CRISPR/Cas是原核生物在进化过程中获得的一种免疫防御系统,用于抵抗外来遗传物质的入侵,近年来被开发成为高效的基因编辑、基因调控以及分子诊断工具.其可编程靶向机制揭开了利用该系统进行基因组操作的序幕,并允许在活性范围内实现动态调节和控制基因表达.作为现有基因修饰手段中灵活性最强和成本最低的技术之一,已被广泛应用于临床疾病治疗、工农业生产、可持续染料开发和化学品加工等领域.随着对CRISPR/Cas系统的不断深入挖掘和探索,大量研究报道了 gRNA工程改造及优化方法,包括改变间隔序列长度、调节恒定区和可变区的结构、向末端或中间延伸添加额外功能序列及化学合成修饰等,以期降低脱靶突变率,提高作用效率,充分激发CRISPR基因操纵工具在生物医学方面的潜力.基于此,本综述将介绍CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12系统中gRNA工程化设计方法及应用研究的最新进展,分析探讨了当前工程化gRNA技术面临的机遇和挑战,旨在为获得性能更加优异的gRNA提供思路和方向,从而提高利用CRISPR/Cas系统探测人类细胞基因组的能力,进一步为可编程生物学带来更多可能性.

目的 构建智能交互出院随访平台,并探讨其在出院患者随访管理中的应用效果.方法 成立多部门协作研究团队,构建包括随访定制模块、随访执行模块、信息备份与统计分析模块3个部分的智能交互出院随访平台.选取2022年1月-12月北京市某三级甲等医院A、B院区出院随访患者,A院区患者应用智能交互出院随访平台进行随访,B院区患者采用人工电话随访,比较两院区随访效率;在两院区随机各选取100例出院患者,比较两组随访时长和人力投入情况.结果 A院区的随访率、有效随访率分别为99.96％及95.10％,B院区分别为99.84％、99.66％,两组比较,差异具有统计学意义(x2=19.028、2081.008,P＜0.001);A院区的意见收集率为0.47％,高于B院区的0.01％(x2=249.365,P＜0.001);A院区随访耗费小时数与岗位人力数更少.结论 智能交互出院随访平台可实现人机多方智能交互,能够节约护理人力及减少随访所用时间,提高出院患者随访率.

目的:通过对比"一站式"同期颈动脉支架置入术(carotid artery stenting，CAS) +非体外循环下冠状动脉旁路移植术(off-pump coronary artery bypass grafting，OPCABG)和分期序贯CAS+OPCABG两种术式围手术期情况及早期随访资料，评估"一站式"同期手术的安全性和有效性。方法:北京安贞医院自2020年1月至2021年7月因冠心病合并颈动脉狭窄行CAS+OPCABG杂交手术的患者共26例，其中12例采用了"一站式"同期CAS+OPCABG、14例采用了分期序贯CAS+OPCABG，对其围手术期及术后3个月随访资料进行对比分析。连续变量采用 t检验，计数资料采用 χ2检验。 结果:两组的累计手术时间、术后第1天胸腔引流量、呼吸机辅助、ICU滞留差异均无统计学意义( P>0.05)。同期组术中出血量多于分期组，但两组均无二次开胸止血发生。术后住院天数同期组显著少于分期组。分期组围手术期发生脑梗塞、心肌梗死各1例，同期组无围手术期心肌梗死及脑梗塞发生，但两组间差异无统计学意义( P>0.05)。术后3个月随访两组均无新发脑梗塞，颈动脉超声支架均通畅，心功能分级和左心室射血分数差异无统计学意义( P>0.05)。 结论:"一站式"同期CAS+OPCABG手术是安全可行的，尤其对于心肌缺血症状重或重度左主干病变的患者推荐首选同期手术。优化抗凝方案和减轻颈动脉窦反射是需要继续研究的主要问题。

