目的:探讨Alisertib(ALS)对人结直肠癌HT29和Caco-2细胞(来自美国典型菌种保藏中心)的诱导细胞凋亡性程序性死亡的作用及与p53表达状态间的关系。方法:采用人结直肠癌HT29和Caco-2细胞进行实验。对照组用同浓度的二甲基亚砜(DMSO)，实验组用0.1、1.0、5.0 μmol/L ALS处理细胞。噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活力，计算半数抑制浓度(IC 50)；流式细胞术检测细胞的凋亡率；蛋白质印迹法(Western blot)检测细胞凋亡过程中关键调节分子的蛋白表达。应用Prism软件多重比较通过单因素方差分析(ANOVA)，然后进行Tukey的多重比较。 结果:ALS作用于HT29和Caco-2细胞24、48 h后，IC 50值分别为48.4、9.9、89.2和52.1 μmol/L。用1.0、5.0 μmol/L ALS处理HT29和Caco-2细胞，Aurora A激酶(AURKA)的磷酸化(p-AURKA)水平分别减少为对照组的45.6%、6.3%( F＝100.400, P<0.01)和65.7%、30.7%( F＝26.410， P<0.01)。HT29细胞表达p53蛋白，而Caco-2细胞不表达p53蛋白。与对照组比较，1.0、5.0 μmol/L ALS处理HT29和Caco-2细胞后，细胞凋亡率升高为13.4%、14.3%( F＝11.240, P<0.05)和11.8%、10.5%( F＝9.357, P<0.05)。5.0 μmol/L ALS引起HT29细胞的B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(bax)、细胞色素C(Cyt-C)、裂解的半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-3(cleaved Caspase-3)和裂解的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(cleaved PARP)的表达水平分别升高85%( F＝7.289, P<0.05)、1.6倍( F＝9.640, P<0.05)、1.3倍( F＝12.120, P<0.05)、4.3倍( F＝56.320, P<0.05)，B细胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)的表达降低为28%( F＝8.849, P<0.01)。在Caco-2细胞中5.0 μmol/L ALS引起RIP、磷酸化Fas相关死亡域蛋白(p-FADD)和cleaved PARP的表达分别增加1.5倍、83%和1.1倍。 结论:ALS分别通过线粒体途径和死亡受体途径诱导HT29和Caco-2细胞发生凋亡性程序性细胞死亡，与p53蛋白是否表达有关。

目的:通过分析精神分裂症社会隔离饲养模型小鼠杏仁核基因转录水平的改变确定精神分裂症致病基因及相关通路。方法:29只3周龄SPF级C57BL/6J雄性小鼠按照随机数字表法分为对照组(16只)及模型组(13只)，对照组每个透明鼠笼里饲养4只，模型组每个透明鼠笼里饲养1只，每个笼里小鼠可见其周边小鼠，但是无法相互触碰到。2组小鼠均饲养4周，随后1周内完成旷场实验、前脉冲抑制实验及新物体识别实验。实验结束后采用脊椎脱臼法处死小鼠，取杏仁核行转录组测序，通过GO富集分析及KEGG富集分析明确模型组小鼠差异表达基因（DEGs）富集的功能及相关通路。结果:（1）动物实验部分：与对照组小鼠相比，模型组小鼠旷场实验中运动距离显著增加[（1 239.20±106.35） m vs. （1 845.53±143.65） m]，差异有统计学意义（ t=3.464， P=0.002）；实验前5 min在中心区域的活动时间显著减少[（13.15±1.41）s vs. （8.47±1.19） s]，差异有统计学意义（ t=2.464， P=0.020）。与对照组相比，模型组小鼠的78 dB前脉冲抑制缺失[（22.28±1.53）% vs. （14.59±2.76）%]，差异有统计学意义（ t=2.629， P=0.013）；88 dB前脉冲抑制缺失[（32.83±3.39）% vs.（18.44±3.07）%]，差异有统计学意义（ t=3.081， P=0.005）。与对照相比，模型组小鼠测试期新物体识别率显著下降[（80.5±2.2）% vs.（71.0±3.6）%]，差异有统计学意义（ t=2.356， P=0.026）。（2）生信分析部分：共找到96个DEGs，其中表达上调的42个，包含 Th、Crlf1等基因；表达下调的54个，包含 Prkcd等基因。 Th与 Crlf1为正强相关关系（ r=0.940， P=0.018）。GO基因富集分析结果提示DEGs富集在质膜边界细胞投影功能、神经元分化过程、细胞凋亡过程等方向，KEGG富集分析结果提示DEGs富集在WNT信号通路、细胞凋亡通路及酪氨酸代谢通路。蛋白质网络互作分析结果提示Wnt6、Tcf712、Pitx2、Tcf7、Cd4为关键蛋白。 结论:社会隔离饲养模型小鼠杏仁核中 Th、Prkcd、Lrrc74b、Fadd、Wnt6、Ror2、Notum、Tcf7l2等DEGs以及涉及的相关信号通路可能与精神分裂症相关。

