目的:探讨长链非编码RNA微小RNA(miR)-17-92a-1基因簇宿主基因(MIR17HG)对耐奥沙利铂(L-OHP)结直肠癌细胞株SW480/L-OHP的调控及机制。方法:实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)测定MIR17HG含量。SW480/L-OHP中构建MIR17HG敲减组(sh-MIR17HG)和对照组(sh-NC)。细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞活性，流式细胞术检测凋亡。荧光素酶报告实验和蛋白质印迹法检测TOP/FOP比值和β-连环蛋白(β-catenin)等分子表达。CHIR99021处理细胞后检测细胞凋亡率。应用SPSS 20.0软件进行统计分析。结果:SW480/L-OHP中MIR17HG含量高于SW480(9.84±0.69比2.22±0.47， t＝15.893， P<0.01)。L-OHP刺激后sh-MIR17HG组细胞活性低于sh-NC组(0.715±0.024比0.877±0.015， t＝-9.802， P<0.01)，凋亡率高于sh-NC组[(25.65±2.85)%比(7.38±0.89)%， t＝10.592， P<0.01]。SW480/L-OHP细胞的TOP/FOP比值高于SW480细胞(9.51±1.13比3.67±0.80， t＝7.320， P<0.01)。sh-MIR17HG组TOP/FOP比值低于sh-NC组(2.85±0.87比9.17±1.76， t＝-5.564， P<0.01)，β-catenin水平也低于sh-NC组(8.95±2.07比26.09±2.61， t＝-8.908， P<0.01)。CHIR99021刺激组凋亡率低于未刺激组[(13.91±1.69)%比(22.99±3.13)%， t＝-4.426， P<0.05]。 结论:SW480/L-OHP中高表达的MIR17HG可激活Wnt/β-catenin通路，进而促进结直肠癌细胞对L-OHP的耐药性。

目的:建立及鉴定诱导多能干细胞分化肾脏类器官的高通量培养平台。方法:选择人尿源诱导多能干细胞，以适合的细胞密度接种铺板，第1～6天在CHIR99021/成纤维细胞生长因子9/肝素等小分子化合物诱导下分化；在第7天将适合密度的细胞消化后重悬，加入到96孔V型细胞培养板进行3D悬浮培养24 h，待细胞形成球体之后，继续加入成纤维细胞生长因子9/肝素诱导分化。第24天诱导分化成熟，与已报道的分化方案（Transwell方案）所获得的肾脏类器官进行免疫荧光和透射电镜比较。结果:两种方案均可成功分化出肾脏类器官。免疫荧光结果显示肾脏主要细胞标志物LTL、GATA-3、Synaptopodin均有表达，形成成熟的肾脏类器官。透射电镜结果显示肾脏类器官形成许多相互交错穿插、分布均匀及排列整齐的足突，符合肾脏足细胞特有细胞结构的特征。在1.0×10 7相同中间中胚层细胞数下，Transwell方案获得约7个肾脏类器官，而高通量培养方案获得约1 000个肾脏类器官。 结论:肾脏类器官高通量培养平台成功建立，可获得大量的成熟且结构和功能完善的肾脏类器官，极大地提高了肾脏类器官的分化效率。

