目的:探讨M1型小胶质细胞源性外泌体（M1-exo）对氧糖剥夺/复氧后神经元损伤的影响，并研究其作用机制。方法:取对数期生长的小鼠小胶质细胞BV2，加入100 μg/L脂多糖（LPS）和20 μg/Lγ-干扰素（IFN-γ）诱导小胶质细胞极化为M1表型，通过蛋白质免疫印迹试验（Western blotting）、实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）、免疫荧光法鉴定M1型小胶质细胞。收取M1型小胶质细胞的上清液，用ExoQuick-TC TM试剂盒提取M1-exo，通过透射电镜及纳米颗粒粒径分析（NTA）观察外泌体形态，采用Western blotting法检测外泌体标记蛋白白细胞分化抗原（CD9、CD63）的表达。将生长良好的小鼠神经母细胞瘤细胞N2a分为6组：C组细胞常规培养；O组氧糖剥夺3 h后复糖复氧24 h制备N2a细胞氧糖剥夺/复氧损伤模型；E组的N2a细胞氧糖剥夺3 h后复糖复氧并与M1-exo共培养24 h；NC组、M组和I组分别构建阴性对照、过表达和敲低微小RNA-20a-5p（miR-20a-5p）的M1-exo，通过qPCR检测转染是否成功。NC组、M组和I组N2a细胞氧糖剥夺3 h后，与转染后的M1-exo共培养24 h后检测各项指标。采用细胞增殖检测试剂（CCK-8）法检测细胞活力，采用流式细胞术检测细胞凋亡，采用qPCR法检测miR-20a-5p表达。 结果:与M0型小胶质细胞相比，M1型小胶质细胞特异性标志物CD32和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）荧光强度及其mRNA和蛋白表达均明显升高〔CD32（荧光强度）：36.919±1.541比3.533±0.351，CD32 mRNA（2 -ΔΔCt）：4.887±0.031比1.003±0.012，CD32/β-actin：2.663±0.219比1.000±0.028；iNOS（荧光强度）：29.513±1.197比7.933±0.378，iNOS mRNA（2 -ΔΔCt）：4.829±0.177比1.000±0.016，iNOS/β-actin：1.991±0.035比1.000±0.045；均 P<0.01〕，证明M1型小胶质细胞被成功激活。电镜下可见M1-exo为圆形或卵圆形囊泡状小体，并有明显膜性结构，直径范围约100 nm。Western blotting结果显示，M1-exo表达特异性CD63和CD9蛋白。与C组比较，O组N2a细胞活力明显下降，细胞凋亡率和miR-20a-5p的表达明显升高〔细胞活力（ A值）：0.540±0.032比1.001±0.014，细胞凋亡率：（19.857±0.910）%比（13.508±0.460）%，miR-20a-5p（2 -ΔΔCt）：5.508±0.291比1.033±0.101，均 P<0.01〕。与O组比较，E组N2a细胞活力明显下降，细胞凋亡率和miR-20a-5p表达进一步升高〔细胞活力（ A值）：0.412±0.029比0.540±0.032，细胞凋亡率：（31.802±0.647）%比（19.857±0.910）%，miR-20a-5p（2 -ΔΔCt）：8.912±0.183比5.508±0.291，均 P<0.01〕，说明M1-exo进一步加重了氧糖剥夺/复氧后N2a细胞的损伤。与E组比较，M组N2a细胞活力明显下降，细胞凋亡率和miR-20a-5p表达明显升高〔细胞活力（ A值）：0.311±0.028比0.412±0.029，细胞凋亡率：（36.343±0.761）%比（31.802±0.647）%，miR-20a-5p（2 -ΔΔCt）：32.348±0.348比8.912±0.183，均 P<0.01〕；而I组N2a细胞活力明显升高，细胞凋亡率和miR-20a-5p表达明显下降〔细胞活力（ A值）：0.498±0.017比0.412±0.029，细胞凋亡率：（26.437±0.793）%比（31.802±0.647）%，miR-20a-5p（2 -ΔΔCt）：6.875±0.219比8.912±0.183，均 P<0.01〕。E组与NC组N2a细胞活力、细胞凋亡率和miR-20a-5p的表达比较差异均无统计学意义。 结论:M1-exo加重氧糖剥夺复氧后神经元的损伤，这一损伤作用可能与其携载的miR-20a-5p有关。

