目的:探讨钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKII）对离体心肌缺血-再灌注损伤的影响及对细胞凋亡与自噬的作用。方法:选取心电图正常的SPF级雌性SD大鼠（体重250~280 g），Langendorff灌流系统建立成功的离体心肌缺血-再灌注损伤模型共70只，随机分为五组（ n = 14），心脏缺血-再灌注组（IR组）、CaMKII磷酸化激活剂组（IR+异丙肾上腺素组）、CaMKII磷酸化抑制剂类似物组（IR+KN92组）、CaMKII磷酸化抑制剂组（IR+KN93组）、空白对照组（Control组）。采用再灌注末，左心室功能的变化、心肌细胞形态的变化评价心肌损伤程度；原位末端标记(TUNEL)法来检测细胞凋亡指数；蛋白印迹法（Western blot）检测CaMKII、受磷蛋白（PLN）的磷酸化水平（p-CaMKII/CaMKII、p-PLN/PLN）、以及凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3和自噬标记蛋白LC3II/LC3I、Beclin-1、P62的表达水平。 结果:与Control组相比，IR组的大鼠左心室功能降低,心肌纤维形态排列紊乱，凋亡指数增高，p-CaMKII/CaMKII、p-PLN/PLN、Cleaved Caspase-3、Bax/Bcl-2、LC3II/LC3I、Beclin-1表达增多，P62表达减少，凋亡和自噬水平明显升高（均 P < 0.05）。与IR组相比，IR+KN93组的大鼠心肌损伤有明显改善，凋亡指数减少，p-CaMKII/CaMKII、p-PLN/PLN、Cleaved Caspase-3、Bax /Bcl-2、LC3II/LC3I、Beclin-1表达减少，P62表达增多，凋亡和自噬水平明显降低（均 P < 0.05）。IR+异丙肾上腺素组与IR组相比，进一步降低大鼠左心室功能，同时凋亡和自噬水平进一步升高（ P < 0.05），而IR+KN92组大鼠与IR组相比，心肌各指标比较差异无统计学意义（ P > 0.05）。 结论:抑制CaMKII磷酸化通过降低细胞凋亡和自噬进而减轻离体心肌缺血-再灌注损伤。

目的:建立大鼠离体心脏缺血再灌注实验模型并明确其诱导心肌胰岛素抵抗的效果。方法:12只雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠由贵州医科大学实验动物中心提供，按随机数字表法分为两组，正常对照(NC)组(6例)离体心脏持续灌注60 min，缺血再灌注(I/R)组(6例)全心缺血30 min，再灌注30 min，记录心功能指标，检测肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)和心肌肌钙蛋白T(cTnT)含量，苏木精-伊红染色观察心肌组织细胞形态，蛋白质免疫印迹和组织免疫荧光检测葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)的表达和转位情况。组间比较用独立样本 t检验。 结果:I/R组心功能指标[左心室发展压(LVDP)(50.8±5.5) mmHg(1 mmHg＝0.133 kPa)、左心室内压最大上升速率(+dp/dtmax)(2 566.6±358.6) mmHg/s、左心室内压最大下降速率(－dp/dtmax)(1 172.6±121.2) mmHg/s]明显低于NC组[LVDP(79.9±4.0) mmHg、+dp/dtmax(3 587.8±334.5) mmHg/s、－dp/dtmax(2 243.8±252.4) mmHg/s， t＝9.625、4.656、8.556， P<0.05]。I/R组心肌酶[CK-MB(1.018±0.132) ng/ml、cTnT(47.791±3.815) pg/ml]明显高于NC组[CK-MB(0.630±0.080) ng/ml、cTnT(29.036±5.319) pg/ml， t＝5.005、5.731， P<0.05]。与NC组比较，I/R组的心肌组织细胞肿胀明显、间隙增大、排列紊乱、部分心肌纤维中断。I/R组GLUT4膜蛋白(M-GLUT4)的相对表达量(0.234±0.016)显著低于NC组(0.482±0.034， t＝11.420， P<0.05)。 结论:利用Langendorff灌注系统可以成功建立大鼠离体心脏缺血再灌注心肌胰岛素抵抗实验模型。

