目的 探讨恒古骨伤愈合剂(OK)治疗骨关节炎(OA)的潜在机制并利用DMM大鼠初步验证.方法 使用TCMSP数据库收集OK潜在的靶点,运用 GeneCards数据库和OMIM筛选与OA相关的靶基因,利用Cytoscape3.8.2 软件建立OK有效成分与OA靶基因间互作的调控网络.使用STRING数据库构建蛋白互作图,进行基因本体(GO)及京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析.此外,采用内侧半月板不稳定术(DMM)构建OA大鼠,观察膝关节软骨病变,ELISA检测OK治疗后炎症以及氧化应激水平.结果 网络药理学发现,血清白蛋白(ALB),白介素 6(IL-6)等 80 个OK治疗OA的核心基因,主要涉及免疫、炎症反应、氧化应激等生物学过程.动物实验发现,与模型组相比,OK组大鼠关节软骨表面结构趋于正常,软骨细胞脱落少;OK降低血清炎症因子IL-6(P<0.01)、VEGF(P<0.01)和氧化应激因子MDA(P<0.05),改善ALB水平和SOD活性(P<0.01).结论 OK可缓解OA软骨组织损伤,改善免疫,抑制炎症和氧化应激反应,初步验证了网络药理学的结果.

目的 研究有氧运动对2型糖尿病(T2DM)大鼠AGE-RAGE轴及NF-κB通路的影响,探讨T2DM运动康复作用.方法 8周龄雄性Wister大鼠高糖高脂饮食后,应用链脲佐菌素诱导建立T2DM大鼠.将30只造模成功的T2DM大鼠随机分成3组(n=10):T2DM组、T2DM加低强度运动组(T2DML)和T2DM加中强度运动组(T2DMM).运动组实施运动方案.采用ELISA法分别测定实验大鼠血浆、骨骼肌和心肌的晚期糖基化终产物(AGEs)及其受体(RAGE)和核因子κB(NF-κB)水平.结果 与T2DM组相比,T2DML组血、骨骼肌和心肌的NF-κB水平显著下降(<0.05);T2DMM组血、骨骼肌和心肌的AGEs、RAGE和NF-κB水平均显著下降(<0.05);与T2DML组相比,T2DMM组血、骨骼肌和心肌的NF-κB水平均显著下降(<0.05).结论 中强度有氧运动能抑制AGE-RAGE轴和NF-κB通路,降低T2DM氧化应激和炎症反应,减轻组织损伤,对T2DM及其并发症具有防治作用.

目的:探讨I型组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂阻断软骨退化的作用及其可能机制.方法:通过内侧半月板不稳术(DMM)构建SD大鼠关节炎(OA)模型,选取广谱性HDAC抑制剂曲古抑菌素A(TSA)进行体内干预,采用关节软骨番红O染色及关节OA评分法观察TSA对软骨退化的影响.体外培养软骨肉瘤细胞SW-1353,选取不同浓度的TSA及选择性HDAC抑制剂丙戊酸(VPA)和MS-275进行干预,采用Western blot检测核心组蛋白(H3、H4)和α-微管蛋白去乙酰化水平,验证各HDAC抑制剂的活性.体外培养人源性关节软骨细胞(HACs)及SW-1353细胞,选取以上HDAC抑制剂并结合基质金属蛋白酶(MMP)诱导剂白细胞介素-1α(IL-1α)干预HACs;采用siRNA特异性干扰I型HDAC各亚型的表达,结合IL-1α干预SW-1353;采用RT-PCR检测2种细胞中MMP1及MMP13的表达,分析各亚型HDAC抑制对MMP表达的影响.利用外植体软骨退化(PNC外植体)试验,选取以上HDAC抑制剂及制瘤素M进行干预,检测糖胺聚糖和胶原蛋白,体外观察各HDAC抑制剂对软骨退化的影响.结果:TSA明显减轻OA模型SD大鼠胫骨内侧平台及股骨内侧髁的软骨退化程度(P=0.015).TSA、VPA及MS-275可显著提高核心组蛋白(H3、H4)和α-微管蛋白乙酰化水平(P<0.05),并呈浓度依赖性,即TSA、VPA及MS-275干预浓度越高,组蛋白乙酰化水平越高,HDAC抑制剂的活性越高.TSA、VPA及MS-275可显著抑制HACs细胞中IL-1α诱导的MMP1及MMP13的表达(P<0.001),并亦呈浓度依赖性.I型HDAC(HDAC-1、HDAC-2、HDAC-3及HDAC-8)亚型被特异性干扰后,SW-1353细胞中IL-1α诱导的MMP13的表达明显减少(P<0.001).体外实验证实TSA、VPA及MS-275可显著抑制软骨中制瘤素M诱导的糖胺聚糖和胶原蛋白水平(P<0.05),并呈浓度依赖性.结论:I型HDACs被抑制剂抑制或特异性消耗均能抑制软骨细胞MMP1及MMP13的表达,抑制PNC外植体糖胺聚糖和胶原蛋白水平,其可能是通过抑制MMP、糖胺聚糖和胶原蛋白的表达而发挥对软骨退化的保护作用.