目的:评价曲安奈德结膜上方穹隆部深层注射治疗甲状腺相关眼病上睑退缩的效果。方法:病例对照研究。选取2015年10月至2018年12月首都医科大学附属北京友谊医院眼科就诊的53例（64只眼）甲状腺相关眼病所致上睑退缩患者的病历及随访资料，其中33例（39只眼）患者采用结膜上方穹隆部深层曲安奈德注射治疗（治疗组）；20例（25只眼）仅观察随访（观察组）。治疗组曲安奈德每次20 mg结膜上方穹隆部深层注射，每月1次，治疗效果稳定后停药并随访。对两组患者治疗或随访前、后上睑缘距瞳孔距离（MRD 1）、甲状腺眼病生活质量（TED-QOL）评分、临床活动度评分（CAS）、眼球突出度等指标进行比较。采用配对 t检验及独立样本 t检验等进行统计学分析。 结果:治疗组男性6例，女性27例，年龄（43±12）岁；观察组男性5例，女性15例，年龄（40±13）岁，两组性别、年龄、眼睑退缩病程及首次就诊时MRD 1，TED-QOL评分，CAS，眼球突出度，眼压，B超测量的上、下、内、外直肌直径比较差异均无统计学意义（均 P>0.05）。治疗组曲安奈德注射次数为（2.18±0.94）次（范围1~5次）；治疗后随访（6.74±3.89）个月，MRD 1由（6.85±0.88）mm降低至（4.38±1.04）mm、TED-QOL评分由（22.03±4.33）分降低至（7.91±3.25）分，CAS由（2.82±0.39）分降低至（0.97±0.39）分，差异均有统计学意义（ t=14.68，21.36，20.92；均 P<0.01）；眼球突出度、眼压、B超测量的各直肌直径治疗前、后差异均无统计学意义（均 P>0.05）。观察组随访（8.65±5.15）个月后眼睑退缩亦有好转，但治疗组改善更明显，治疗组治疗前后的MRD 1、TED-QOL评分、CAS差值分别为（2.46±1.05）mm、（14.06±3.80）分、（1.85±0.51）分，均高于观察组随访前后的差值[（0.32±0.75）mm、（3.24±2.86）分、（0.56±0.58）分]，差异均有统计学意义（ t=8.86，11.90，8.98；均 P<0.01）。两组患者在随访期间上睑退缩均无复发。治疗组中出现短暂性眼压升高5例（6只眼），经降眼压治疗后恢复正常；3例女性患者有月经改变。 结论:结膜上方穹隆部深层注射曲安奈德治疗甲状腺相关眼病所致上睑退缩是一种简单、有效的治疗方法，能够显著减轻上睑退缩症状，改善患者生活质量。 （中华眼科杂志，2020，56：524-529）

目的:探讨促甲状腺激素受体抗体水平(TRAb)与甲状腺相关性眼病活动度及严重程度的相关性。方法:回顾性分析1993年8月至2020年12月于解放军总医院诊断为甲状腺相关性眼病且未接受眼病相关治疗患者的临床资料，分析血清TRAb水平与甲状腺相关性眼病活动度及严重程度的相关性。结果:(1)年满18周岁且眼病病程≤18个月并有血清TRAb检测结果者共180例，眼病起病年龄为(46.06±12.47)岁，其中男性84例，女性96例，眼病持续时间5.0(3.0，9.0)个月，CAS评分≥3分93例，NOSPECS分级≥4级165例，按欧洲Graves眼病专家组指南严重程度分级轻度、中重度和危及视力分别有72例、98例和10例。(2)中重度及危及视力患者血清TRAb水平明显高于轻度患者[12.8(4.0, 30.1) U/L比6.2 (3.2, 14.8) U/L， P＝0.004]，活动性患者血清TRAb水平高于非活动性患者[12.6(3.4，31.0) U/L比6.5(3.4, 17.6) U/L， P＝0.006]，美国甲状腺协会严重程度分级≥4级与<4级患者血清TRAb水平无明显差异。(3)不同活动度及严重程度患者的血清TRAb阳性率之间差异无统计学意义。(4)单因素回归分析结果显示，血清TRAb水平与中重度及危及视力患病风险的升高相关( OR＝2.02， P＝0.001)，且和活动性相关( OR＝1.5， P＝0.016)，多因素回归分析显示这种相关性仍存在。 结论:血清TRAb水平与甲状腺相关性眼病活动度和严重程度相关，随着抗体水平的增加，患者进展为活动性和中重度及危及视力的风险可能增加。