目的:探讨小窝蛋白(Cav-3)/细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路在吗啡预处理减轻慢性心力衰竭大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用。方法:清洁级健康雄性成年SD大鼠，体重200~250 g，结扎冠状动脉左前降支6周制备慢性心力衰竭模型。取慢性心力衰竭和Langendorff灌注模型制备成功的大鼠心脏36个，采用随机数字表法分为4组( n＝9)：心肌缺血再灌注组(IR组)、吗啡预处理组(MP组)、吗啡预处理+甲基-β-环糊精组(MP+MβCD组)、甲基-β-环糊精对照组(MβCD组)。采用全心停灌30 min再灌注120 min的方法建立离体心脏全心缺血再灌注损伤模型。MP组于平衡灌注15 min后灌注含1 μmol/L吗啡的K-H液进行预处理，灌注5 min后改为K-H液灌注5 min，3个循环共计30 min，处理结束后全心停灌30 min再灌注120 min。MP+MβCD组于吗啡预处理前10 min灌注含200 μmol/L甲基-β-环糊精的K-H液，其余操作同MP组。MβCD组：于全心停灌前40 min灌注含200 μmol/L甲基-β-环糊精的K-H液，其余操作同IR组。于平衡灌注15 min(T 0)、再灌注5 min(T 1)、10 min(T 2)时收集冠状动脉流出液，采用化学比色法检测LDH活性。再灌注120 min时，测定心肌梗死体积(IS)、缺血危险区体积(AAR)，计算IS/AAR；采用Western blot法检测心肌组织Cav-3、ERK1/2、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)表达水平，计算p-ERK1/2/ERK1/2比值。 结果:与IR组比较，MP组IS和IS/AAR降低，冠状动脉流出液LDH活性降低，心肌组织Cav-3表达上调，p-ERK1/2/ERK1/2比值升高( P<0.05)，MβCD组上述指标差异无统计学意义( P>0.05)；与MP组比较，MP+MβCD组IS和IS/AAR升高，冠状动脉流出液LDH活性升高，心肌组织Cav-3表达下调，p-ERK1/2/ERK1/2比值降低( P<0.05)。 结论:吗啡预处理减轻慢性心力衰竭大鼠心肌缺血再灌注损伤的机制可能与激活Cav-3/ERK信号通路有关。

目的 采用非Langendorff方法分离成年小鼠心肌细胞(adult mouse cardiomyocytes,AMCMs),并建立腺病毒转染及缺氧/复氧诱导细胞损伤模型,为应用AMCMs进行心肌缺血体外实验的研究提供便捷、实用、可操作性强的系统方法.方法 应用非Langendorff方法分离AMCMs,观察贴壁后 2、24、48 及 72h细胞的形态,计算存活率,并应用α-actinin免疫荧光染色观察AMCMs完整性;应用腺病毒转染AMCMs,观察并统计转染 36、48 h后的转染效率;通过缺氧 45 min/复氧 24 h,进行碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色,统计PI阳性细胞率以明确缺氧/复氧损伤模型的建立.结果 与AMCMs贴壁后 2h相比,贴壁后 24 和 48h的细胞存活率无显著下降,贴壁后 72h的细胞存活率显著下降;AMCMs 细胞结构完整,可进行腺病毒转染,36 和 48h 转染效率分别可达 82.07%±0.60%和 82.84%±1.18%;缺氧/复氧诱导 AMCMs 可成功建立细胞损伤模型,PI 染色阳性细胞达 42.28%±3.10%.结论 本研究应用非Langendorff方法分离培养的AMCMs,细胞存活率高,并建立腺病毒转染和缺氧/复氧诱导细胞损伤模型,为体外建立AMCMs基因修饰、缺氧/复氧损伤模型提供了简单易行的系统方法.