目的 比较脂多糖生物探针法和传统培养法(包括ISO 11731-2017法即"ISO法"、GB/T 18204.5-2013法即"国标法")对水中嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)的检测能力.方法 分别采用脂多糖生物探针法和传统培养法对58份加标水样(其中50份为实际水样加标用于以上两类方法比对测试,8份为纯水加标用于脂多糖生物探针法的方法学性能测试)和50份实际水样进行检测,确定脂多糖生物探针法的检出限、准确度、精密度、特异性和灵敏度,并比较两类方法对50份实际水样加标前的定性结果和50份实际水样加标前后的定量结果.结果 脂多糖生物探针法检出限为1.55 CFU/L,准确度为102.10％～139.29％,精密度为0.14％～1.78％,特异性为95.12％,灵敏度为88.89％.50份实际水样加标前脂多糖生物探针法和国标法两种方法(检出或未检出)的定性结果无统计学差异(P＞0.05);50份实际水样加标前后脂多糖生物探针法定量结果的中位数(M)高于ISO法测定结果,差异具有统计学差异(P＜O.001),两类方法测定结果存在相关(r=0.981).脂多糖生物探针法检出限(1.55 CFU/L)低于ISO法的(15.74 CFU/L),检测时间(2 d)短于ISO法(10 d).结论 与传统培养法相比,脂多糖生物探针法耗时短,检测性能更优.

[目的]布鲁氏菌病(Brucellosis)简称布病,是由布鲁氏菌引起的以感染家畜为主的人畜共患传染病,造成严重的公共卫生问题.目前全世界范围内消除该病的主要方法是扑杀与免疫相结合,所以建立快速准确的诊断方法对防治和清除布病非常必要.本文建立布鲁氏菌病荧光偏振(FPA)抗体检测方法,为布鲁氏菌病(布病)的快速高效诊断提供技术手段.[方法]提纯猪种布鲁氏菌S2株脂多糖O链(OPS),经异硫氰酸荧光素(FITC)标记后作为诊断抗原.通过对样品稀释液、抗原稀释度、反应时间等条件的优化,初步建立了布鲁氏菌荧光偏振诊断方法.用该方法对148份布病阳性血清(其中牛血清70份,羊血清78份)和155份布病阴性血清(其中牛血清82份,羊血清73份)进行检测,确定其敏感性和特异性.按确定的技术参数,制备3批布鲁氏菌FPA抗体检测试剂盒,使用质控阴、阳性血清分别评价试剂盒的批内和批间重复性.用400份临床样本比较本研究开发试剂盒与商品化进口FPA试剂盒的符合率.[结果]使用0.5％蔗糖磷酸缓冲液作为血清样品稀释液;标记抗原的使用浓度为90 μg/mL;最佳反应时间为3-5 min.本检测方法的判定标准为:δmP值＜20时为阴性,δmP值≥20时为阳性.按上述条件建立的FPA检测148份布病阳性血清和155份布病阴性血清,结果敏感性为98.6％,特异性为98.7％.对400份临床样本的比对检测显示,研究建立的FPA方法与进口商品化试剂盒的总符合率为94.0％.[结论]研究建立的布鲁氏菌PFA抗体检测方法具有良好的特异性和敏感性,可作为一种重要的布病诊断快速诊断方法.

目的 监测老年人接种23价肺炎球菌多糖疫苗(pneumococcal capsular polysaccharide vaccine-23,PPV-23)后特异性功能性抗体的水平.方法 选择沪籍60岁以上健康及结核病痊愈老年人接种PPV-23疫苗,采用肺炎链球菌荚膜多糖多型调理吞噬杀菌试验(multi-specificity opsonophagocyitosis killing assay,MOPA)分别对接种前、接种后1个月、6个月的13种血清型(1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F)肺炎球菌的抗体水平进行检测,并对两组人群接种后1个月、6个月的13种血清型OPA抗体水平(GMT)及抗体增长率进行统计学分析.结果 大部分老年人接种PPV-23后1个月、6个月13种血清型的OPA抗体GMT均显著高于接种前(P＜0.05),接种后6个月结核病痊愈者的1、3型与接种前差异无统计学意义(P＞0.05),且接种后1个月与6个月的6A、6B、7F、18C、19F、23F型抗体差异无统计学意义(P＞0.05).接种后1个月13种血清型OPA抗体水平≥2倍增长率均≥60％(除结核病痊愈者1型为37.5％外),且两组人群差异无统计学意义(P＞0.05);除结核病痊愈者1、3型外,两组人群各型别OPA抗体水平≥4倍增长率差异无统计学意义(P＞0.05).接种后6个月13种血清型OPA抗体水平≥2倍增长率在45％以上,且除1型外,两组人群间差异无统计学意义(P＞0.05);除1型、18C型外,两组人群OPA抗体水平≥4倍增长率差异无统计学意义(P＞0.05).结论 健康和结核病痊愈老年人接种PPV-23后可产生针对13种血清型的特异性功能性抗体,且可维持6个月,但结核病痊愈者接种PPV-23后1、3型的OPA抗体水平和持久性明显低于健康老年人.