目的 探讨新型溴代阻燃剂三-(2,3-二溴丙基)异氰脲酸酯(TBC)对大鼠肝脏的毒性作用,并从死亡受体途径对其作用机制进行研究.方法 先通过急性毒性试验确定TBC的急性毒性为无毒,再将清洁级Wistar大鼠80只(雌雄各半)随机分成对照组和染毒组(0.313、0.625、1.250 g/kg),灌胃染毒28 d.解剖后通过生化检查、血液检查以及肝脏病理学检查探讨TBC对大鼠的肝脏毒性作用.采用Western blot法对TBC诱导死亡受体通路的Caspase-8、FADD、CD95/FAS、DR4、DR5、PARP、TRAIL蛋白表达进行检测,同时对各组间相似性进行分析.结果 大鼠经TBC染毒后淋巴细胞百分率、丙氨酸氨基转移酶、谷草转氨酶随染毒剂量的增加而升高,且与对照组差异有统计学意义(P＜0.05).肝脏病理学结果显示,TBC染毒后大鼠肝脏出现明显损伤及炎症反应,高剂量染毒组出现大面积肝组织坏死.细胞内Caspase-8、FADD、CD95/FAS、DR4、DR5、PARP、TRAIL蛋白随着染毒剂量的增加而升高,呈剂量-效应关系.结论 TBC具有肝毒性,且可通过死亡受体信号通路诱导细胞凋亡.

目的 探讨抑制自噬时,大叶蛇葡萄总黄酮提取物(total flavonoid extract,TFE)对人乳腺癌细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制.方法 针对人宫颈癌细胞Hela、人肺癌细胞A549、人肝癌细胞SMMC-7721、人乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231及人正常肝细胞L-02,采用MTT法优选敏感细胞株;通过TFE与自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methylade-nine,3-MA)联合运用,采用MTT法检测其对敏感细胞增殖的抑制作用;透射电子显微镜及Hoechst 33258单染法观察细胞的形态学变化;Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率的变化;Western blot检测凋亡相关蛋白和通路蛋白(死亡受体途径、线粒体途径、内质网应激途径)的表达水平;免疫荧光法检测线粒体途径关键蛋白Cyt-c表达,并选择自噬激动剂雷帕霉素(rapamycin,RA)进行反向验证.结果 TFE可浓度依赖性抑制人乳腺癌细胞增殖,MCF-7细胞为敏感细胞株,与TFE组相比,TFE+3-MA组在24、48、72 h对MCF-7细胞的抑制率均明显增加(P＜0.01),细胞数量减少、间隙增大,凋亡小体增多,凋亡率升高(P＜0.01),Bax/Bcl-2(P＜0.01)、cleaved caspase-3(P＜0.01)、Cyt-c(P＜0.05)、FADD、cleaved caspase-12的表达量均升高,核内凋亡蛋白Cyt-c表达增加;TFE+RA组荧光减弱,逆转了 TFE诱导的线粒体途径凋亡.结论 TFE能明显抑制人乳腺癌细胞的增殖,抑制自噬时可能通过线粒体途径促进MCF-7细胞凋亡,激活自噬可逆转细胞凋亡.