目的 基于腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)介导的自噬流,探讨电针结合运动预处理对大鼠离体心肌缺血再灌注损伤的保护作用及机制.方法 按照随机数字法将 90 只雄性SD大鼠分成对照组、模型组、电针+运动组、电针+运动+生理盐水组、电针+运动+ Compound C组,每组18 只.各预处理组先接受3 周电针干预及运动干预,然后采用Langendorff灌流系统对除对照组外的其他4 组大鼠进行心肌缺血再灌注损伤造模(缺血40 min,复灌120 min),其中电针+运动+生理盐水组、电针+运动+ Compound C组分别在造模前1～2h腹腔注射生理盐水和Compound C.ELISA法检测心肌组织中ATP含量;透射电镜观察心肌组织超微结构;免疫组化染色观察心肌组织中转录因子EB(TFEB)表达情况;Western blot 法检测心肌组织中AMPK、p-AMPK、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、p-mTOR及LC3Ⅱ、p62 蛋白表达情况.结果 模型组大鼠心肌线粒体中ATP含量明显低于对照组(P<0.05),电针+运动组、电针+运动+生理盐水组大鼠心肌线粒体中ATP含量均明显高于模型组和电针+运动+ Compound C组(P均<0.05).透射电镜观察,模型组大鼠心肌细胞胞质中度水肿,线粒体肿胀呈圆形,基质间隙变宽;电针+运动组、电针+运动+生理盐水组大鼠心肌细胞中见自噬小体与散在分布的溶酶体,胞质轻度水肿,线粒体轻度肿胀;电针+运动+Compound C组大鼠线粒体轻度水肿,嵴密度降低.模型组大鼠心肌组织中TFEB阳性表达较对照组显著增加,电针+运动组、电针+运动+生理盐水组TFEB阳性表达较模型组和电针+运动+Compound C组明显减少.电针+运动组、电针+运动+生理盐水组p-AMPK/AMPK比值与LC3Ⅱ蛋白表达量均明显高于模型组和电针+运动+ Compound C 组(P 均<0.05),p-mTOR/mTOR比值与p62 蛋白表达量均明显低于模型组和电针+运动+ Compound C组(P均<0.05).结论 电针结合运动预处理可通过AMPK信号通路促进自噬流,从而减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤.

Langendorff离体心脏灌流模型技术具有可重复性强、给药方便和技术要求低等特点,常被用于研究心肌缺血再灌注损伤.该模型排除了其他器官系统、神经系统或体液等影响.本文对该技术的步骤、动物的选择、灌流模式、灌注液的选择、检测的指标、缺血方式以及缺血和灌流时间的选择等方面进行了综述和优缺点的评价.

目的 建立大鼠离体心脏缺血再灌注实验模型并明确其诱导心肌胰岛素抵抗的效果.方法 12只雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠由贵州医科大学实验动物中心提供,按随机数字表法分为两组,正常对照(NC)组(6例)离体心脏持续灌注60 min,缺血再灌注(I/R)组(6例)全心缺血30 min,再灌注30 min,记录心功能指标,检测肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)和心肌肌钙蛋白T(cTnT)含量,苏木精-伊红染色观察心肌组织细胞形态,蛋白质免疫印迹和组织免疫荧光检测葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)的表达和转位情况.组间比较用独立样本t检验.结果 I/R组心功能指标[左心室发展压(LVDP)(50.8±5.5)mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)、左心室内压最大上升速率(+dp/dtmax)(2 566.6±358.6)mmHg/s、左心室内压最大下降速率(-dp/dtmax)(1 172.6±121.2)mmHg/s]明显低于 NC 组[LVDP(79.9±4.0)mmHg、+dp/dtmax(3 587.8±334.5)mmHg/s、-dp/dtmax(2 243.8±252.4)mmHg/s,t=9.625、4.656、8.556,P＜0.05].I/R 组心肌酶[CK-MB(1.018± 0.132)ng/ml、cTnT(47.791±3.815)pg/ml]明显高于 NC 组[CK-MB(0.630±0.080)ng/ml、cTnT(29.036±5.319)pg/ml,t=5.005、5.731,P＜0.05].与NC组比较,I/R组的心肌组织细胞肿胀明显、间隙增大、排列紊乱、部分心肌纤维中断.I/R组GLUT4膜蛋白(M-GLUT4)的相对表达量(0.234±0.016)显著低于 NC 组(0.482±0.034,t=11.420,P＜0.05).结论 利用 Langendorff 灌注系统可以成功建立大鼠离体心脏缺血再灌注心肌胰岛素抵抗实验模型.

