多肽Melittin-K1具有逆转肝癌耐药细胞株BEL-7402/5-FU多药耐药性的作用。

目的:探讨美洲大蠊提取物CⅡ-3和脱脂膏对肝癌耐5-氟尿嘧啶细胞(BEL-7402/5-FU)自噬和转移侵袭能力的影响.方法:以肝癌敏感细胞BEL-7402和肝癌耐药细胞BEL-7402/5-FU作为实验对象,给予索拉菲尼、CⅡ-3和脱脂膏处理,检测自噬标志蛋白的生成,同时检测细胞中自噬相关因子和侵袭转移相关因子的水平以及细胞侵袭转移能力的变化.结果:耐药细胞组中p62蛋白低表达,给予阳性药索拉菲尼、CⅡ-3和脱脂膏后,细胞中p62蛋白表达量明显升高.和敏感细胞相比,耐药细胞中LC3B生成增多,给予CⅡ-3后LC3B生成减少.CⅡ-3和脱脂膏给药组均能明显抑制自噬和侵袭转移的部分相关因子的表达,包括降低ATG5、PIK3C3、BECLIN、LC3B、MMP-9、Akt、4EBP1 mRNA表达.划痕试验结果显示,相比于敏感细胞,耐药细胞具有更强的侵袭转移能力,给予索拉菲尼和CⅡ-3作用后均可显著抑制细胞的侵袭转移,而脱脂膏则无显著的抑制效果.结论:肝癌耐药细胞具有很强的自噬和侵袭转移能力,而美洲大蠊提取物CⅡ-3和脱脂膏体外均能明显抑制耐药细胞的自噬和侵袭转移,但仅能影响部分相关因子.

目的 研究美洲大蠊提取物CII-3 和脱脂膏对肝癌耐药细胞BEL-7402/5-FU自噬和侵袭转移的影响以及初步的作用机制.方法 对接种肝癌敏感细胞BEL-7402 和肝癌耐药细胞BEL-7402/5-FU的移植瘤裸鼠,通过索拉菲尼、CII-3 和脱脂膏药物处理后,观察给药后裸鼠血清生化指标,裸鼠瘤块变化和心、肝、肾、脾等脏器指数的变化,以及肝脏和瘤块病理学改变,同时观察肿瘤组织细胞中的自噬相关因子和侵袭转移相关因子的变化.结果 CII-3 和脱脂膏能使裸鼠体重呈下降趋势,并抑制肿瘤的生长,明显减轻瘤重(P<0.01);CII-3 能提高脾脏指数和心脏指数(P<0.05);与耐药组相比,CII-3 组裸鼠血清CR有升高趋势(P<0.05);索拉菲尼和CII-3 处理组能诱导肿瘤组织坏死,作用优于脱脂膏组;与耐药组相比,除AKT外(P>0.05),CII-3和脱脂膏给药组均能明显抑制自噬和侵袭转移相关因子(P<0.05).结论 美洲大蠊提取物CII-3 和脱脂膏均能抑制肝癌耐药细胞的自噬和侵袭转移,同时具有较好的抑瘤作用.其对裸鼠肝癌移植瘤的肝肾损伤有待进一步观察.

目的:探讨冬凌草甲素对人肝癌BEL-7402/5-FU细胞增殖、凋亡和细胞周期及Hippo信号通路的影响.方法:采用不同浓度的冬凌草甲素作用于人肝癌BEL-7402/5-FU细胞,细胞计数法(CCK-8)检测细胞增殖抑制率,CCK-8法测定细胞耐药逆转指数,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡,实时荧光定量PCR法检测各组细胞Yes相关蛋白(YAP)、转录共激活因子(TAZ)的mRNA表达水平,West-ern Blot法检测各组细胞中细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、结缔组织生长因子(CTGF)、生存素(Survivin)、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)的蛋白表达水平.结果:不同浓度冬凌草甲素对人肝癌BEL-7402/5-FU细胞具有不同程度增殖抑制作用,确定最适逆转浓度,即4 μmol/L冬凌草甲素用于后续实验.冬凌草甲素能够阻滞细胞周期至G2 期,诱导细胞发生凋亡,抑制YAP、TAZ mRNA表达以及Survivin、Bcl-2蛋白表达.结论:冬凌草甲素能阻碍BEL-7402/5-FU细胞周期进程,诱导细胞凋亡,其抗肿瘤机制可能与干预Hippo信号通路有关.

Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most refractory cancers.The mechanisms by which hypoxia further aggravates therapeutic responses of advanced HCC to anticancer drugs remain to be clarified.Here,we report that hypoxia (1％ O2) caused 2.55-489.7-fold resistance to 6 anticancer drugs (sorafenib,5-fluorouracil [5-FU],gemcitabine,cisplatin,adriamycin and 6-thioguanine) in 3 HCC cell lines (BEL-7402,HepG2 and SMMC-7721).Among the 6 drugs,sorafenib,the sole one approved for HCC therapy,inhibited proliferation with little influence from hypoxia and displayed the smallest variation among the 3 HCC cell lines tested.By contrast,the inhibition of proliferation by 5-FU,which has been extensively tested in clinical trials but has not been approved for HCC therapy,was severely affected by hypoxia and showed a large variation among these cell lines.In 5-FU-treated HCC cells,hypoxia reduced the levels of basal thymidylate synthase (TS) and functional TS,leading to decreased dTMP synthesis and DNA replication.Hypoxia also affected the accumulation of FdUTP and its misincorporation into DNA.Consequently,both single-strand breaks and double-strand breaks in DNA were reduced,although hypoxia also inhibited DNA repair.In 5-FU-treated HCC cells,hypoxia further abated S-phase arrest,alleviated the loss of mitochondrial membrane potential,diminished the activation of caspases,and finally resulted in reduced induction of apoptosis.Thus,hypoxia induces universal but differential drug resistance.The extensive impacts of hypoxia on the anticancer mechanisms of 5-FU contributes to its hypoxia-induced resistance in HCC cells.We propose that hypoxiainduced drug resistance and interference of hypoxia with anticancer mechanisms could be used as candidate biomarkers in selecting and/or developing anticancer drugs for improving HCC therapy.

目的 研究DNA依赖蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)基因沉默后对Bel7402/5-氟尿嘧啶(5-Fu)耐药肝癌细胞的细胞周期及机制的影响,探讨DNA-PKcs影响化疗敏感性的相关机制.方法 采用MTT法检测Bel7402/5-Fu细胞转染siDNA-PKcs后,对5-Fu、阿霉素(ADM)的敏感性;采用阳离子脂质体法将siDNA-PKcs寡核苷酸片段转染Bel7402/5-Fu细胞;流式细胞术检测细胞周期;Western blot法检测细胞P21、细胞周期蛋白B1(cyclin Bl)、细胞分裂周期蛋白2(CDC2)的蛋白表达情况;实时定量PCR检测细胞毛细血管扩张共济失调突变基因(ATM)、p53的mRNA水平,Western blot法检测细胞ATM、P53蛋白水平.结果 敲低细胞DNA-PKcs水平后,siDNA-PKcs组5-Fu、ADM的半数抑制浓度(IC50)明显降低,S期细胞减少、G2/M期细胞增多,细胞周期抑制因子P21蛋白水平增加,cyclin B1、CDC2蛋白水平降低,ATM、p53的mRNA及蛋白水平增加.结论 敲低DNA-PKcs水平,增加P21蛋白水平,同时抑制cyclin B1、CDC2蛋白水平,诱导Bel7402/5-Fu细胞G2/M期阻滞,其机制可能与ATM-p53信号途径有关.