目的 观察"秩边透水道"针刺对弱精子症模型小鼠生殖功能的影响,并探讨可能作用机制.方法 将42只C57BL/6雄性小鼠随机分成空白组、模型组和针刺组各14只.模型组和针刺组小鼠给予环磷酰胺30 mg/(kg·d)腹腔注射7天建立弱精子症小鼠模型,空白组腹腔注射7天0.9％氯化钠溶液10 ml/(kg·d).造模成功后,针刺组小鼠给予"秩边透水道"针刺,每日 1次,每次20 min,每周6次,共3周;其余两组只进行固定而不针刺.日常观察各组小鼠的一般情况,并记录干预前后体质量变化.干预结束次日每组随机取6只雄鼠检测精子质量以及睾丸、附睾质量并计算相应指数;ELISA法检测血清中睾酮(T)、促卵泡生成素(FSH)、促黄体生成激素(LH)含量;HE染色和TUNEL染色观察睾丸和附睾病理组织形态和细胞凋亡情况;荧光定量PCR法和Western blot法分别检测睾丸组织死亡相关因子(Fas)、Fas相关死亡域蛋白(FADD)、B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)、B淋巴细胞瘤2关联X的蛋白(Bax)和半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)mRNA和蛋白表达变化.将每组剩余的8只雄鼠与处于动情周期的同品系雌鼠进行1∶1合笼,检测合笼后每组小鼠的妊娠率和每胎胚胎数量.结果 与空白组比较,模型组小鼠体重减轻,睾丸质量、睾丸指数、附睾质量和附睾指数下降,精子总数、精子活力和精子活率下降,血清T、FSH和LH含量下降,细胞凋亡率升高,Fas、FADD、Bax和Caspase-3 mRNA和蛋白表达水平提高,Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平降低(P＜0.01),睾丸组织和附睾组织病理形态异常,生精小管排列紊乱,管腔内生精细胞数量减少;合笼后雌鼠的妊娠率和每胎胚胎数量降低(P＜0.01).与模型组比较,针刺组小鼠睾丸质量、睾丸指数、附睾质量、附睾指数、精子总数、精子活力和精子活率均提高,血清T、FSH和LH含量提高,细胞凋亡量降低,Fas、FADD、Bax和Caspase-3 mRNA和蛋白表达水平降低,Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平提高(P＜0.05或P＜0.01),睾丸组织和附睾组织形态改善,生精小管排列紧密,管腔内生精细胞数量增加;合笼后雌鼠的妊娠率和每胎胚胎数量提高(P＜0.01).结论 "秩边透水道"针刺可以改善弱精子症模型小鼠睾丸组织细胞凋亡,提高生殖功能,其机制可能与调节睾丸组织外在膜受体途径(Fas介导的途径)和内在线粒体途径(Bcl-2/Bax调控的途径)的关键因子有关.

[目的]探讨泛凋亡(PANoptosis)对肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)患者预后及免疫微环境的预测价值.[方法]从TCGA数据库下载LUAD样本与正常样本的基因表达谱及临床数据,从已发表的文献中获取PANoptosis相关基因并分析其在肿瘤组和对照组间的差异表达基因.通过单变量Cox分析和LASSO-Cox回归分析构建生存预后模型,将患者按风险评分划为高、低风险组.通过Kaplan-Meier生存曲线和受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线下面积(area under the curve,AUC)评价模型的预测性能,再对模型风险评分进行独立预后分析.GO和KEGG富集分析探索生物功能和潜在的信号通路.采用TIMER数据库ESTIMATE算法综合分析PANoptosis相关基因与免疫微环境相关性.通过qRT-PCR验证PANoptosis预后相关基因在LUAD组织和正常肺组织间的差异表达.[结果]共有15个PANoptosis相关基因在LUAD组和正常组间存在差异性表达,从中筛选出4个PANoptosis预后相关基因(RIPK3、NLRP3、FADD、MLKL).在LASSO-Cox回归模型中,高风险组的生存率低于低风险组(P＜0.001).单变量和多变量Cox分析显示该评分模型是LUAD的独立预后因素(HR=2.179,95％CI:1.347～3.524,P=0.001),而GO和KEGG分析显示差异表达基因主要富集于与免疫相关的通路.高低风险组之间免疫微环境、免疫细胞差异和免疫检查点基因表达差异显著.此外,qRT-PCR实验也证实PANoptosis相关基因FADD(P=0.007)和NLRP3(P＜0.01)在LUAD组和正常组之间表达存在差异.[结论]本研究构建的PANoptosis相关基因的生存预后模型可以预测LUAD患者的预后及免疫微环境.

