甲基胞嘧啶双加氧酶1(TET1)蛋白是一种5-甲基胞嘧啶(5-mC)羟化酶，属于人类α-酮戊二酸加氧酶TET蛋白家族。其功能是识别并结合到基因组5’-胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤基序(CpG)-3’二核苷酸密度高的区域如CpG岛，启动DNA去甲基化程序，维持DNA甲基化和去甲基化平衡，以保持基因组甲基化稳态，实现表观遗传调控。TET1表达和/或功能异常与肿瘤的发生和进展密切相关，在不同来源的肿瘤中可以表现为原癌基因或者抑癌基因属性。本文综述近年来TET1在肿瘤中的作用及机制的研究进展。

目的:探讨长链非编码核糖核酸-母系印迹表达基因3（RNA MEG3）和DNA去甲基化酶TET2在垂体生长激素（GH）腺瘤侵袭性生长中的作用，为后续探索分子生物学机制提供研究方向。方法:收集2016年1月至2019年11月在大连市中心医院诊断为垂体GH腺瘤并接受经鼻-蝶神经内镜手术治疗切除的患者60例，同时收集10例无神经系统或内分泌系统疾病的颅脑外伤患者的正常垂体前叶组织标本作为对照组。利用实时逆转录-聚合酶链反应检测长链非编码RNA MEG3和TET2在正常脑外伤对照垂体前叶组织、侵袭性和非侵袭性垂体GH腺瘤中的表达，并分析组间差异。同时将年龄、性别纳入研究范围，分析年龄、性别对垂体GH腺瘤侵袭性生长的影响。结果:MEG3和TET2的侵袭性生长与患者年龄、性别无关。侵袭性垂体GH腺瘤和非侵袭性垂体GH腺瘤中长链非编码RNA MEG3的表达量较正常对照组脑组织明显降低。分析组间差异发现，长链非编码RNA MEG3表达水平在正常外伤对照垂体组织、非侵袭性GH腺瘤和侵袭性GH腺瘤中依次降低。相对于正常对照组脑组织，长链非编码RNA MEG3在侵袭性垂体GH腺瘤中的相对表达水平为0.097 ± 0.04，而在非侵袭性垂体GH腺瘤的相对表达水平为0.384 ± 0.141。MEG3表达水平与垂体GH腺瘤的侵袭性生长行为有关（ P<0.05）。侵袭性垂体GH腺瘤和非侵袭性垂体GH腺瘤中DNA去甲基化酶TET2的表达水平较正常对照组脑组织明显降低，三组样本中表达水平逐渐降低（ P<0.05）。提示长链非编码RNA MEG3表达量与DNA去甲基化酶TET2表达水平呈正相关。 结论:长链非编码RNA MEG3和DNA去甲基化酶TET2的低表达与垂体生长GH激素腺瘤的侵袭性密切相关。

