目的 制备靶向抗T细胞免疫球蛋白-ITIM结构域蛋白(T cell immune receptor with Ig and ITIM domains,TIGIT)和脊髓灰质炎病毒受体相关免疫球蛋白结构域蛋白(Poliovirus re-ceptor-related immunoglobin domain-containing protein,PVRIG)双特异抗体,探究其体外生物学活性.方法 用PVRIG人源化抗体hP1和TIGIT人源化抗体hT1构建KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV双特异性抗体,将纯化得到KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV抗体进行SDS-PAGE凝胶电泳、热稳定性检测和稳定性分析;采用流式细胞术(Fluorescence activated cell sor-ting,FACS)检测双特异性抗体的结合活性;采用生物干涉膜技术(Bio-layer interferometry,BLI)检测双特异性抗体亲和力;用 Jurkat-NFAT-Luc2-PD1-TIGIT-PVRIG 细胞和 293T-OS8-PVRL2-PDL1细胞中检测双特异性抗体KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV对于TIGIT/PVRIG靶点的阻断作用;采用CMV recall assay法检测IFN-r在上清液中的浓度.结果 SDS-PAGE凝胶电泳结果显示KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV双特异性抗体纯度＞95％;Tm结果为Tm1:66.34,Tm2:80.95.采用SEC-HPLC对双特异性抗体KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV进行稳定性分析,其纯度均＞90％.KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV抗体和PVRIG的人源化抗体hP1与293T-PVRIG cell line 的 EC50 分别为 0.168 70 μg/mL 和 0.038 65 μg/mL,与 293T-cyno-PVRIG cell line 的 EC50 分别为 0.037 14 μg/mL 和 0.031 98 μg/mL,与 Human PVRIG Protein,His Tag的亲和力为 1.74E-10M 和 1.69E-10M.KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV 抗体和 TIGIT 的人源化抗体 hT1 与 293T-PVRIG cell line 的 EC50 分别为 0.070 27 μg/mL 和 0.031 21 μg/mL;与293T-cyno-TIGIT cell line 的 EC50 分别为 0.020 28μg/mL 和 0.028 22 μg/mL;与 Human TIGIT Protein,His Tag 的亲和力为 8.50E-10M 和 8.47E-10M.KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV 抗体具有阻断 PD1/PDL1/TIGIT/PVRIG 相互作用活性,且 KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV 的 EC50为 0.007 μg/mL,优于单独人源化抗体 hT1(EC50为 0.013 μg/mL)和 hP1(EC50为 0.048 μg/mL)的作用.在含 pp65 peptide 条件下 KY-TIGIT-h1gG4M-PVRIG-SCFV 抗体分泌 IFN-r 为 349.72 pg/mL,明显高于其他抗体.结论 KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV抗体具有高亲和力和良好的生物学活性,有望开发成为肿瘤免疫治疗的抗体药物.