目的 观察快律宁(KLN)对豚鼠心室肌细胞延迟整流钾电流(IK)及内向整流钾电流(IK1)的影响,探讨KLN抗心律失常的作用机制.方法 Langendorff离体心脏灌流系统灌流消化分离出单个豚鼠心室肌细胞,采用全细胞膜片钳记录方法,依次给予低剂量KLN(2.5 mg/ml)、中剂量KLN(5 mg/ml)、高剂量KLN(10 mg/ml),于细胞外灌流药物5 min后,依次记录各剂量给药后电流值.以正常细胞外液冲洗细胞洗脱药物5 min,记录冲洗后电流值.观察KLN对IK及IK1的影响.结果 KLN可降低IK及其尾电流(IK.tail)的电流幅度,使电流密度-电压关系曲线下移;KLN能显著抑制IKs及IKs,tail,作用呈剂量依赖性.低剂量KLN对IK1无明显作用,中、高剂量KLN可显著降低IK1内向电流;高剂量KLN对IK1外向电流有抑制作用.结论 KLN对IK具有剂量依赖性抑制作用,高剂量KLN可抑制IK1内、外向电流,这可能是其发挥抗心律失常作用的机制之一.

目的:观察抗钠钙交换体(Sodium calcium exchanger,NCX)特异位点124 HNFTAGDLGPSTIVGSAAFNMF145抗体对正常成年大鼠心室肌细胞钙瞬变的影响.方法:利用Langendorff灌流方法,分离得到单个大鼠心室肌细胞;负载荧光染料Fura-2/AM和2%牛血清白蛋白后,利用离子影像分析系统记录激发光为340 nm和380 nm时心室肌细胞成对系列图像,计算钙瞬变峰值(F340/F380)、细胞钙恢复90%时程(TR90)以及钙敏感性(F340/F380与细胞缩短数值的比值).结果:抗NCX特异位点抗体可以增加正常成年大鼠单个心室肌细胞F340/F380,缩短TR90,对钙敏感性无显著影响;尼卡地平和KB-R7943分别预处理心室肌细胞可以抵消大部分抗体对F340/F380和TR90的增加或缩短效应,联合使用二者预处理心室肌细胞后,该抗体对钙瞬变不再有显著影响.结论:抗NCX特异位点124 HNFTAGDLGPSTIVGSAAFNMF145抗体可以增加心室肌细胞钙瞬变峰值,同时缩短细胞钙恢复时程,这种效应主要与其激动L-型Ca2+通道和NCX的作用有关.

目的 建立实验树鼩心肌缺血再灌注离体模型.方法 采用Langendorff离体心脏灌流系统建立实验树鼩心肌缺血再灌注模型,依据不同的停灌和再灌注时间实验分为5组;酶标法测丙氨酸氨基转移酶(ALT),天冬氨酸氨基转移酶(AST)和乳酸脱氢酶(LDH),免疫抑制法测定肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)2,3,5-氯化三苯基四唑染色法(TTC)测定切片梗死面积.结果 心肌酶学指标和梗死面积检测发现,停灌30 min再灌注30 min组和停灌30 min再灌注60 min组灌流液CK-MB,灌流液LDH,组织ALT,组织CK-MB和组织LDH等指标均显著高于其它3组(P<0.05),但两组间差异无统计学意义(P>0.05).心电分析发现,停灌30 min再灌注60 min组心率显著低于持续灌注组,停灌15 min再灌注30 min组和停灌30 min再灌注30 min组(P<0.05),而停灌30 min再灌注30 min组心率与持续灌注组和停灌15 min再灌注30 min组差异无统计学意义(P>0.05),停灌30 min再灌注30 min组的离体心脏平均心率更接近于实验树鼩的生理指标.结论 实验树鼩心肌缺血再灌注离体Langendorff模型构建成功,停灌30 min再灌注30 min模型效果最好.