目的:了解不同类型氟骨症大鼠骨组织5-甲基胞嘧啶（5-mC）、5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）水平，并分析其相关性。方法:选取4周龄SPF级健康SD大鼠30只，适应性喂养1周后，采用随机数字表法将大鼠按体重（100 ~ 120 g）分为对照组（4 ml·kg -1·bw去离子水灌胃+标准维持饲料）、骨硬化组[20 mg·kg -1·bw氟化钠（NaF）灌胃+标准维持饲料]、骨质疏松/骨软化组（20 mg·kg -1·bw NaF灌胃+低钙低蛋白偏食饲料），每组10只，雌雄各半；每周灌胃6 d，实验周期为5个月。实验结束后采集大鼠心脏血、下肢股骨样本。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测血清甲基供体S-腺苷甲硫氨酸（SAM）及其代谢产物S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）含量，骨组织5-mC、5-hmC水平；蛋白免疫印迹（Western blot）法检测大鼠骨组织DNA甲基转移酶（DNMTs），DNA羟甲基化酶（TETs）蛋白表达情况；并分析各组大鼠血清SAM含量、SAM/SAH比值与骨组织5-mC水平以及骨组织5-mC与5-hmC水平的相关性。 结果:对照组、骨硬化组、骨质疏松/骨软化组大鼠血清SAM[11.03（7.06，18.63）、3.96（2.32，9.09）、3.91（2.35，4.46）nmol/L]、SAH含量[（4.69 ± 0.55）、（5.41 ± 1.13）、（13.90 ± 1.09）ng/L]，SAM/SAH比值[2.58（1.54，4.12）、0.62（0.52，1.69）、0.14（0.13，0.15）]及骨组织5-mC[103.39（97.37，109.35）、52.50（50.19，68.13）、55.03（49.97，59.57）ng/L]、5-hmC水平[（32.61 ± 8.84）、（56.96 ± 8.48）、（20.34 ± 6.22）ng/L]比较，差异均有统计学意义（ H/ F = 12.81、284.24、21.85、19.37、55.23，均 P < 0.01）。与对照组比较，骨硬化组、骨质疏松/骨软化组血清SAM含量、SAM/SAH比值、骨组织5-mC水平及骨质疏松/骨软化组骨组织5-hmC水平均较低，而骨质疏松/骨软化组血清SAH含量和骨硬化组骨组织5-hmC水平均较高（均 P < 0.05）；与骨硬化组比较，骨质疏松/骨软化组血清SAH含量较高，而SAM/SAH比值、骨组织5-hmC水平均较低（均 P < 0.05）。Western blot检测结果显示，对照组、骨硬化组、骨质疏松/骨软化组大鼠骨组织DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、TET1、TET2蛋白表达比较，差异均有统计学意义（ F = 285.45、345.58、239.83、311.52、318.24，均 P < 0.001）；其中，骨硬化组、骨质疏松/骨软化组骨组织DNMT1、DNMT3A、DNMT3B蛋白表达均低于对照组，且骨质疏松/骨软化组均低于骨硬化组（均 P < 0.05）；骨硬化组骨组织TET1、TET2蛋白表达均高于对照组和骨质疏松/骨软化组，且骨质疏松/骨软化组均低于对照组（均 P < 0.05）。Spearman秩相关分析结果显示，对照组、骨硬化组、骨质疏松/骨软化组大鼠血清SAM含量、SAM/SAH比值与骨组织5-mC水平均呈正相关（ rs = 0.89、0.92、0.81，0.73、0.87、0.73，均 P < 0.05）；而各组大鼠骨组织5-mC水平与5-hmC水平均呈负相关（ rs = - 0.69、- 0.68、- 0.72，均 P < 0.05）。 结论:骨硬化型氟骨症大鼠骨组织5-mC水平较低、5-hmC水平较高，骨质疏松/骨软化型氟骨症大鼠骨组织5-mC、5-hmC水平均较低；不同类型氟骨症大鼠骨组织5-mC水平差异不显著，这可能与骨组织5-hmC水平存在差异有关。

DNA甲基化是一种重要的表观遗传机制,通常发生在胞嘧啶碱基中,使胞嘧啶接受来自s-腺苷蛋氨酸(s-adenyl methionine,SAM)的甲基形成5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5mC).DNA甲基化变异是急性髓系白血病基因表达变异的重要来源之一,对解析急性髓系白血病的发病机制至关重要.该文主要综述了 DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,DNMT)转录活性改变、突变或异常甲基化导致抑癌基因沉默、DNA甲基转移酶抑制剂(DNA methyltransferase inhibitors,DNMTi)去甲基化增加抑癌蛋白表达水平或再表达、TET(ten-eleven translocation)蛋白通过保护其基因增强子免受DNA甲基化减少蛋白功能缺失、突变的异柠檬酸脱氢酶(Isocitrate dehydrogenases,IDHs)使表观遗传调节剂高甲基化而失活、启动子高甲基化的微小核糖核酸(MicroRNA,miRNA)表达降低后其下游癌基因蛋白表达水平增加等在急性髓系白血病发生发展的研究进展,旨在为急性髓系白血病的生物标志物及临床药物研究提供参考.

