外泌体是一类拥有磷脂双分子层结构的纳米大小的囊形小体，几乎所有类型细胞都可以分泌。外泌体可通过相关的生物活性物质(DNA、microRNA和蛋白质等)与靶细胞相互作用而实现信息传递和功能调控。以慢性阻塞性肺疾病及支气管哮喘为代表的慢性气道炎症性疾病是常见的呼吸系统疾病，伴随着对外泌体结构功能持续深入的探究，人们发现外泌体在气道炎症性疾病进展中发挥着重要作用，外泌体很可能成为慢性气道炎症性疾病的新型诊断生物标志物、潜在的治疗靶点及药物的载体。本文对外泌体的特性和功能以及在慢性气道炎症性疾病诊疗中的研究进展作一综述。

目的:筛选血管炎性标志物脂蛋白相关磷脂酶A2（Lp-PLA2）的DNA适体，并建立以非标记核酸适体-纳米金为探针的可视化检测方法。方法:方法学建立。通过磁珠固定SELEX技术经孵育结合、ssDNA分离、PCR扩增、单链回收的8轮循环筛选Lp-PLA2适体，利用表面等离子体共振技术和流式细胞术验证适体的亲和力和特异性，并通过计算机软件模拟适体二级结构及其与靶蛋白的三维分子对接。随后制备适体-纳米金复合物，利用靶标竞争结合导致纳米金溶液在盐诱导下凝聚引起颜色变化，分光光度计检测溶液的吸光度检测靶标浓度，建立样品溶液中Lp-PLA2浓度与吸光度的线性关系。结果:筛选获得3条高亲和力、强特异性的Lp-PLA2核酸适体B76-2、B76-4及B76-5，解离常数分别为1.07、1.26及1.75 nmol/L；并成功基于B76-2适体构建纳米金比色传感方法，其线性范围和检测限分别是20~500 ng/ml和78 ng/ml，反应时间30 min，可特异性区分靶标与其他血栓标志物如凝血酶和髓过氧化物酶。结论:利用核酸适体-纳米金显色实现了简单、快速、特异的Lp-PLA2可视化检测。

目的:评价前期获得的1株仅具有互补决定区3（CDR3）的单域抗体（sdAbs）NBL42作为纳米抗体亲和力移植通用框架的潜力。方法:采用亲和力转移的方法将分别结合蒜氨酸酶、程序性死亡受体-1（PD-1）、溶菌酶和CD47的4种抗体VHH-A4、VHH-H5、cAb-Lys3和B6H12的CDR3序列移植到NBL42对应的CDR3区。DNA合成获得4种仅具有CDR3的重组sdAbs，镍柱纯化并获得目的蛋白，间接ELISA法检测4种重组纳米抗体与抗原的结合及其热稳定性。用Swiss Model三维建模分析移植前后sdAbs的空间结构。结果:纯化后的4种重组蛋白在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）中呈现单一条带，相对分子质量与预期相符。移植后的重组sdAbs NBL42-A4CDR3和NBL42-H5CDR3获得了与蒜氨酸酶和PD-1的特异结合能力，但结合活性降低了约50%，并转变为可溶性表达形式。移植后的重组sdAbs NBL42-L3CDR3和NBL42-B6H12CDR3完全丧失了对原抗原溶菌酶和CD47的结合能力。在热稳定性分析中，移植后的重组sdAbs NBL42-A4CDR3和NBL42-H5/CDR3保留了约50%的剩余结合活性。根据C88Y突变实验和Swiss Model三维建模分析，提示NBL42-FR3中88位半胱氨酸对于亲和力转移可能具有重要作用。结论:NBL42具有作为CDR3移植和亲和力转移框架的潜力。

目的:探讨纳米孔测序技术在检测血友病A倒位的可行性。方法:采集临床上已经明确为血友病A倒位携带者的外周血样，提取基因组DNA，应用纳米孔测序技术进行测序和生物信息学分析家系携带者的基因变异情况。结果:纳米孔测序结果显示，家系1的先证者外甥女为血友病A Inv22携带者，家系2的先证者母亲为血友病A Inv1携带者，与临床诊断结果一致，且精确定位倒位的断裂位点。此外，对测序结果进行统计分析发现，携带者的基因组存在大量的结构变异如缺失、重复、插入、倒位和易位等。结论:纳米孔测序技术可用于血友病A倒位的基因变异分析，并为基因倒位导致相关遗传疾病的诊断提供可选择的方法。

细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是细胞衍生的具有单层膜结构的纳米囊泡,在细胞和组织间传递生物活性物质,如蛋白质、核酸、代谢分子等.线粒体细胞外囊泡(mitochondrial contents-containing EVs,mitoEVs)是近期发现的EV新亚型,以线粒体组分为主要内容物,如线粒体DNA、线粒体RNA、线粒体相关蛋白质及损伤的线粒体颗粒或活性线粒体.MitoEVs外排有助于维持自身细胞的线粒体稳态、恢复靶细胞的代谢状态及参与免疫微环境调节.MitoEVs携带的生物学信息可能成为疾病诊断的重要靶点,其中的活性线粒体成分在多种疾病治疗中展现出潜在效用.综合而言,对mitoEVs的形成机制、功能及提取鉴定技术进行综述,并对其未来临床应用前景进行展望,可为疾病诊断标志物的开发和治疗提供潜在靶点和思路.