目的:观察人白细胞抗原G(human leukocyte antigen G，HLA-G)在人T淋巴细胞白血病1型病毒(human T-cell leukemia virus type 1，HTLV-1)阳性T细胞中的表达情况，研究其在影响HTLV-1感染发生发展中的作用。方法:采用Western blot及real-time PCR检测HLA-G在HTLV-1阳性T细胞系(MT2和MT4)中的表达。构建HLA-G基因沉默的siRNA，用于敲低MT2和MT4细胞中的HLA-G，在mRNA和蛋白质水平观察HLA-G对HTLV-1蛋白Tax、P19表达的影响，同时在RNA水平监测HLA-G基因沉默后MT2和MT4细胞中细胞因子的表达变化。CCK8法观察MT2和MT4细胞的增殖能力，Western blot检测信号传导与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)通路相关蛋白。结果:与HTLV-1阴性T细胞(Jurkat和MOLT4)比较，MT2和MT4细胞均高表达HLA-G分子。siRNA敲低MT2和MT4细胞中的HLA-G后，HTLV-1 Tax和P19的mRNA和蛋白质表达水平均下降，抗病毒因子IFN-γ和TNF-α表达升高，MT2和MT4细胞的增殖能力和STAT3磷酸化水平均降低。结论:HTLV-1能诱导T细胞高表达免疫耐受分子HLA-G，抑制HLA-G表达可促进抗病毒因子的产生，降低IL-6及STAT3磷酸化水平，从而有效抑制HTLV-1的复制。

目的:探讨IL-6诱导人脐动脉平滑肌细胞（HUASMC）成骨样分化及钙化的跨膜信号转导机制。方法:体外培养HUASMC，分别给予IL-6、IL-6+可溶性IL-6受体（sIL-6R）、IL-6+sIL-6R+可溶性gp130（sgp130）刺激，设空白对照。茜素红及Von Kossa染色检测钙化水平，免疫印迹检测钙化相关分子组织非特异性碱性磷酸酶（TNAP）、骨桥蛋白（OPN）、骨形态发生蛋白（BMP-2）及Runt相关转录因子2（Runx2）表达，免疫荧光检测膜型IL-6R（mIL-6R）表达。计量资料组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD- t检验。 结果:IL-6+sIL-6R组钙化染色较其他组增多，IL-6+sIL-6R+sgp130组较IL-6组及空白组增多。蛋白印迹结果显示，干预12 h，TNAP蛋白表达量：空白组（0.44±0.08)、IL-6组（0.52±0.14）、IL-6+sIL-6R组（0.84±0.16）、IL-6+sIL-6R+sgp130组（0.55±0.10），各组差异具有统计学意义（ F=290.96， P<0.001）；干预72 h，OPN蛋白的表达量：空白组（0.61±0.84）、IL-6组（0.95±0.16）、IL-6+sIL-6R组（1.65±0.24）、IL-6+sIL-6R+sgp130组（0.99±0.10），各组差异具有统计学意义（ F=507.72， P<0.001）。干预12 h，BMP-2蛋白的表达量：空白组（(0.77±0.05）、IL-6组（1.69±0.16）、IL-6+sIL-6R组（2.81±0.26）、IL-6+sIL-6R+sgp130组（0.57±0.12），各组差异具有统计学意义（ F=959.09， P<0.001）；干预72 h，Runx2蛋白的表达量：空白组（0.57±0.03）、IL-6组（0.92±0.10）、IL-6+sIL-6R组（1.31±0.13）、IL-6+sIL-6R+sgp130组（0.66±0.06），差异具有统计学意义（ F=1 141.27， P<0.001）。IL-6+sIL-6R组中TNAP、OPN、BMP-2、Runx2的表达均高于其他组。免疫荧光结果显示HUASMC少量表达mIL-6R。 结论:IL-6可能主要通过sIL-6R介导的反式信号通路诱导HUASMC成骨样分化和钙化。