目的:探讨克尔斯滕大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物(KRAS)突变亚型对非小细胞肺癌细胞程序性细胞死亡配体1(PD-L1)和2(PD-L2)的表达影响。方法:纳入2018年1月至2021年1月甘肃省肿瘤医院收治的KRAS阳性非小细胞肺癌患者95例，通过测序检测KRAS基因组序列，通过实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)和免疫印迹检测PD-L1和PD-L2的表达。使用成簇的规则间隔的短回文重复基因编辑(CRISPR/CAS9)技术构建KRAS缺失型A549细胞，在敲除株中过表达KRAS野生型和突变型，检测其对PD-L1和PD-L2的表达影响。将KRAS野生型和突变型过表达的KRAS敲除人肺泡上皮细胞549(A549)细胞株与树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞(DC-CIK)，通过流式细胞术检测群集行列式蛋白3阳性(CD3 +)细胞的凋亡水平。使用 t检验比较连续变量。使用Mann-Whitney检验分析KRAS突变型患者PD-L1和PD-L2。Chi-square检验分析非小细胞肺癌患者KRAS突变型和KRAS野生型的临床特征。 结果:纳入KRAS阳性非小细胞肺癌患者95例，KRAS野生型31例、KRAS突变型64例；其中KRAS第12位甘氨酸突变为天冬氨酸(G12D)13例、突变为缬氨酸(G12V)12例、突变为半胱氨酸(G12C)25例、突变为丙氨酸(G12A)14例。KRAS突变型患者PD-L1和PD-L2的mRNA表达水平(1.062比1.834， U＝38；1.062比1.668， U＝70；1.062比1.544， U＝111；1.062比1.479， U＝89， P<0.05；1.067比1.798， U＝68；1.067比1.595， U＝86；1.067比1.527， U＝171；1.067比1.680， U＝34， P<0.05)和蛋白表达水平均高于KRAS野生型患者，差异有统计学意义。在KRAS敲除A549细胞株中，相较于KRAS野生型，KRAS突变型更能够促进PD-1配体PD-L1和PD-L2的表达同时，将KRAS-G12D，KRAS-G12V，KRAS-G12C，KRAS-G12A质粒混合在一起作为RAS野生型(KRAS-MT)与KRAS突变型(KRAS-WT)分别转染KRAS敲除A549细胞株，KRAS-MT依旧可以促进PD-1配体PD-L1和PD-L2的表达。在KRAS敲除A549细胞株中过表达KRAS-MT与KRAS-WT后，KRAS突变亚型不能激活细胞外信号调节激酶(ERK)通路，但是可以激活丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(AKT)通路。AKT抑制剂处理后，KRAS-MT与KRAS-WT转染KRAS敲除A549细胞株的PD-L1和PD-L2的表达差异无统计学意义。将转染了KRAS-MT或KRAS-WT的KRAS KO A549细胞株与DC-CIK以1∶1的比例共培养，随后检测DC-CIK细胞的凋亡水平，发现KRAS-MT能够显著增加DC-CIK细胞中CD3 +细胞亚群的凋亡( F＝12.5， P<0.05)，差异有统计学意义。 结论:KRAS突变亚型能够显著增强非小细胞肺癌细胞PD-1配体PD-L1和PD-L2的表达，并且能够促进免疫细胞DC-CIK细胞中CD3 +细胞亚群的凋亡。

目的:分析中重度颈动脉狭窄患者的颈动脉粥样硬化斑块MRI血管壁成像特征与颈动脉支架植入术（CAS）围手术期血流动力学不稳定的关系。方法:前瞻性纳入自2017年1月1日至2021年12月31日于清华大学附属北京清华长庚医院接受CAS治疗的颈动脉狭窄患者共89例，其中男74例，女15例，年龄43~87（67.8±8.2）岁。术前检查均完善颈动脉MRI血管壁成像，分析颈动脉斑块中是否存在大脂质核、斑块内出血和纤维帽破裂，将不存在上述危险因素的斑块定义为稳定斑块组（34例），反之为易损斑块组（55例），并计算每个斑块具有的危险因素数量。术中记录患者血压、心率的变化及术后多巴胺的使用情况。将斑块具有的危险因素作为自变量，临床结局作为因变量，计算 RR值，并比较不同危险因素数量的患者上述临床结局的差异。 结果:易损斑块组术中血压下降、术中心率下降的发生率高于稳定斑块组［60.0%（33/55）比14.7%（5/34），38.2%（21/55）比14.7%（5/34）；均 P<0.05］。MRI血管壁成像特征中，大脂质核45例，对血压下降和心率下降的 RR值分别为3.15（1.69~5.87）、2.20（1.07~4.53）；斑块内出血37例，对血压下降和心率下降的 RR值分别为2.70（1.61~4.55）、2.25（1.15~4.39）；纤维帽破裂29例，对血压下降和心率下降的 RR值分别为1.50（0.94~2.40）、1.29（0.67~2.49）。易损斑块的危险因素越多，术中血压下降和心率下降的发生率越高：危险因素为0~3个时，血压下降发生率分别为14.7%（5/34）、9/18、11/18、13/19（ P<0.001），心率下降的发生率分别为14.7%（5/34）、6/18、7/18、8/19（ P=0.022）。两组间术后使用多巴胺的患者比例差异无统计学意义（ P>0.05）。 结论:颈动脉斑块MRI血管壁成像提示颈动脉易损斑块危险因素越多的患者在进行CAS时出现血压和心率下降的风险越高。