目的:观察脂多糖诱导早产鼠小胶质细胞和少突胶质前体细胞NgR的表达及变化, 了解NgR表达在TLR-4介导的神经胶质细胞释放炎性细胞因子中的作用. 方法: 采用振荡和差速贴壁法体外纯化培养MG和OPCs, 分别用特异性抗体CD11b和O4做细胞鉴定; 用实时荧光定量PCR检测各组MG、OPCs的NgR和MG的TLR-4基因表达情况, 并用ELISA测各组TNF-α 的含量. 结果: LPS诱导后较其他对照组及处理组MG的TLR-4表达水平和MG、OPCs的NgR表达水平均增高, 差异具有统计学意义 (P ＜ 0.05), 各组MG经LPS诱导后较其对照组及处理组的TNF-α 的含量增高, 差异具有统计学意义 (P ＜ 0.05). 结论:细菌感染使MG和OPCs的NgR表达增高; 脂多糖诱导小胶质细胞表达大量TLR-4需要NgR的介导; TLR-4可能存在上调NgR基因表达的作用.

目的:对铁棍山药蔗糖合成酶(sucrose synthase,SUS)基因的编码区域(coding sequence,CDS)进行克隆和蛋白质结构分析,为该基因的调控机制与山药多糖的合成机制提供理论依据.方法:提取铁棍山药总RNA并反转录为cDNA第一链,根据本实验室铁棍山药基因组数据经注释得到的SUS基因序列设计一对特异性引物,利用基因克隆技术获得SUS基因的编码区域并通过蛋白质预测分析软件分析蛋白质序列特征.结果:克隆得到一个长度2 448 bp的基因序列,具有一个完整的开放阅读框架(open reading frame,ORF),命名为DoSUS1.DoSUS1的分子式为C4209 H6534N1115O1205S23,相对分子质量9 788.32,共815个氨基酸,理论等电点(PI)6.10,消光系数为110 505,脂溶性指数(AI)为94.15,不稳定指数为32.18,平均亲水指数(GRAVY)为-0.225,属于稳定可溶性酸性蛋白质.DoSUS1氨基酸序列存在多个磷酸化位点,不存在跨膜区与信号肽.蛋白质二级结构与三级结构结果显示DoSUS1属于全α类蛋白质.功能域预测结果显示DoS US1有蔗糖合成与糖基转移两个功能域.同源性比对结果显示DoSUS1的氨基酸序列与所比对单子叶植物的氨基酸序列相似性均＞80％.系统进化树显示DoSUS1与单子叶植物的SUS进化关系较近.结论:首次从铁棍山药中克隆出SUS基因的编码序列,并对其蛋白质结构进行了分析,为进一步阐明SUS在山药生长发育和多糖合成机制中的作用奠定了基础.

建立一种结合环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)和微流控芯片技术检测沙门氏菌、大肠杆菌O157、金黄色葡萄球菌三种食源性致病菌的方法,实现对3种致病菌的快速检测.通过比对选取3种致病菌特异性基因、沙门氏菌侵袭蛋白A(hlyA)基因、大肠杆菌O157脂多糖编码(rfbE)基因、金黄色葡萄球菌耐药基因FemA基因作为目的基因,设计LAMP引物,通过实时LAMP筛选合格引物.设计微流控芯片,将引物冻干后固化到芯片上,制成LAMP微流控芯片.选择合适的LAMP反应体系,添加显色剂,加入芯片中,反应结果通过肉眼或仪器判读.使用标准菌株检验芯片的特异性与敏感性,并使用人工污染样品进一步检验其在实际样品检测时的敏感性.结果 表明:制成的LAMP微流控芯片具有较好的特异性,3种致病菌的检测敏感性均可达到100 cfu/ml,可用于食源性致病菌的现场快速检测.