目的:探讨硼替佐米(BOR)对急性T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat的增殖抑制和促凋亡作用及其相关作用机制。方法:2017年5月至2019年5月，采用四甲基偶氮唑蓝法(MTT法)检测硼替佐米对Jurkat细胞增殖的影响；流式细胞仪检测硼替佐米对Jurkat细胞细胞凋亡的影响；实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)法检测硼替佐米对Jurkat细胞Bax、Bcl-2、Cox-2基因表达水平的影响。结果:5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL浓度BOR作用于Jurkat细胞24 h的增殖抑制率分别为(13.23±0.71)%、(39.53±0.95)%、(53.07±1.12)%、(60.43±0.75)%，48 h的增殖抑制率分别为(25.20±0.96)%、(52.80±1.30)%、(60.67±0.64)%、(75.10±1.35)%，72 h的增殖抑制率分别为(38.37±0.93)%、(60.94±0.85)%、(73.83±5.08)%、(88.37±1.55)%，Jurkat细胞的增殖抑制率随药物浓度的增加、作用时间的延长而增加，差异均有统计学意义( F＝1 602.202、1 085.089、181.034，均 P<0.05)。5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL浓度BOR作用于Jurkat细胞24 h、48 h、72 h，Jurkat细胞凋亡率随药物浓度的增加、作用时间的延长而增加，差异均有统计学意义( F＝1 288.571、223.378、251.175，均 P<0.05)。5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL浓度BOR作用于Jurkat细胞24 h、48 h、72 h，Jurkat细胞Bax mRNA表达水平随药物浓度的增加、作用时间的延长而增高，差异均有统计学意义( F＝258.446、518.929、276.764，均 P<0.05)；而Bcl-2 mRNA、Cox-2 mRNA表达水平随药物浓度的增加、作用时间的延长而减低，差异有统计学意义( FBcl-2 mRNA＝236.848、264.849、343.968， FCox-2 mRNA＝679.404、1 288.681、1 541.850，均 P<0.05)。 结论:BOR对Jurkat细胞有抑制增殖、诱导凋亡的作用。BOR可使Jurkat细胞BaxmRNA表达水平上调、Bcl-2和Cox-2 mRNA表达水平下调。BOR上调Bax表达、下调Bcl-2和Cox-2表达是其促凋亡的分子机制之一。

目的:探讨circ-PTPN22的翻译能力及其与系统性红斑狼疮（SLE）的关系。方法:2019年5月10日至2019年9月30日分别于西南医院中西医结合风湿免疫科和体检中心收集6例SLE女性患者和9例健康女性对照全血样本，分离外周血单个核细胞（PBMC），其中3例SLE和3例健康对照PBMC采用磁珠分选为T、B、NK细胞。通过circRNADb网站预测出circ-PTPN22内部核糖体进入位点（IRES）序列及蛋白序列，制备针对circ-PTPN22剪接位点处特异氨基酸序列的兔抗circ-PTPN22pro多克隆抗体，Western印迹法检测健康对照和SLE患者PBMC以及T、B、NK细胞亚群中circ-PTPN22pro的表达。将circ-PTPN22-FLAG、circ-PTPN22-NC-FLAG、circ-PTPN22-shRNA-FLAG、circ-PTPN22-shRNA-NC-FLAG重组慢病毒分别转染培养的Jurkat细胞，以正常培养的细胞作为细胞对照组，Western印迹法检测Jurkat细胞中circ-PTPN22pro蛋白表达，流式细胞仪检测circ-PTPN22对细胞活化和凋亡的影响。采用两因素重复测量方差分析和两独立样本 t检验进行统计分析。 结果:circRNAD数据库预测显示，circ-PTPN22具有翻译能力，且Western印迹显示circ-PTPN22pro蛋白相对分子质量为20 000。转染48 h后，circ-PTPN22-FLAG组circ-PTPN22pro表达明显高于circ-PTPN22-NC-FLAG组和细胞对照组。