外泌体(exosome)是指从细胞膜上脱落或由细胞分泌的双层膜结构的纳米级囊泡状小体,直径为40～150 nm,它可以包裹DNA、mRNA、microRNA、circRNA、蛋白质等.包括肿瘤细胞在内的几乎所有活细胞都能分泌外泌体,在细胞通信、信号转导、包裹递送、肿瘤治疗和诊断中均起关键作用.外泌体具有独特的生物学特性,优良的肿瘤归巢性和对递送药物靶向性使外泌体成为癌症诊断中极具吸引力标志物和有效的肿瘤治疗工具,因此,对外泌体作为纳米材料更全面的研究,必将加速其在治疗肿瘤的研究进展.总结了外泌体的靶向递送功能,以及外泌体在肿瘤诊断、免疫疗法、肿瘤微环境、药物耐药性等癌症治疗相关问题,期望对基于外泌体在肿瘤治疗中的开发和评估提供思考.

目的 构建一种无镁离子组装的新型氨基葡萄糖/DNA复合纳米材料,验证氨基葡萄糖能否介导组装DNA纳米管(nanotube,NT),并评价其对体外Raw264.7细胞功能的影响.方法 采用梯度退火法,使用Y1、Y2和Y3这3条DNA单链,以氨基葡萄糖(glucosamine,GlcN)为介质组装DNA NT,构建氨基葡萄糖/DNA复合纳米材料(NTGlcN).使用原子力显微镜(atomic force microscopy,AFM)观察其纳米结构,激光动态光散射(dynamic light scattering,DLS)测量该纳米材料的尺寸.选用Raw264.7细胞系,采用CCK-8法测试氨基葡萄糖或NTGlcN的细胞毒性,流式细胞术和激光共聚焦考察细胞对该纳米结构的摄取效率,RT-qPCR测定NTGlcN和NTMg(镁离子介导组装的DNA纳米管)对脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)诱导的巨噬细胞炎症因子(IL-1β、IL-6)表达水平的影响.结果 氨基葡萄糖可以成功介导NTGlcN的合成,稳定性较好.AFM表征结果表明,NTGlcN为管状颗粒,均匀地分散在云母表面上;DLS测量表明NTGlcN的直径为(15.26±3.86)nm.细胞实验显示:较之NTMg,巨噬细胞对NTGlcN有更高的细胞摄取效率,NTGlcN处理后细胞存活率更高(P＜0.05);NTGlcN处理后,LPS诱导的巨噬细胞炎症因子表达降低(P＜0.05).结论 本研究构建的氨基葡萄糖/DNA复合纳米材料具有良好的稳定性、生物相容性和细胞摄取效率;能降低氨基葡萄糖的细胞毒性,并能通过降低Raw 264.7细胞炎症因子的表达来抑制细胞炎症反应.

mRNA 是一种单链核糖核酸,由一条 DNA 转录而成,携带蛋白质合成的编码信息,进一步转录并加工成功能蛋白.在基因工程的协同下,合成的 mRNA 在结构上类似于天然 mRNA,使患者能够在自己的身体中产生治疗性蛋白质,从而达到预防或治疗疾病的目的.mRNA 治疗避免了其遗传物质整合宿主基因组的风险,也不需要进入细胞核进行转染,它甚至可以在不分裂的细胞中表达.因此,基于 mRNA 的基因疗法成为极具潜力的临床治疗手段.高效、安全地递送 mRNA 是其临床应用的两个主要制约因素.目前虽然已有很多报道通过修饰 mRNA 的结构来提高其稳定性和耐受性,但 mRNA 的递送效果仍然有待提高.近年来,纳米生物技术取得的重大进展为 mRNA 纳米载体开发提供了技术支撑.纳米载体能够克服递送过程中的生理障碍,使 mRNA 到达目标部位.本文介绍了纳米给药系统的设计原则和研究热点.重点聚焦新兴纳米载体在 mRNA 传递中发挥的作用以及在递送功能研究方面的最新进展;最后,对 mRNA 的纳米载体递送技术发展前景进行了展望.