目的 比较人皮下和髌下脂肪垫干细胞体外增殖、成软骨分化潜能以及体内治疗大鼠骨关节炎的疗效差异.方法 获取上海市东方医院未患代谢性相关疾病患者的皮下和髌下脂肪垫组织,从髌下脂肪垫中分离原代脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ASCs),体外诱导成脂、成骨、成软骨方向分化.EdU检测人皮下脂肪干细胞(subcutaneous ASCs,Sc-ASCs)和髌下脂肪垫干细胞(infrapatellar fat pad derived stem cells,IPFP-ASCs)体外增殖能力,流式细胞术检测干细胞表面标记蛋白CD34、血管相关标记蛋白CD31的表达.阿尔新蓝染色及Western blot检测Sc-ASCs和IPFP-ASCs体外成软骨潜能.体内实验采用8周SD大鼠随机分为对照(control,CON)组、内侧半月板不稳术(destabilisation of the medial meniscus,DMM)组和DMM手术后Sc-ASCs治疗组,DMM手术后IPFP-ASCs治疗组,通过大体观察、番红固绿染色及OARSI评分比较体内治疗效果.结果 人髌下脂肪垫组织中分离获得ASCs,形态呈长梭形,在体外具有成脂、成骨、成软骨分化潜能.Sc-ASCs和IPFP-ASCs表面标记蛋白CD34和血管相关标记蛋白CD31表达无显著性差异,但人IPFP-ASCs体外增殖能力较强.阿尔新蓝染色及Western blot显示IPFP-ASCs体外成软骨能力较强.体内大鼠实验大体形态学观察显示DMM组骨赘增多,软骨表面缺损,Sc-ASCs治疗组骨赘减少,IPFP-ASCs治疗组表面较光滑,无明显骨赘生成;番红固绿染色显示DMM组软骨层出现垂直裂缝且到达钙化软骨,Sc-ASCs治疗组关节面纤维化且软骨浅表层存在垂直裂隙,IPFP-ASCs治疗组软骨层较为连续,仅存在轻微纤维化;OARSI评分显示IPFP-ASCs治疗骨关节炎疗效更好.结论 人IPFP-ASCs体外增殖能力、成软骨分化潜能以及体内治疗大鼠骨关节炎的效果优于Sc-ASCs.