转染24、48、72 h，circ-PTPN22组白细胞介素2（IL-2）表达（22.20% ± 8.92%、31.10% ± 5.88%、53.20% ± 10.25%）均低于circ-PTPN22-NC组（30.90% ± 11.00%、51.23% ± 10.70%、69.67% ± 9.00%； F = 284.881， P = 0.003）；circ-PTPN22-shRNA组IL-2表达（35.57% ± 8.79%、78.10% ± 10.08%、88.63% ± 3.89%）均高于circ-PTPN22-shRNA-NC组（26.73% ± 4.92%、41.03% ± 10.45%、41.33% ± 4.96%； F = 293.818， P = 0.003）。转染48、72、96 h后，circ-PTPN22组、circ-PTPN22-shRNA组细胞凋亡率均分别高于circ-PTPN22-NC组（ F = 81.287， P = 0.012）、circ-PTPN22-shRNA-NC组（ F = 111.813， P = 0.009）。SLE组PBMC中circ-PTPN22pro表达低于健康对照组，几乎不表达。SLE组T、B细胞中circ-PTPN22pro表达均显著低于健康对照组（ t = 3.047、4.806， P < 0.05），两组NK细胞中circ-PTPN22pro表达差异无统计学意义（ t = 0.582， P > 0.05）。 结论:circ-PTPN22可翻译circ-PTPN22pro蛋白，具有抑制Jurkat细胞活化功能，SLE患者PBMC中circ-PTPN22pro表达低于健康对照，提示其与SLE发生发展可能存在一定关系。

目的:研究手足口病发病与细胞因子水平异常变化的关系，研究EV71病毒诱导细胞天然免疫的发生机制。方法:将Jurkat细胞接种到24孔板中，设EV71病毒感染组和对照组，并用Realtime-PCR法检测感染不同时间段的细胞上清液中IL1-β、IL6、TNF-α、IFN-γ的mRNA表达含量。用乙酰肉豆蔻佛波酯（phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA）预作用Jurkat细胞不同时间后，接种EV71病毒，检测细胞上清液中病毒载量变化。结果:EV71病毒感染Jurkat细胞后，IL1-β的mRNA在6 h后达峰，IL-6的mRNA在24 h后达峰，TNF-α和IFN-γ的mRNA分别在48 h和72 h达峰；PMA预作用Jurkat细胞后，IL1-β、IL6、TNF-α、IFN-γ的mRNA表达均上调，病毒载量下降。结论:随着EV71病毒作用时间的延长，IL1-β、IL6、TNF-α、IFN-γ的mRNA表达均达峰值，Jurkat细胞内EV71病毒载量呈递减趋势。EV71可引起IL1-β、IL6、TNF-α、IFN-γ细胞因子反应。

目的:研究DNA甲基化在结核分枝杆菌（MTB）裂解物诱导CD4 +T细胞白细胞介素6受体（IL-6R）表达下调中的作用及机制。 方法:本研究属于前瞻性研究。收集并分选2019—2020年深圳市第三人民医院10名健康人（对照组）和10例结核病患者（TB组）外周血单个核细胞（PBMC）中CD4 +T细胞，亚硫酸氢盐测序法分析 IL-6R启动子区和3′非翻译区（UTR）区CpG岛甲基化变化；RT-qPCR和Western blotting分别检测IL-6R和DNA甲基转移酶（DNMT）表达；进一步通过MTB裂解物刺激anti-CD3/CD28抗体活化的对照组PBMC和Jurkat E6-1细胞，检测 IL-6R不同区域CpG岛甲基化和IL-6R、DNMT表达的变化；双荧光素酶报告基因系统检测 IL-6R 3′UTR区甲基化状态对其转录活性的影响；两组间采用非配对 t检验，三组及以上多组运用one-way ANOVA分析。 