目的 运用磷酸钙纳米颗粒包裹DNA转染皮肤鳞癌细胞,以靶向干扰LIM结构域蛋白4(LMO4)表达,探讨转录因子LMO4在皮肤鳞癌中作用和机制.方法 采用逆转录-定量PCR技术(RT-qPCR)、免疫组织化学和蛋白质免疫印迹技术检测目的分子表达.利用经典方法制备磷酸钙纳米颗粒,包裹含有靶向干扰LMO4的shRNA表达载体,转染人皮肤鳞癌细胞A431.采用噻唑蓝(MTT)方法检测细胞增殖能力;运用流式细胞分析技术检测细胞周期变化.结果 LMO4在皮肤鳞癌组织和A431细胞中高水平表达.磷酸钙纳米颗粒与DNA的最佳包裹比例为10:1.此纳米颗粒包裹的DNA可以有效转染A431细胞并有效干扰LMO4表达,与脂质体转染后的干扰效率相比,差异无统计学意义(P=0.21).在A431细胞中干扰LMO4后的24、36和48 h,细胞的增殖能力较对照组均显著降低.细胞周期分析显示:干扰组G0/G1期细胞为39.82％±1.86％,与对照组G0/G1期细胞(30.76％ ±1.96％)相比,差异有统计学意义(P=0.003);干扰组的S期细胞为39.56％±0.65％,与对照组的S期细胞(50.65％±0.62％)比较,差异有统计学意义(P=0.002).干扰LMO4表达可以抑制细胞周期素蛋白E和周期素蛋白激酶2(CDK2)的表达.结论 磷酸钙纳米颗粒能有效包裹DNA,并具有较高的转染效率;干扰LMO4表达可抑制细胞周期素蛋白E和CDK2的表达,抑制细胞增殖.

目的:构建BNN6@PEG-HCuSNPs纳米粒子,同时观察其小鼠体内外抗结肠癌效果.方法:水热反应构建BNN6@PEG-HCuSNPs纳米粒子,体外观察BNN6@PEG-HCuSNPs的光热、光动力以及气体治疗效果,选取CT26 细胞作为研究对象,共聚焦显微镜下观察CT26 细胞对BNN6@PEG-HCuSNPs的摄取,DCFH-DA荧光探针检测BNN6@PEG-HCuSNPs对CT26 细胞释放ROS的影响,DAF-FMDA荧光探针检测BNN6@PEG-HCuSNPs对CT26 细胞释放NO的影响,BBoxiProbe荧光探针检测BNN6@PEG-HCuSNPs对CT26 细胞释放ONOO-的影响,Calcein-AM和PI检测BNN6@PEG-HCuSNPs对CT26 细胞存活的影响.取雌性Balb/c小鼠肿瘤建模,当肿瘤体积生长到约150 mm3 后,将荷瘤小鼠随机分成6 组,每组5 只:对照组、Laser组、PEG-HCuSNPs组、PEG-HCuSNPs+Laser组、BNN6@PEG-HCuSNPs组、BNN6@PEG-HCuSNPs +Laser组.在治疗过程中,通过尾静脉分别在第0 和3 天向对应的组注入生理盐水或 20 mg/kg的BNN6@PEG-HCuSNPs纳米粒子,观察各组肿瘤体积和重量,HE染色分析细胞结构、TUNEL分析细胞DNA碎片和Ki-67 抗原染色.结果:透射电镜、扫描电镜、核磁氢谱显示成功合成了BNN6@PEG-HCuSNPs纳米粒子.BNN6@PEG-HCuSNPs能够被CT26 细胞有效内吞,BNN6@PEG-HCuSNPs在联合NIR-Ⅰ照射之后,在细胞水平能够稳定且有效的产生ROS和NO,并且二者经过进一步氧化反应生成更具有细胞毒性的活性氮成分ONOO-.Calcein-AM和PI结果显示BNN6@PEG-HCuSNPs在NIR-Ⅰ照射下能够引起肿瘤细胞CT26 的凋亡进而达到治疗作用,且不会对HUVECs细胞和CT26 细胞产生明显的毒性.光声成像监测显示BNN6@PEG-HCuSNPs能聚集在肿瘤部位,BNN6@PEG-HCuSNPs联合NIR-Ⅰ所产生的光热/光动力/气体治疗对肿瘤抑制作用优于其他组.TUNEL结果显示BNN6@PEG-HCuSNPs + Laser组所引起的大量肿瘤细胞凋亡而出现较其他组更为明显的绿色荧光;Ki-67 抗原染色结果显示相比于对照组、Laser组、PEG-HCuSNPs 组、BNN6@PEG-HCuSNPs 组和PEG-HCuSNPs +Laser 组,BNN6@PEG-HCuSNPs +Laser组的中阳性核数量减少最为明显.结论:BNN6@PEG-HCuSNPs纳米粒子小鼠体内外抗结肠癌效果显著.