目的:探究敲减解整联蛋白及金属蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase,ADAM)结构域样癸蛋白1(ADAM domain-like decysin 1,ADAMDEC1)对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响.方法:利用GEPIA和UALCAN在线数据库对ADAMDEC1在胰腺癌组织中的表达情况进行分析.Western blot检测人胰腺癌细胞系(MIA PaCa-2和PANC-1)和胰腺导管细胞系(hTERT-HPNE)中ADAMDEC1的蛋白表达水平.采用CCK-8实验、集落形成实验、细胞划痕实验和Transwell实验检测敲减ADAMDEC1对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响;Western blot检测敲减ADAMDEC1对胰腺癌细胞中迁移、侵袭及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达水平的影响.此外,通过恢复性实验,检测Wnt/β-catenin信号通路激动剂CHIR-99021对敲减ADAMDEC1抑制胰腺癌细胞生长和转移作用的影响.结果:(1)ADAMDEC1在胰腺癌中高表达;(2)敲减ADAMDEC1表达后,胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力显著下降;(3)敲减ADAMDEC1后,E-cadherin蛋白表达增加,而基质金属蛋白酶9、N-cadherin和vimen-tin蛋白表达减少,Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达亦减少;(4)CHIR-99021与ADAMDEC1小干扰RNA共处理胰腺癌细胞,可逆转敲减ADAMDEC1对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的抑制作用.结论:ADAMDEC1在胰腺癌中高表达,可通过Wnt/β-catenin信号通路调控胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭.

HDAC(histone deacetylase)是一类可对蛋白质进行去乙酰化修饰的表观修饰酶,通过改变细胞核内组蛋白乙酰化状态,调控启动子活化水平,从而影响下游基因的表达水平,但其在内皮分化过程中的表达变化尚不清楚.本研究利用3阶段法诱导hiPSCs向内皮细胞定向分化,利用qRT-PCR检测Ⅰ类HDAC(HDAC1、2)、Ⅱ类HDAC(HDAC4、5)基因的表达变化.研究发现,HDAC5分子在内皮分化中有着显著的表达变化,在中胚层分化阶段下调90％(P＜0.01),在血管前体阶段上调至3.7倍(P＜0.01),继而在内皮晚期分化阶段下调70％(P＜0.01).免疫印迹结果进一步证实,HDAC5蛋白在内皮分化过程中存在阶段性表达变化.机制研究中显示,HDAC5中胚层分化阶段的变化受Wnt信号调控.通过CHIR99021处理以及Wnt3a质粒过表达,激动Wnt信号通路,会引起HDAC5下调.通过IWP-2抑制Wnt信号通路,会促进HDAC5表达恢复.此外研究发现,HDAC5主要定位于细胞核,IWP-2恢复HDAC5表达,但大部分滞留在胞浆.进一步研究显示,中胚层分化阶段HDAC5下调与中胚层分化标志物BraT的表达启动相关.通过HDAC抑制剂BML210处理发现,其可以促进早期中胚层分化,干扰血管前体细胞的内皮分化,增强内皮晚期阶段分化.总体而言,内皮诱导分化过程中,HDAC5有着显著的阶段性表达改变.Wnt信号激活是调控HDAC5在中胚层分化阶段下调的主要机制.

目的 优化多能干细胞(PSCs)定向分化为脑类器官的条件,提高人脑类器官的分化效率.方法 利用人胚胎干细胞(hESCs)系H9向人脑类器官诱导分化体系,在早期脑类器官分化到神经祖细胞的发育阶段添加小分子化合物组合,通过形态学观察不同分化阶段脑类器官中的神经祖细胞形成的效率、细胞凋亡的情况以及分化成神经元的效率,通过RT-qPCR检测标志性基因的表达量,综合评估添加的小分子化合物组合对脑类器官形成的影响.结果 在脑类器官神经祖细胞发育的关键阶段(1 d～14 d),培养基中依次添加多索啡(dorsomorphine)、A83-01、GSK-3β抑制剂CHIR99021和SMAD抑制剂SB-431542,可使神经祖细胞阶段的相关标志性基因的表达量显著提高,促进特异性神经管样结构形成,脑类器官中心区域的细胞凋亡减少.结论 通过使用上述 4 种小分子化合物组合,可明显提高早期脑类器官的形成效率,减少脑类器官中的细胞凋亡、促进神经元形成,减少培养过程中的组织结构异质性.