目的 探讨银屑病患者皮损组织中Krüppel样因子4(Krüppel-like factor 4,KLF)异常高表达的DNA甲基化分子机制.方法 以20例寻常型银屑病患者病理检查所取皮损组织为实验组,13例眼外伤手术患者所取眼睑皮肤组织为对照组.采用亚硫酸氢盐测序(bisulfite sequencing,BSP)检测各组皮肤样本及转染十-十一转位3(ten-eleven translocation 3,TET3)过表达及干扰质粒的人永生化角质形成细胞HaCat中转录因子Krüppel样因子4(Krüppel-like factor 4,KLF4)启动子区DNA甲基化水平,RT-qPCR和Western blotting检测各组皮肤组织样本及转染HaCat细胞中KLF4、TET1(ten-eleven translocation1)、TET2、TET3的表达水平.结果 实验组KLF4启动子DNA甲基化水平显著低于对照组(P<0.01),实验组KLF4的mRNA表达水平显著高于对照组(P<0.01).实验组KLF4启动子DNA甲基化水平与mRNA表达水平呈显著负相关(r=-0.649,P=0.002).实验组TET3表达水平显著高于对照组(P<0.01),TET1及TET2表达水平差异无统计学意义.实验组TET3表达水平与KLF4启动子DNA甲基化水平呈显著负相关(r=-0.688,P=0.001).HaCat细胞中过表达TET3后,KLF4启动子DNA甲基化水平明显下调(P<0.01),KLF4表达水平显著上调(P<0.01).HaCat细胞中干扰TET3表达后,KLF4启动子DNA甲基化水平明显上调(P<0.01),KLF4表达水平显著下调(P<0.01).结论 过度表达的TET3通过下调KLF4启动子DNA甲基化水平,介导银屑病患者皮损组织中KLF4过度表达.

目的 探讨萝卜硫素(Sul)促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)向成骨细胞分化的分子机制.方法 将BMSCs分为对照组(不做任何处理)、诱导组(诱导成骨分化)、诱导+Sul组(诱导成骨分化并加入40 μmol/L Sul);分别向BMSCs转染腺病毒-shRNA-Mock、-shRNA-TET1、-shRNA-TET2、-shRNA-TET3,作为shRNA-Mock组、shRNA-TET1组、shRNA-TET2组、shRNA-TET3组;BMSCs于含成骨分化诱导培养液及添加40 μmol/L Sul的细胞培养液中培养,然后转染腺病毒-shRNA-TET1、-shRNA-TET2、-shRNA-TET3、-shRNA-Mock,作为诱导+Sul+shRNA-TET1组、诱导+Sul+shRNA-TET2组、诱导+Sul+shRNA-TET3组、诱导+Sul+shRNA-Mock组.qPCR法和Western blot法测定BMSCs向成骨细胞分化后Runx2 mRNA和蛋白的表达水平.染色质免疫共沉淀(ChIP)实验测定BMSCs向成骨细胞分化后,与Histone H3结合的Runx2启动子区DNA含量.HpaⅡ酶和MspⅠ酶消化联合qPCR法测定BMSCs向成骨细胞分化后Runx2启动子区的甲基化水平.茜素红染色测定BMSCs向成骨细胞分化的程度.结果 与诱导组相比,诱导+Sul组Runx2 mRNA和蛋白表达水平明显上升(P<0.05),与Histone H3结合的Runx2启动子区DNA含量增高(P<0.05),Runx2启动子区的甲基化水平降低(P<0.05),茜素红染色评分升高(P<0.05).与诱导+Sul组相比,诱导+Sul+shRNA-TET1组细胞内与Histone H3结合的Runx2启动子区DNA含量降低(P<0.05),Runx2启动子区的甲基化水平升高(P<0.05),茜素红染色评分明显降低(P<0.05);而诱导+Sul+shRNA-TET2组、诱导+Sul+shRNA-TET3组及诱导+Sul+shRNA-Mock组则无明显变化(P>0.05).结论 Sul能够通过TET1促进Runx2启动子区DNA去甲基化,促进BMSCs向成骨细胞分化.

