目的:原核表达淋病奈瑟球菌MetQ蛋白，采用鼻腔免疫途径初步评估MetQ蛋白的免疫保护效果。方法:利用基因重组技术构建pCold TF-metQ- E.coli BL21表达菌株，并进行MetQ蛋白的表达纯化。将6 ~ 8周龄BALB/c雌性小鼠随机分两组，每组6只，MetQ组：MetQ蛋白+霍乱毒素B亚单位（CTB）佐剂等比例混匀后对小鼠进行鼻腔滴注，10 μg/只；磷酸盐缓冲液（PBS）组：鼻腔滴注等比例、等剂量的PBS + CTB佐剂。酶联免疫吸附试验（ELISA）检测MetQ组末次免疫后3只小鼠的血清及阴道分泌物中的抗体效价。免疫印迹分析MetQ在不同淋病奈瑟球菌中的表达情况。间接ELISA分析MetQ抗血清与全菌抗原的结合能力。评估MetQ抗血清对淋病奈瑟球菌的杀菌活性以及对ME-180细胞的黏附抑制作用。计量资料以 ± s表示，不同处理组间比较采用 t检验。 结果:成功表达去除信号肽的MetQ蛋白。MetQ组小鼠经鼻腔免疫后血清能检测到特异性IgG、IgG1、IgG2a、IgA抗体，抗体滴度分别达1 × 10 7、1 × 10 5、2 × 10 4、1 × 10 2，阴道分泌物能检测到特异性IgG、IgA抗体，抗体滴度分别达1 × 10 3和1 × 10 2。免疫印迹结果显示，MetQ蛋白在8株淋病奈瑟球菌中均有表达。间接ELISA结果显示，MetQ抗血清与淋病奈瑟球菌全菌抗原结合能力为20。血清杀菌力实验结果显示，与无血清对照组（100%）相比，MetQ抗血清的有效杀菌滴度可达1∶320（淋病奈瑟球菌存活率：46.33% ± 6.67%， t = 8.05， P = 0.001），MetQ抗血清稀释1∶160、1∶640时，淋病奈瑟球菌存活率分别为22.01% ± 6.80%（ t = 11.47， P <0.001）、84.55% ± 6.99%（ t = 2.21， P > 0.05）。黏附抑制实验结果显示，与无血清对照组（100%）相比，MetQ抗血清稀释1∶20、1∶40、1∶80能抑制淋病奈瑟球菌对ME-180细胞的黏附作用（淋病奈瑟球菌黏附率= 17.25%、28.23%、54.51%， t = 48.44、31.88、7.29，均 P<0.05）。 结论:MetQ蛋白在不同淋病奈瑟球菌中均有表达，经鼻腔免疫小鼠后能在血清及阴道分泌物中检测到高效价的特异性抗体。MetQ抗血清与淋病奈瑟球菌有较好的亲和性，并具有较好的血清杀菌活性及抗体黏附抑制作用，是一种有潜力的淋病奈瑟球菌疫苗候选蛋白。

目的:探索基于不同黏膜佐剂的艰难梭菌类毒素B( Clostridium difficile toxoid B，CdtB)疫苗的微针经皮免疫效果，为艰难梭菌感染的防治提供思路。 方法:纯化的艰难梭菌B毒素(TcdB)经甲醛脱毒制备成CdtB疫苗，采用不同剂量的疫苗单独或加入黏膜佐剂的方法，于0 d、7 d、14 d、28 d、42 d微针经皮免疫雌性BALB/c小鼠，定期检测小鼠特异性血清IgG和粪便中IgA的效价水平变化，通过细胞中和试验和艰难梭菌人工感染免疫小鼠的方法来评价疫苗的免疫保护效果。结果:(1)CdtB疫苗单独微针免疫小鼠后，随着剂量与免疫次数的增加，产生了较好的血清特异性抗体IgG，粪便中也出现较高水平的IgA；(2)用含有热不稳定肠毒素(LT)佐剂、霍乱毒素B亚单位(CTB)佐剂的CdtB微针免疫小鼠，各组的血清特异性IgG效价趋势随着免疫剂量增加而提高，含有LT佐剂的免疫组效价变化趋势明显较好；与不加佐剂组比较，各组粪便中特异性IgA效价抗体水平变化趋势差异有统计学意义，但佐剂效应不明显；(3)分别用10 μg CdtB单独微针免疫小鼠和腹腔注射小鼠，虽然微针免疫与腹腔注射后小鼠血清IgG效价差别不大，但微针免疫可明显提高粪便中特异性IgA水平；(4)细胞中和试验和小鼠攻毒保护试验结果说明CdtB疫苗微针免疫可产生一定的保护效力。结论:CdtB疫苗微针经皮免疫小鼠的黏膜免疫效果较好，黏膜佐剂LT和CTB对CdtB疫苗的微针经皮免疫的佐剂效应不显著。