目的 基于免疫印迹实验深入探究芍药甘草汤对骨关节炎(osteoarthritis,OA)的药效机制.方法 将40只大鼠随机分为4组,分别为假手术组(sham组)、模型组、芍药甘草汤(SGD)中剂量组(4.32 g/kg)、SGD高剂量组(8.64 g/kg).除sham组以外的所有组大鼠使用内侧半月板失稳术(destabilization of the medial meniscus,DMM)构建骨关节炎模型,所有大鼠在手术造模后第1天开始灌胃给药,每日1次,持续8周,SGD组给予一定剂量的SGD,sham组和模型组给予等量的蒸馏水.给药8周后,对所有大鼠进行麻醉处死并取材.苏木素-伊红(HE)染色观察软骨组织形态学改变,免疫印迹法(Western blot)检测软骨组织中p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)及C-myc蛋白的表达水平.结果 与sham组比较,模型组、SGD中剂量组及高剂量组大鼠关节软骨的C-myc和p38分子蛋白表达水平明显升高(P＜0.01),用芍药甘草汤干预后,其蛋白表达出现下降趋势,且下降幅度与芍药甘草汤浓度呈正相关,当芍药甘草汤浓度达到8.64 g/kg时,与模型组相比差异具有统计学意义(P＜0.001).结论 芍药甘草汤能抑制OA大鼠软骨中p38和C-myc蛋白的过表达.

目的 探讨肺上皮细胞线粒体功能障碍在机械通气肺损伤中的作用机制.方法 以RLE-6TN细胞和呼吸机所致肺损伤(VILI)模型大鼠为实验对象.体外培养RLE-6TN细胞至传代稳定,建立大鼠VILI模型,机械通气4 h后取出肺组织,采用ELISA法检测上清液中炎症因子浓度,采用透射电镜观察线粒体形态,采用Western blot法检测肺组织线粒体动力相关蛋白1(Drp1)、细胞质中Drp1和线粒体融合蛋白(Mfn2)的蛋白含量,采用琥珀酸脱氢酶(SDH)试剂盒检测SDH活力,采用荧光显微镜观察活性氧(ROS)水平和线粒体膜电位(MMP)水平.建立大鼠VILI模型,机械通气4 h后,取出肺组织,采用HE染色法观察肺组织病理学变化,测定肺组织湿干质量比值(W/D),其余方法和体外实验相同.结果 体外实验中,与对照组比较,机械牵张引起RLE-6TN细胞炎症因子表达、线粒体ROS水平升高,MMP下降,线粒体形态异常、线粒体嵴模糊,Drp1表达增加和Mfn2表达减少.体内实验中,与对照组比较,机械通气引起大鼠肺组织病理结构改变显著,肺损伤评分、W/D比值、炎症因子表达、线粒体ROS水平均显著增加,MMP下降,线粒体形态异常,Drp1表达增加和Mfn2表达减少.在体内实验和体外实验中采用SDH抑制剂丙二酸二甲酯(DMM)和ROS清除剂N-乙酰-半胱氨酸(NAC)后以上变化均有显著的逆转.结论 炎症反应、氧化应激和线粒体功能障碍参与了VILI的过程,VILI导致氧化应激以及诱导Drp1和Mfn2表达异常引起线粒体功能障碍,线粒体功能障碍的改善或许是VILI治疗的重点.

目的 研究适度的机械应力和跑步运动通过调控RhoA/ROCK/NF-κB通路治疗骨关节炎的机制与效果.方法 在细胞实验方面,通过将不同强度机械应力施加于软骨细胞以研究机械应力对软骨细胞功能和代谢状态的影响.然后用过表达腺病毒或siRNA干预软骨细胞调控ROCK1的表达,从而研究ROCK1基因对软骨细胞代谢和功能的影响.在动物实验中,首先通过将SD大鼠内侧半月板胫骨韧带切断建立内侧半月板不稳定(DMM)模型.通过给予DMM大鼠适度的跑步锻炼方案(15米/分,30分钟/天,5天/周,4周)研究跑步锻炼对骨关节炎进展的影响.结果 研究发现过度的机械应力会导致RhoA/ROCK通路的激活.ROCK1在软骨细胞中的过度表达会影响合成代谢和分解代谢平衡以及激活NF-κB通路,从而加重软骨细胞炎症反应.通过siRNA敲减干预和给予适度应力能下调ROCK1表达从而保护软骨细胞和减轻炎症.适度的跑步运动能降低关节软骨中ROCK1的表达从而减轻软骨损伤和软骨下骨重塑.结论 适度的机械应力和跑步运动能通过抑制RhoA/ROCK/NF-κB通路改善骨关节炎进展.