目的:观察颈动脉内膜剥脱术(CEA)对缺血性脑卒中患者的治疗效果，及对患者神经功能和凝血功能的影响。方法:回顾性选取2017年2月至2017年12月在本院接受治疗的90例缺血性脑卒中患者为研究对象，根据其治疗方式分为颈动脉支架成型术(CAS)组45例和CEA组45例。观察两组患者的治疗效果，比较两组患者治疗前后凝血功能、生活质量的差异。结果:CEA组患者治疗有效率为97.78%，明显高于CAS组(84.44%，χ 2＝4.939， P＝0.026)。两组患者治疗前凝血功能比较差异无统计学意义( P>0.05)；治疗后，CEA组患者的活化部分凝血酶原时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、D二聚体(D-D)水平低于CAS组( t＝22.801、3.752、6.039、169.556， P<0.05)。两组患者治疗前生活质量评分比较差异无统计学意义( P>0.05)；治疗后，CEA组患者的生活质量评分高于CAS组( P<0.05)。CEA组患者高灌注综合征、再狭窄、血肿发生率较CAS组低(6.67% vs 22.22%，χ 2＝4.406， P＝0.036)。 结论:颈动脉内膜剥脱术(CEA)对缺血性脑卒中患者有较好的治疗效果，可明显改善患者的神经功能和凝血功能，具有良好的应用价值。

一些肾结石病是由单基因病所致，其中与嘌呤代谢相关的单基因病主要包括腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(APRT)缺乏症、次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖基转移酶(HPRT)缺乏症、遗传性黄嘌呤尿症(HX)以及由PRS1、SLC22A12、SLC2A9和ABCG2等基因突变所致病症。这类疾病可导致嘌呤和尿酸代谢异常，进而形成2，8-二羟基腺嘌呤结石、尿酸结石或黄嘌呤结石等。此类疾病临床罕见，不同类型的与嘌呤代谢相关的单基因肾结石病的基因型和表型有其各自特点，且不被广泛认知。目前药物治疗是此类疾病的主要治疗方法。随着基因诊断和治疗技术的进步，不断有新的致病基因和位点被发现，同时随着CRISPR/Cas9等基因编辑技术的逐步应用，与嘌呤代谢相关的单基因肾结石病在未来有望从根本上得到治愈。

目的:评价血红素氧合酶-1(HO-1)在小鼠内毒素急性肺损伤中的作用及其与调控线粒体质量控制的关系。方法:清洁级健康雄性成年C57BL/6小鼠，基于CRISPER/Cas9开发的EGE系统制备HO-1诱导性基因敲除小鼠，并构建HO-1过表达腺病毒载体诱导HO-1基因过表达小鼠，6~8周龄，体重20~25 g，采用随机数字表法，将野生型C57BL/6(WT)、HO-1基因敲除型小鼠(HO-1 -/-)和HO-1基因过表达型小鼠(HO-1 +/+)分别分为2组( n＝6)：对照组(WT组、HO-1 -/-组和HO-1 +/+组)和内毒素急性肺损伤组(ALI组、HO-1 -/-+ALI组和HO-1 +/++ALI组)。经尾静脉注射LPS 15 mg/kg制备小鼠内毒素急性肺损伤模型，各对照组给予等容量生理盐水。给予LPS或生理盐水后12 h时处死小鼠取肺组织，光镜下观察肺组织病理学结果并进行肺损伤评分，测定肺组织还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量，计算GSH/GSSG比值，透射电镜下观察线粒体超微结构，测定线粒体膜电位(MMP)水平，采用Western blot法测定HO-1、线粒体质量控制相关蛋白线粒体融合蛋白2(Mfn2)、动力相关蛋白1(Drp1)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α(PGC-1α)、核呼吸因子1(NRF1)、线粒体自噬标志蛋白PTEN诱导激酶1(PINK1)和E3泛素-蛋白连接酶(Parkin)的表达，观察小鼠12 h生存情况。 结果:与对照组(WT组、HO-1 -/-组和HO-1 +/+组)比较，内毒素急性肺损伤组(ALI组、HO-1 -/-+ALI组和HO-1 +/++ALI组)小鼠12 h生存率和MMP降低，肺损伤评分增加，GSH含量和GSH/GSSG比值降低，GSSG含量升高( P<0.05)；与ALI组比较，HO-1 -/-+ALI组小鼠12 h生存率和MMP降低，肺损伤评分增加，GSH含量和GSH/GSSG比值降低，GSSG含量升高，HO-1、Mfn2、PGC-1α、NRF1、PINK1和Parkin表达下调，Drp1表达上调，HO-1 +/++ALI组小鼠12 h生存率和MMP升高，肺损伤评分降低，GSH含量和GSH/GSSG比值升高，GSSG含量降低，HO-1、Mfn2、PGC-1α、NRF1、PINK1和Parkin表达上调，Drp1表达下调( P<0.05)。与WT组比较，HO-1 -/-组肺组织HO-1表达下调，HO-1 +/+组肺组织HO-1表达上调，ALI组肺组织HO-1、Drp1、PINK1和Parkin表达上调，Mfn2、PGC-1α和NRF1表达下调( P<0.05)。 结论:HO-1参与了小鼠内毒素急性肺损伤的过程，与调控线粒体质量控制有关。