DNA甲基化作为一种重要的表观修饰,在基因表达调控及胚胎生长发育等方面起到重要作用.尽管5-甲基胞嘧啶(5mC)是一种稳定的共价修饰,但它在生物体内仍处于一个动态变化的过程,也就是说,它可能会通过某种方式发生去甲基化.而TET蛋白功能的揭示为DNA主动去甲基化提供了一条途径:TET双加氧酶可以将5mC迭代氧化形成5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)、5-醛基胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC),再通过DNA糖苷酶TDG介导的碱基切除修复(base excision repair,BER)途径将5mC重新变为未修饰的胞嘧啶.随着人们对TET双加氧酶及主动去甲基化研究的深入,主动去甲基化的生物学功能也被逐渐揭示.现总结了已经揭示的主动去甲基化分子机制和生物学意义,同时,概括了本实验室近些年的研究进展.

DNA甲基化是生命体最主要的表观遗传修饰之一.哺乳动物DNA甲基化主要发生在胞嘧啶第五位碳原子上,称为5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5mC).哺乳动物DNA甲基化由从头DNA甲基转移酶DNMT3A/3B在胚胎发育早期建立,甲基化模式的维持由DNA甲基转移酶DNMT1实现.TET家族蛋白氧化5-甲基胞嘧啶起始DNA的去甲基化过程.这些DNA甲基化修饰酶精确调节DNA甲基化的动态过程,在整个生命发育过程中发挥重要作用,其失调也与多种疾病发生密切相关.现结合国内外同行研究进展,介绍课题组近年来对DNA甲基化修饰酶的结构与功能研究.

目的 探讨在干细胞定向分化以及胚胎早期发育中,miRNA-29b对DNA去甲基化酶TET蛋白功能的调控机制.方法 采用生物信息学的方法结合双荧光素酶报告基因检测进行体外验证获得靶miRNAs;通过受精卵显微注射进行体内验证;对脂肪来源的间充质干细胞(adipose-derived stromal cells,ASCs)定向分化,确认靶miRNAs对Tets基因的影响.结果 小鼠Tet1、Tet2、Tet3基因都是miR-29abc的靶基因,且miR-29b抑制效率最高(P＜0.05);通过CRISPR/Cas9技术突变,miR-29b能增强Tets的表达(P＜0.05),并能显著促进ASCs向成骨细胞分化的效率(P＜0.05).结论 miR-29b可以下调Tets表达,并且下调miR-29b能显著促进间充质干细胞向成骨细胞分化的效率.

目的 探究辅助生殖技术(ART)助孕对单胎足月分娩新生儿的胎盘及胎盘总DNA甲基化水平和甲基化相关基因表达的影响.方法 选择2016年6月-2016年12月期间单胎足月分娩的患者,ART子代为ART组,自然妊娠子代为对照组,两组按孕妇年龄、孕周等进行配对后,比较两组胎盘质量、新生儿体质量、胎盘效率.采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定胎盘总DNA的甲基化水平,采用实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)方法检测胎盘甲基转移酶(DNA methyltransferase,DNMT)家族和去甲基化酶(ten-eleven translocation,TET)家族的mRNA表达水平.结果 ①ART组新生儿体质量[(3 650.50±393.84)g]、胎盘重量[(633.05±98.58)g]显著增加,且高于对照组[(3 339.50±377.01)g,(563.00±85.60)g](P＜0.05).②ART组胎盘总DNA甲基化水平(1.22％±0.45％)显著低于对照组(2.08％±0.98％)(P＜0.05).③ART组DNMT3B、TET1、TET2、TET3的mRNA相对表达量分别为4.61±1.06、4.66±1.06、4.99±1.09、4.92±1.13,显著高于对照组(1.23±0.55、1.27±0.56、1.47±0.50、1.41±0.61)(P＜0.05),DNMT1、DNMT3A的表达水平无统计学差异(P＞0.05).结论 ART会导致人类妊娠晚期胎盘过度生长,总DNA甲基化水平降低,DNMT3B、TET1、TET2、TET3表达上调可能是导致胎盘DNA甲基化水平降低的机制.