结果:在对照组和TB 组外周血CD4 +T细胞中，TB组中IL-6R表达低于对照组，而DNMT1和DNMT3B则高于对照组；且与对照组比， IL-6R启动子CpG岛甲基化水平差异无统计学意义；3′ UTR区CpG岛甲基化率分别为54.3%±4.7%和69.5%±3.4%，差异有统计学意义（ P<0.001）；在体外，MTB裂解物刺激活化对照组PBMC后，IL-6R表达低于未刺激的，而DNMT1和DNMT 3B表达高于未刺激的；同时CD4 +T细胞中 IL-6R 3′ UTR区CpG岛甲基化率由58.9%±11.6%增加至79.4%±10.9%，差异有统计学意义（ P<0.001）；同样地，MTB刺激活化Jurkat E6-1细胞后的结果与对照组PBMC相一致。进一步发现DNA甲基转移酶抑制剂地西他滨（5-aza）与MTB裂解物共处理后IL-6R 的表达均高于MTB 裂解物单独刺激的；DNA甲基转移酶抑制剂地西他滨（5-aza）与MTB裂解物共处理后 IL-6R 3′ UTR区CpG岛甲基化水平低于MTB 裂解物单独刺激的，并且完全非甲基化修饰的 IL-6R 3′UTR报告基因的转录活性高于完全甲基化修饰的 IL-6R 3′ UTR区CpG岛。 结论:MTB裂解物刺激通过诱导CD4 +T细胞 IL-6R 3′UTR区CpG岛高甲基化抑制 IL-6R转录活性进而下调其表达；MTB诱导CD4 +T细胞 IL-6R 3′UTR区CpG岛高甲基化可能与DNMT1、DNMT3B表达增加有关。

目的:探讨姜黄素对糖皮质激素耐药的急性淋巴细胞白血病（ALL）Jurkat细胞株生物学特性和NF-κB通路相关蛋白表达的影响。方法:选择ALL耐药细胞株Jurkat，以1 μmol/L地塞米松作为Jurkat细胞耐药最佳浓度，传代培养细胞。将细胞分为10、25、50 μmol/L姜黄素组，以及50 μmol/L吡咯烷二硫基甲酸酯（PDTC）组、对照组（加入等体积不含药物的培养液）。各组细胞培养72 h，倒置显微镜下观察细胞形态。采用CCK-8法检测Jurkat细胞增殖能力，流式细胞术检测Jurkat细胞凋亡能力和细胞周期，实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测NF-κB p65、NF-κB p50、IκBα、A20 mRNA的相对表达情况，蛋白质印迹法检测NF-κB p65、NF-κB p50、IκBα、caspase-8、caspase-3、bcl-2、A20蛋白的表达。结果:10、25、50 μmol/L姜黄素及50 μmol/L PDTC分别处理Jurkat细胞72 h，对照组细胞膜基本完整，大小一致，圆形透明，细胞核荧光均匀；不同浓度姜黄素组和50 μmol/L PDTC组均有大量变形的细胞及细胞碎片，表现出不同程度的细胞核浓缩、破碎，凋亡现象明显。不同浓度姜黄素及50 μmol/L PDTC分别处理Jurkat细胞24、48、72 h后，不同浓度姜黄素组和PDTC组细胞增殖抑制率均较对照组高（均 P<0.01）。对照组、10 μmol/L姜黄素组、25 μmol/L姜黄素组、50 μmol/L姜黄素组、50 μmol/L PDTC组72 h时细胞凋亡率分别为（4.9±0.1）%、（99.2±0.1）%、（99.9±0）%、（100.0±0）%、（100.0±0）%，差异有统计学意义（ F=2 876 604.40， P<0.001）；不同浓度姜黄素组和50 μmol/L PDTC组的细胞凋亡率均高于对照组，差异均有统计学意义（均 P<0.01）。不同浓度姜黄素组及50 μmol/L PDTC组72 h时S期、G 2期细胞比例均低于对照组，G 1期细胞比例均高于对照组，差异均有统计学意义（均 P<0.01）。与对照组比较，不同浓度姜黄素组及50 μmol/L PDTC组细胞NF-κB p65、NF-κB p50蛋白和mRNA表达均低（均 P<0.01），IκBα、caspase-8、caspase-3蛋白表达均高（均 P<0.01），bcl-2蛋白表达低（ P<0.01），A20蛋白和mRNA表达均高（均 P<0.01）。 结论:姜黄素可有效逆转Jurkat细胞糖皮质激素耐药，促进其凋亡，这可能与姜黄素影响NF-κB通路相关蛋白有关。