目的 为了研究藏猪致病性大肠杆菌疫苗以及评价其免疫保护情况.方法 从病死藏猪体内分离致病性大肠杆菌,经生化及分子分型鉴定;用临床菌株经培养离心,收集菌体,灭活后,用生理盐水洗涤后,离心收集菌体,用生理盐水调整细菌浓度作为疫苗原液,佐剂疫苗在疫苗原液中加入重组霍乱毒素B亚单位蛋白,最后在疫苗原液中加入甘露糖,分装后冻干为不同组分的疫苗.用KM小鼠,分口服和肌注2个免疫途径,再按高、低2个剂量的佐剂疫苗和不合佐剂的疫苗结合每个免疫途径分4组,其中高剂量为9.0×1010 CFU/ml、低剂量为9.0×106 CFU/ml,对照组接种生理盐水,分别于0、14、12、42 d免疫后于不同时间检测特异抗体,免疫后用2倍LD50的临床菌株攻击.结果 小鼠免疫后,肌注组高剂量含佐剂组与高剂量不含佐剂组免疫效果相当,低剂量含佐剂组比不含佐剂组免疫效果好;口服组无论是高、低剂量含佐剂组免疫效果均好于高、低剂量不含佐剂组,且高剂量免疫效果好于低剂量免疫效果.从免疫次数看,无论是肌注还是口服组免疫4次的抗体水平明显好于免疫1、2、3次的抗体水平.结论 藏猪致病性大肠杆菌佐剂疫苗能刺激小鼠产生特异抗体,对临床致病性大肠杆菌攻击具有很好保护性,特别是口服高剂量含佐剂疫苗对致病性大肠杆菌攻击可达到100％保护,这对研究方便、可行的预防藏区仔猪腹泻的新疫苗提供了科学依据.

目的 探讨靶向损毁心交感神经元(targeted ablation of cardiac sympathetic neurons,TACSN)对心肌梗死(MI)后心室电生理性质的影响.方法 使用随机数字表法将38只成年雄性杂种犬随机分为:假手术组(8只)、MI组(15只)、MI+TACSN组(15只).通过微导管在前降支内注射明胶海绵颗粒栓塞剂构建MI模型.MI+TACSN组在术后1周进行左侧星状神经节(LSG)内注射霍乱毒素B亚单位(CTB)与肥皂草素(SAP)的轭合物CTB-SAP损毁心交感神经元.术后5周,测量各组犬梗死周边区、正常区、左心室基底部、右心室心尖部、右心室中部及右心室基底部的有效不应期(ERP)、动作电位时限(APD)、APD回复性质、ADP交替周长.结果 与MI组相比TACSN显著延长MI后QTc间期[(387.13± 16.29) ms对(361.58±23.65)ms,P＜0.05],减少Tpeak-Tend[(51.38±7.41) ms对(66.75±7.97)ms,P＜0.05],改善心率变异性;延长心室各个部位ERP、动作电位复极完成90％所需时间(APD90),减少其离散度(0.040±0.019对0.077±0.025,P＜0.05;0.031±0.012对0.062±0.015,P＜0.05);降低梗死周边区APD回复曲线的最大斜率(Smax),减少其离散度(0.071±0.022对0224±0.079,P＜0.05);降低梗死周边区APD交替周长.结论 TACSN显著改善MI后心室电生理性质,可能是防治MI后恶性室性心律失常的新策略.