目的:乳酸堆积是肿瘤微环境(TME)呈酸性的主要原因之一,巨噬细胞是TME中的重要免疫细胞.本研究筛选乳酸调控小鼠腹腔巨噬细胞M2型极化的关键靶点分子,为巨噬细胞相关的肿瘤免疫治疗提供理论依据.方法:提取小鼠源腹腔巨噬细胞,通过流式细胞术检测F4/80+及CD11b+细胞表达量;将巨噬细胞分为2组,分别用0 mmol/L(对照)、20 mmol/L乳酸的培养基处理24 h后收集细胞,qPCR法检测巨噬细胞IL-10、Arg-1、VEGF、HIF-1等基因的相对表达量;利用转录组测序技术筛选对照组和20 mmol/L乳酸组的差异表达基因(|log2(fold change)|>1),对差异表达基因进行GO及KEGG分析,并利用Cytoscape软件将筛选出的差异表达基因构建互作网络图,根据基因互作节点数筛选出Tpt1及Malat1等关键调控基因.分别将Tpt1、Malat1两个关键基因的siRNA转染至巨噬细胞,抑制两个基因的表达,利用qPCR法检测转染后巨噬细胞CD11c、Arg-1、VEGF等基因的相对表达量.结果:获得的小鼠腹腔细胞中F4/80+及CD11b+细胞的表达量均大于90%,表明成功获得高纯度的小鼠腹腔来源巨噬细胞.与对照组相比,经20 mmol/L乳酸处理后,Arg-1、HIF-1、IL-10和VEGF表达量增加,表明乳酸能促进巨噬细胞的M2型极化.转录组学研究结果发现,20 mmol/L乳酸处理24 h后使巨噬细胞的6 295个基因表达发生变化,差异表达基因主要参与细菌防御反应、胞质基因翻译、核糖体生物合成、胎盘发育等生物过程;涉及的信号通路包括MAPK、PI3K-Akt、NOD样受体等.筛选出关键上调差异表达基因Malat1、Tpt1、Fadd、Gm5900、Gipr等.Malat1或Tpt1表达被抑制后,20 mmol/L乳酸均能上调巨噬细胞中CD11c表达,抑制VEGF、Arg-1表达.结论:乳酸可能通过上调Malat1及Tpt1表达进而促进巨噬细胞的M2型极化.