目的:探讨 NACK基因表达下调对急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞增殖、凋亡的影响及作用机制。 方法:通过慢病毒转染技术感染Jurkat细胞，使 NACK基因表达下调，应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、Western blot检测 NACK基因的沉默效率；CCK-8法、流式细胞术检测 NACK下调后对Jurkat细胞增殖、凋亡的影响；Western blot检测Notch1信号传导通路下游相关蛋白Hes1、c-Myc的表达情况。 结果:NACK-短发夹RNA(shRNA)通过慢病毒载体成功转染Jurkat细胞后， NACK mRNA及蛋白表达量明显降低( P<0.05)；与阴性对照组和空白对照组比较，CCK-8法显示实验组细胞增殖受到明显抑制[实验组、阴性对照组和空白对照组细胞抑制率分别为(37.27±4.48)%、(4.25±2.10)%和(2.43±1.40)%]( F＝132.640， P<0.05)，流式细胞术检测实验组细胞凋亡明显增加[实验组、阴性对照组和空白对照组细胞凋亡率分别为(26.38±3.03)%、(6.07±2.61)%和(3.40±1.98)%]( F＝90.534， P<0.05)；Western blot结果证实Notch1通路相关蛋白Hes1、c-Myc的表达量较阴性对照组及空白对照组下调，差异有统计学意义( P<0.05)。 结论:靶向沉默 NACK可下调Notch1信号通路相关蛋白的表达，导致Jurkat细胞增殖抑制、细胞凋亡增多，从而发挥其抗T淋巴细胞白血病的作用。

目的:构建一种新的靶向CD123的嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞），为CD123阳性白血病的免疫治疗提供实验参考。方法:通过单克隆筛选技术获得能稳定分泌CD123抗体的杂交瘤细胞株6E11，将杂交瘤细胞扩增后腹腔注射至Balb/c小鼠腹腔内，收集腹水并处理、纯化得到单克隆抗体，测定抗体效价并对其特异性进行验证；RT-PCR法获得轻链和重链可变区序列，并以此为基础利用分子克隆技术构建一种新的靶向CD123嵌合抗原受体，包装病毒后感染T细胞制备CD123 CAR-T细胞，通过功能实验初步探讨6E11 CAR-T细胞体外抗白血病的能力。结果:①获得1株稳定分泌抗人CD123抗体的杂交瘤细胞株6E11并获得其可变区序列。②6E11单克隆抗体对CD123蛋白亲和性高，解离常数（K d值）为2.10 nmol/L，特异性识别CD123阳性细胞且与CD123阴性细胞无交叉反应。③成功构建了CD123 CAR慢病毒载体，感染T细胞后获得了靶向CD123的CAR-T细胞（6E11 CAR-T），感染效率大于60%。④6E11 CAR-T能明显杀伤CD123阳性靶细胞MV4-11，效靶比1∶1时6E11 CAR-T细胞对MV4-11细胞的杀伤比例明显高于Vecor-T细胞[（98.60±1.20）%对（20.28±6.74）%， P<0.001]，但对CD123阴性靶细胞K562没有明显杀伤作用。⑤MV4-11细胞可以显著激活6E11 CAR-T，但对Vecor-T细胞无明显激活作用[（26.33±3.30）%对（1.17±0.06）%， P<0.001]。⑥6E11 CAR-T与MV4-11细胞共培养上清中细胞因子水平均显著高于Vecor-T组[IL-2：（92.90±1.51）pg/ml对（6.05±3.41）pg/ml， P<0.001；TNF-α：（1 407.20±91.95）pg/ml对（7.86±0.85）pg/ml， P<0.001；IFN-γ：（5 614.60±170.17）pg/ml对（8.42±2.70）pg/ml， P<0.001]，但与K562细胞共培养后，两组各细胞因子水平差异无统计学意义。⑦6E11 CAR-T在与CD123阳性急性髓系白血病（AML）原代细胞共培养过程中被显著激活，且能有效杀伤原代AML细胞。 结论:杂交瘤细胞株6E11能稳定分泌高效特异的抗人CD123单克隆抗体，可用于检测表达人CD123的细胞，也能应用在靶向人CD123蛋白的肿瘤免疫治疗中，以6E11 Ig可变区序列为抗原识别区的CD123 CAR-T细胞，具有明确的体外抗白血病活性，为进一步的临床研究奠定了基础。