目的 探讨Chir99021 对大鼠牙髓干细胞(DPSCs)成骨诱导分化的影响及机制.方法 原代分离大鼠DPSCs,利用荧光免疫法进行验证.设置不同浓度的Chir99021,通过CCK-8 检测细胞增殖情况挑选最适浓度.利用茜素红染色验证细胞成骨诱导分化.最后通过Real-time PCR、Western blotting检测成骨诱导分化相关基因与蛋白无翅型MMTV整合位点家族成员 1(Wnt1)、无翅型 MMTV 整合位点家族成员 3A(Wnt3a)、β-连环蛋白(β-catenin)、轴抑制蛋白2 抗体(Axin2)、骨钙素(OCN)、牙本质基质蛋白1(DMP1)的mRNA和蛋白表达情况.结果 牙本质涎磷蛋白(DSPP)和干细胞标记物波形蛋白(vimentin)阳性表达,说明大鼠 DPSCs 分离成功.大鼠DPSCs成骨诱导后钙沉积物显著上升,加入糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)的小分子抑制剂Chir99021 后钙沉积物明显减少.大鼠 DPSCs 成骨诱导分化后 Wnt1、Wnt3a、β-catenin、Axin2、OCN 和 DMP1 表达明显上升,而加入Chir99021 后Wnt1、Wnt3a、β-catenin、Axin2、OCN和DMP1 蛋白表达均显著下降.结论 Chir99021 对诱导 7d后的大鼠DPSCs成骨诱导分化有一定的抑制作用.

目的 探讨丹酚酸B(Sal B)是否可通过调节糖原合成酶激酶-3β/β-连环蛋白(GSK-3β/β-Catenin)信号通路改善创伤后应激障碍(PTSD)模型大鼠认知功能.方法 60只大鼠随机分为正常组、PTSD组、Sal B低剂量组(10 mg/kg)、Sal B高剂量组(20 mg/kg)和GSK-3β抑制剂组(30 mg/kg CHIR-99021),每组12只.除正常组外,其余组大鼠采用单一延长应激法构建PTSD大鼠模型.旷场实验、Morris水迷宫实验评估大鼠认知功能;Nissl染色观察海马神经元病理学变化;TUNEL染色检测海马神经元凋亡;Western blot检测海马组织中裂解的胱天蛋白酶3(cleaved caspase-3)、B细胞淋巴瘤基因-2相关X蛋白(Bax)、原癌基因(c-Myc)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、总GSK-3β(t-GSK-3β)、磷酸化GSK-3β(p-GSK-3β)、总β-Catenin(t-β-Catenin)、磷酸化β-Catenin(p-β-Catenin)蛋白表达.结果 与PTSD组比较,Sal B低剂量组、Sal B高剂量组和GSK-3β抑制剂组大鼠爬行格数、站立次数、运动总距离、跨越原平台次数增多,逃避潜伏期、首次跨越原平台时间缩短,海马神经元凋亡率以及海马组织中Bax、cleaved caspase-3、t-GSK-3β、p-β-Catenin蛋白表达水平降低,Cyclin D1、c-Myc、p-GSK-3β、t-β-Catenin蛋白表达水平升高(P＜0.05).结论 Sal B能够减轻PTSD模型大鼠海马神经元凋亡、损伤并可改善其认知功能障碍,抑制GSK-3β/β-Catenin信号通路.