目的 探讨Fas相关死亡结构域(FADD)基因对宫颈癌细胞凋亡和侵袭及NF-κB信号通路的影响.方法 qRT-PCR检测60 例宫颈鳞癌患者的癌组织及配对癌旁组织,人宫颈鳞癌细胞系SiHa及人宫颈上皮永生化细胞系H8 中FADD mRNA水平.将SiHa细胞分为对照组、NC-sh组、FADD-sh组、NC-OE组和FADD-OE组.对照组SiHa细胞正常培养,不进行转染;NC-sh组、FADD-sh组、NC-OE组和FADD-OE组SiHa细胞分别使用Lipofectamine 2000 试剂转染shRNA慢病毒阴性对照(NC-sh)、FADD shRNA慢病毒(FADD-sh)、过表达慢病毒阴性对照(NC-OE)和FADD过表达慢病毒(FADD-OE).通过MTT法和集落形成实验检测细胞增殖.通过Annexin Ⅴ-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡.通过Transwell检测细胞侵袭.通过qRT-PCR检测FADD mRNA水平.通过Western blot检测cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-8、基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP9、核因子(NF)-κB p65 和p-NF-κB p65 的表达水平.结果 与配对癌旁组织相比,宫颈鳞癌组织中FADD mRNA水平降低(t =29.333,P＜0.001).与H8 细胞相比,SiHa细胞中FADD mRNA水平降低(t =27.219,P＜0.001).与Ⅰ-Ⅱ期相比,Ⅲ-Ⅳ期患者癌组织中FADD mRNA水平降低(t =7.727,P＜0.001).与淋巴结未转移患者相比,淋巴结转移患者癌组织中FADD mRNA水平降低(t =7.618,P＜0.001).与NC-sh组比较,FADD-sh组细胞的FADD mRNA和蛋白相对表达量降低(P＜0.05),相对细胞活力和集落数量升高(P＜0.05),细胞凋亡率、cleaved Caspase-3 和cleaved Caspase-8 蛋白相对表达量降低(P＜0.05),侵袭细胞数量、MMP2 和MMP9 蛋白相对表达量升高(P＜0.05),NF-κB p65 相对磷酸化水平升高(P＜0.05).与NC-OE组比较,FADD-OE组细胞的 FADD mRNA 和蛋白相对表达量升高(P＜0.05),相对细胞活力和集落数量降低(P＜0.05),细胞凋亡率、cleaved Caspase-3 和cleaved Caspase-8 蛋白相对表达量升高(P＜0.05),侵袭细胞数量、MMP2 和MMP9 蛋白相对表达量降低(P＜0.05),NF-κB p65 相对磷酸化水平降低(P＜0.05).对照组、NC-sh组和NC-OE组上述指标均差异无统计学意义(P＞0.05).结论 FADD在宫颈癌中下调,并且与TNM分期和淋巴结转移有关,宫颈癌中FADD的表达缺失可能通过激活NF-κB信号通路抑制癌细胞的凋亡并促进侵袭.

目的 研究糖尿病模型小鼠胰腺组织中死亡受体凋亡通路中相关凋亡因子表达的变化.方法 将小鼠分为对照组(control)和模型组(model),2 次腹腔注射四氧嘧啶(120 mg/kg,80 mg/kg),在造模后第3 和7 天,检测血糖;取胰腺组织,苏木精-伊红染色(HE)观察,原位末端标记法(TUNEL)检测凋亡率,RT-qPCR检测肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)、Fas相关死亡域(FADD)、半胱氨酸蛋白酶-8(caspase-8)和半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的mRNA表达量.结果 与对照组比较,模型组小鼠胰腺腺泡细胞出现颗粒变性,毛细血管充血,胰岛体积减小,胰岛内细胞数量减少.与对照组比较,模型组小鼠胰腺内细胞凋亡率明显增多(P＜0.01).另外,与对照组比较,在 3 和 7 天,模型组小鼠胰腺组织内Tnfr1、Fadd、caspase-8 和caspase-3 mRNA表达均显著或极显著的增加(P＜0.05 或P＜0.01).结论 四氧嘧啶能够促进糖尿病模型小鼠胰腺组织中Tnfr1、Fadd、caspase-8和caspase-3 mRNA的高表达,进而诱导了胰腺细胞的凋亡.

在肿瘤治疗中,寻找选择性作用于肿瘤细胞的药物是人们所期待和向往的.前列腺凋亡反应蛋白-4(prostate apoptosis response protein-4,Par-4)作为肿瘤抑制因子,能选择性诱导肿瘤细胞凋亡,且在细胞质和细胞核中均可行使其功能.然而有研究发现,Par-4还可以被分泌到细胞外与细胞表面的GRP78相互作用,引起内质网应激,激活FADD/caspase-8/caspase-3通路导致肿瘤细胞凋亡.Par-4在行使其功能的过程中与其他的蛋白质和抗癌药物相互作用,可以协同诱导肿瘤细胞凋亡,为肿瘤治疗提供新的方法和思路.该文就Par-4如何在细胞内外选择性诱导肿瘤细胞凋亡及其与相关基因和其他抗肿瘤药物相互作用的调控机制进行综述.