目的 研究姜黄素(CU)/5-氟尿嘧啶(5-FU)对肝癌细胞(SMMC-7721、Bel-7402)的生长抑制作用.方法 MTT法用于检测CU和5-FU单用及联合应用对肝癌细胞的生长抑制作用.结果 CU和5-FU单用时能明显抑制肝癌SMMC-7721及Bel-7402细胞的增殖,并呈现浓度依赖性,两药单独作用于肝癌SMMC-7721细胞48 h的IC50值分别为(89.06±11.85)μmol·L-和(21.90±1.54) μmol·L-1,作用于肝癌Bel-7402细胞48 h的IC50值分别为(94.74±4.03) μmol·L-和(38.48±2.27) μmol·L-1.当CU和5-FU联合应用比例为1∶1(mol∶mol)时,两药联合应用时对肝癌SMMC-7721和Bel-7402细胞呈协同抑制作用(CI＜1),作用48 h的IC50值分别为(4.95±1.20) μmol·L-1和(19.30±2.29) μmol·L-1.结论 CU与5-FU联合应用对肝癌SMMC-7721及Bel-7402细胞的增殖具有协同抑 制作用,并且明显优于单药.

目的 探讨Artemis对人肝癌耐药细胞株BEL-7402/5-FU化疗药物敏感性的影响及其可能机制.方法 将pS-GU6/ GFP/Neo/ shArtemis干扰质粒转染人肝癌耐药细胞BEL-7402/5-FU(shArtemis组),通过Real-time PCR法检测P-gp基因表达水平变化;MTr法检测shArtemis组细胞对5-氟尿嘧啶、丝裂霉素及索拉菲尼的IC50值和RI值;利用Western-blot法检测p-Artemis和ATM蛋白水平表达变化;使用ATM抑制剂KU55933联合丝裂霉素作用细胞48 h,Western-blot法观察ATM、γ-H2AX和Artemis蛋白水平表达变化.结果 与对照组比较,shArtemis组的P-gp mRNA表达水平下降(P＜0.05),且对5-氟尿嘧啶、丝裂霉素和索拉菲尼的敏感性增加,IC50值和RI值均降低(P＜0.05).shArtemis组的p-Artemis与ATM蛋白表达水平降低(P＜0.05);KU55933联合丝裂霉素作用细胞后,有效减少ATM蛋白的表达(P＜0.05),同时γ-H2AX蛋白表达量增加(P＜0.05),但Artemis蛋白表达无明显变化(P＞0.05).结论 靶向干扰Artemis的表达能够增强细胞BEL-7402/5-FU对化疗药物的敏感性.此效应可能与Artemis作为BEL-7402/5-FU DNA损伤修复的分子开关,进而通过影响ATM参与DNA损伤修复有关.

目的 研究DNA依赖蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)基因沉默后对肝癌耐药细胞Bel7402/5-Fu细胞凋亡的影响.方法 实验分为空白对照组、脂质体对照组、NC对照组、siDNA-PKcs实验组.采用噻唑蓝(MTT)法检测耐药细胞Bel7402/5-Fu的耐药性;采用阳离子脂质体法将siDNA-PKcs寡核苷酸片段转染Bel7402/5-Fu细胞;Real-time PCR和Western blot分别检测细胞DNA-PKcs mRNA及蛋白的表达情况;倒置荧光显微镜下观察细胞形态变化(Hoechst33342染色法);流式细胞术检测细胞凋亡情况(AnnexinV/PI双染法);Western blot检测B细胞淋巴瘤-2相关x蛋白(Bax)、B细胞淋巴瘤/白血病-x基因长片段(Bcl-xl)蛋白的表达情况.结果 MTT检测Bel7402/5-Fu细胞的半抑制浓度(IC50)明显增高,耐药细胞Bel7402/5-Fu的耐药指旨数为13.13;DNA-PKcs的mRNA与蛋白表达水平明显减少,设计的siDNA-PKcs特异序列能有效沉默细胞DNA-PKcs的表达;Hoechst-33342染色检测结果显示siDNA-PKcs实验组细胞体积缩小、细胞核边集、呈亮蓝色;流式细胞术检测结果显示,siDNA-PKcs实验组细胞凋亡率比其余组增加(P＜0.01);Western blot检测结果显示siDNA-PKcs实验组Bax蛋白表达水平比其余组高,Bcl-xl蛋白表达水平比其余组低(P＜0.01).结论 siDNA-PKcs能诱导肝癌耐药细胞Bel7402/5-Fu细胞凋亡,并能上调促凋亡蛋白Bax的蛋白表达水平,抑制抗凋亡蛋白Bcl-xl的蛋白表达水平.