目的 对参与多糖合成途径的茶树尿苷二磷酸-葡萄糖-脱氢酶基因(Camellia sinensis UDP-glucose-dehydrogenase gene,CsUGD)进行克隆、生物信息学分析、组织表达特异性分析及测定茶树不同器官组织多糖含量.方法 通过转录组数据获得茶树同源基因序列.利用ProtParam、TMpred、signalP、NetPhos、SMART、SSPro 4.0等在线软件进行生物信息学分析.VMD 编辑CsUGD 基因蛋白质三维结构;Jalview 软件进行多序列比对;MEGA5.0构建系统进化树.采用qRT-PCR对不同器官组织进行基因表达差异分析,通过蒽酮硫酸比色法测定不同器官的多糖含量.结果 获得茶树CsUGD 基因(MG366591)全长cDNA 序列,该序列全长1 866 bp,编码480个氨基酸.CsUDP 蛋白属于稳定亲水蛋白,不含信号肽,具有跨膜结构,并与柿树亲缘关系最近.荧光定量PCR 显示,CsUGD 在茶树的侧根中表达量最高;蒽酮硫酸比色法测定显示,在侧根中多糖含量最高.结论 首次从茶树中克隆出CsUGD 基因,阐明该基因在茶树生长发育中的重要作用,在茶树多糖合成途径中起到关键作用,为茶树育种并提高茶叶药用价值提供科学依据.

目的:探讨脂多糖(LPS)刺激下的骨髓间充质干细胞(BMSCs)来源的外泌体对小鼠心肌梗死(MI)后的治疗作用.方法:流式成像细胞分析术鉴定BMSCs的表面标记分子,油红O和茜素红染色于镜下观察成骨成脂分化能力.LPS刺激BMSCs 48 h,提取细胞培养上清外泌体,用透射电镜和粒度分析仪捕捉其形态和粒径大小,流式细胞术和Western blot检测特异性表面标记分子及蛋白表达.建构小鼠MI模型并予以外泌体心脏局部注射,利用心脏超声、组织病理切片和PCR评价治疗结果.结果:分离的BMSCs表达CD29、CD44、CD90、CD73、CD105,未表达HLA-DR、CD14、CD34、CD45,具有成骨成脂分化能力.Western blot检测到外泌体表达Alix、HSP70、Flo-tillin-1蛋白,流式成像仪检测到外泌体膜表面的CD63、CD9和CD81标记分子,粒径众数为69.2 nm.LPS刺激下BMSCs产生的外泌体注射小鼠心脏后,与PBS注射的MI对照组比较,心脏超声评价7天和28天的射血分数(EF)和短轴缩短率(FS)都显著增大(P<0.01,P<0.05),在第28天的舒张末期容积(LVEDV)和收缩末期容积(LVESV)均显著减小(P<0.05),Masson染色显示纤维化面积减小(P<0.01),PCR检测到炎症因子IL-6、IL-1β、转化生长因子β(TGF-β)和趋附因子CCL2表达减少,CX3 CL1表达增多,术后第14天最为明显.结论:LPS刺激的BMSCs来源外泌体可以改善小鼠MI后心肌收缩功能和纤维化,降低炎症因子表达量.

目的 制备甲型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphiA,SPA)O特异多糖(O-specific polysaccharide,OSP)-霍乱毒素B亚单位(cholera toxin B subunit,CTB)结合疫苗,并初步探讨其理化及生物学特性.方法 SPA OSP多糖原液(简称OSP多糖)经溴化氰活化,己二酰肼(ADH)衍化,在碳二亚胺(EDAC)作用下与CTB偶联,结合物经Sepharose4FF柱纯化,获得多糖-蛋白结合物,对其理化指标、血清特异性、免疫原性及血清体外杀菌力进行检测.结果 制备的SPA OSP-CTB结合物(简称OSP-CTB结合物)衍化度为(2.63±0.13)％、多糖回收率为(74±0.2)％;鉴别试验显示OSP-CTB结合物与SPA O诊断血清、CTB抗体均有阳性沉淀线产生;免疫小鼠血清中OSP-CTB结合物抗体滴度显著增长,阳转率达100％,血清体外杀菌抗体滴度为1∶64.结论 用溴化氰活化多糖制备的SPA OSP-CTB结合物具有良好免疫原性,可进一步进行疫苗研发.