目的 探究电针对骨关节炎大鼠的影响及其作用机制.方法 将30只大鼠随机分为模型组、电针组及对照组,10只/组.模型组与电针组大鼠采用改良DMM手术造模法制造骨关节炎模型,电针组造模成功后给予双侧"后三里"和"膝前穴"电针灸治疗,模型组不予干预,对照组为假手术组.根据LequesneMG评分标准,对3组大鼠进行大鼠行为学检测.观察各组大鼠软骨下骨的退变情况.通过ELISA法检测各组大鼠血清中白细胞介素-1β(IL-1β)、聚蛋白多糖酶-7(ADAMTS-7)、基质金属蛋白酶-3(MMP-3)、软骨寡聚基质蛋白的含量;通过Western blot检测各组大鼠膝关节软骨组织IL-1β、Wnt-7B、β-catenin、ADAMTS-7、MMP-3的表达变化;通过RT-PCR检测软骨组织中IL-1β、Wnt-7B、β-catenin、ADAMTS-7,MMP-3的mRNA.结果 行为学检测发现,模型制备后与对照组相比,模型组、电针组LequesneMG评分升高(P<0.05).治疗20 d后,与模型组比较,电针组LequesneMG评分降低(P<0.05).Micro-CT结果显示,与对照组相比,电针组与模型组大鼠软骨下骨均受到损伤,但电针组大鼠的关节软骨下骨损伤程度低于模型组.与模型组比较,电针组大鼠血清中IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3、软骨寡聚基质蛋白的含量降低(P<0.05),软骨组织中IL-1β、Wnt-7B、β-catenin、ADAMTS-7、MMP-3含量降低(P<0.05).RT-qPCR结果显示与模型组比较,电针组大鼠软骨组织中IL-1β、Wnt-7B、β-catenin、ADAMTS-7、MMP-3 mRNA含量降低(P<0.05).结论 电针能够有效改善关节疼痛等症状,改善关节软骨下骨的损伤,并且可以降低关节软骨组织、血清中IL-1β缓解关节内炎症,同时通过调控Wnt-7B/β-catenin信号通路降低ADAMTS-7、MMP-3等细胞因子,起到保护软骨的作用.

目的 探讨灯盏花素(breviscapine,BE)对膝骨关节炎(osteoarthritis,OA)模型大鼠关节软骨的影响.方法 通过内侧半月板失稳(destabilization of the medial meniscus,DMM)诱导OA大鼠模型,BE和塞来昔布(celecoxib,Cel)分别通过灌胃向大鼠给药.通过苏木精-伊红(hematoxylin & eosin,HE)染色观察大鼠骨关节炎软骨损伤和细胞浸润情况,番红0-固绿染色观察软骨损伤情况,甲苯胺蓝染色观察软骨损伤,免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)染色观察软骨组织中collagen-II和p-JNK阳性细胞比例,酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒检测大鼠血清中炎性细胞因子IL-1β、TNF-α和IL-6的浓度.结果 OA组大鼠膝骨组织中软骨细胞层厚度较sham组变薄(P＜0.0001),软骨细胞损伤加重(P＜0.001),促炎细胞因子IL-1β(P＜0.001)、TNF-α(P＜0.001)和IL-6(P＜0.001)水平与sham组相比明显升高,p-JNK阳性率升高.相比较于OA组,BE灌胃给药可缓解DMM诱导的大鼠膝骨关节的软骨损伤(P＜0.05),抑制促炎细胞因子的水平(P＜0.01)以及p-JNK的阳性率.结论 BE可缓解DMM诱导的OA大鼠软骨损伤,抑制炎性细胞因子的生成.BE可能通过调节JNK信号通路参与OA软骨细胞损伤的调控.