Midbrain dopaminergic neurons play an important role in the etiology of neurodevelopmental and neurodegenerative diseases. They also represent a potential source of transplanted cells for therapeutic applications. In vitro differentiation of functional midbrain dopaminergic neurons provides an accessible platform to study midbrain neuronal dysfunction and can be used to examine obstacles to dopaminergic neuronal development. Emerging evidence and impressive advances in human induced pluripotent stem cells, with tuned neural induction and differentiation protocols, makes the production of induced pluripotent stem cell-derived dopaminergic neurons feasible. Using SB431542 and dorsomorphin dual inhibitor in an induced pluripotent stem cell-derived neural induction protocol, we obtained multiple subtypes of neurons, including 20％ tyrosine hydroxylase-positive dopaminergic neurons. To obtain more dopaminergic neurons,we next added sonic hedgehog (SHH) and fibroblast growth factor 8 (FGF8) on day 8 of induction. This increased the proportion of dopaminergic neurons, up to 75％ tyrosine hydroxylase-positive neurons, with 15％ tyrosine hydroxylase and forkhead box protein A2 (FOXA2) co-expressing neurons. We further optimized the induction protocol by applying the small molecule inhibitor, CHIR99021 (CHIR).This helped facilitate the generation of midbrain dopaminergic neurons, and we obtained 31-74％ midbrain dopaminergic neurons based on tyrosine hydroxylase and FOXA2 staining. Thus, we have established three induction protocols for dopaminergic neurons. Based on tyrosine hydroxylase and FOXA2 immunostaining analysis, the CHIR, SHH, and FGF8 combined protocol produces a much higher proportion of midbrain dopaminergic neurons, which could be an ideal resource for tackling midbrain-related diseases.

目的 探讨在体内外模型中常用有效剂量川陈皮素(nobiletin,NOB)对肠道干细胞的调节作用.方法 构建小鼠结肠癌细胞系MC38的3D培养模型,加入不同浓度NOB,观察克隆死亡和存活.构建小鼠小肠类器官模型,在类器官培养体系中添加不同浓度的NOB,观察类器官的出芽和生长,利用MTT染色后的类器官成像进行面积和吸光值计算.在50、100 μmol/L浓度NOB干预体系中不同时间撤掉NOB,观察类器官生长.在50 μmol/L浓度NOB处理类器官的体系中分别加入R-spondin1、CHIR99021加强Wnt通路激活信号,观察类器官的生长.对C57/B6J小鼠灌胃不同浓度NOB,连续给药4 d,观察肠道隐窝和绒毛长度比,观察隐窝细胞凋亡,以及隐窝底部干细胞龛中Olfm4/BrdU染色阳性的细胞数量.结果 与对照组相比,50 μmol/L NOB即可显著促进肿瘤细胞MC38成球后死亡,显著降低克隆形成率(P＜0.001).与对照组相比,NOB从50 μmol/L起可以显著抑制肠类器官的出芽,50～200 μmol/L NOB可以显著抑制类器官的生长(P＜0.001),并且具有剂量依赖效应;NOB撤药后在50 μmol/L时肠类器官生长容易恢复,在100 μmol/L时难以恢复到正常水平.增强Wnt通路的激活可以部分挽救NOB对肠类器官的抑制作用.在体给予高于常用浓度的NOB不能诱导肠隐窝细胞凋亡,不影响肠干细胞的数目和增殖,不影响隐窝和绒毛比.结论 NOB具有抑制正常肠干细胞的能力,可能通过调控干细胞相关通路如Wnt发挥作用,但其在在体不能发挥抑制干细胞增殖的效应;这提示NOB在常规浓度应用的安全性,同时提醒对NOB在在体肿瘤模型中发挥的抑制作用需要进行更深入的评估.

目的 利用诱导多能干细胞(iPSCs)向肾系细胞定向诱导分化,并获得类肾体.方法 利用肝糖原合成激酶3β受体的选择性抑制剂(CHIR99021)及成纤维细胞生长因子9对iPSCs进行定向诱导分化,控制后肾间充质与输尿管上皮的形成比例,从而构建类肾体.对类肾体细胞进行免疫荧光染色,利用共聚焦激光扫描显微镜观察并拍摄照片.利用扫描电镜观察类肾体的内部结构,并拍摄照片.结果 利用iPSCs分化成功构建出类肾体.通过结构鉴定,证实类肾体中包括肾单位的各个部分.结论 利用iPSCs进行定向诱导分化可以获得包含远端小管、近端小管、肾小球及血管的类肾体.