目的 探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血B淋巴细胞脂筏表达及糖皮质激素对其的影响.方法 用霍乱毒素B亚单位(CTB)对B细胞脂筏染色,采用流式细胞仪检测SLE患者(SLE组)及健康对照者(健康对照组)外周血B细胞亚型(CD5)及脂筏的表达.分离B细胞,地塞米松(DEX)干预培养活动期SLE患者B细胞1h,流式细胞仪及共聚焦显微镜检测B细胞脂筏及其调控蛋白F－actin.同时记录受试患者的临床资料.结果 SLE组外周血B细胞脂筏表达较健康对照组明显增高,活动期 SLE组高于缓解期SLE组(P均＜0.01).与健康对照组对比,CD5 +B细胞比例未见异常,但SLE组CD5 +B细胞脂筏表达增多.活动期SLE患者脂筏呈荧光强度增加及异常聚集,F－actin表达下调.同时,B细胞脂筏表达率与狼疮活动积分(SLEDAI)呈正相关.地塞米松干预后,B细胞脂筏表达率及荧光强度均明显下降(P均＜0.05),伴随着F－actin表达的增加.结论 脂筏异常表达和分布可能对B细胞过度活化具有重要作用,糖皮质激素对活动期SLE B细胞脂筏的表达存在一定的下调作用.

儿童和婴幼儿接种口服肠道疾病疫苗后,免疫应答情况会受到多种因素的影响,如年龄、接种疫苗前曾接触( 感染) 过相关微生物、母乳喂养等.本项研究旨在通过不同临床样本,确定最佳时间点,评估口服肠道疫苗的免疫应答状况.应答状况的确定,是通过检测接种后不同天数的抗体分泌细胞( ASC) 应答和粪便抗体应答来完成,所用疫苗为一种已获批的模式疫苗———口服霍乱疫苗Dukoral,其中包含重组霍乱毒素B 亚单位( rCTB) 和灭活霍乱弧菌菌体.

目的:探索“肾俞”穴与肾上腺相关感觉、交感和运动神经元的分布特征,揭示“肾俞”穴与肾上腺之间的神经解剖学联系.方法:以6只正常SD大鼠作为实验对象,将Alexa荧光素488结合霍乱毒素亚单位B(AF 488-CTB)注射在大鼠第2腰椎(L)左侧相当于人体肾俞穴的位置,将Alexa荧光素594结合霍乱毒素亚单位B(AF 594-CTB)注入肾上腺实质.3d后灌流固定,用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜对脊神经节、交感神经链和脊髓标记到的神经元进行观察.结果:被AF 488-CTB和AF 594-CTB标记的神经元均出现在相应神经组织的左侧,与大鼠“肾俞”穴区和肾上腺相关的感觉神经元主要分布于胸(T) 10至L2节段脊神经节,并分别集中在T 12-T 13和T 11-T 12脊神经节中,T 12-L 1脊神经节中分布有少量的AF 488/594-CTB双标记神经元.在腰部交感神经链仅观察到由AF 488-CTB和AF 594-CTB各自标记的交感节后神经元,而在T 11-T 13节段脊髓侧角中只有AF 594-CTB标记的交感节前神经元.在颈(C)7-C 8以及T 11-L1节段脊髓前角观察到AF 488-CTB标记的运动神经元.结论:大鼠“肾俞”穴区和肾上腺在感觉和交感神经支配方面存在节段性联系,这种联系可能是针刺“肾俞”穴调节肾上腺功能的神经解剖学途径.

触脑脊液神经元(cerebrospinal fluid-contacting neurons,CSF-cNs)是一种分布于脑室、中央管、脑室周器及脑实质等处与脑脊液接触的特殊神经元.根据分布位置不同可将CSF-cNs分为室管膜上、室管膜下和远位CSF-eNs三类,不同部位的CSF-cNs分泌不同的神经递质.以往研究CSF-cNs多采用脑室注射辣根过氧化物酶标记的霍乱毒素B亚单位(cholera toxin subunit B labeled with horseradish peroxidase,CB-HRP)进行逆行追踪,通过扫描电镜观察CSF-cNs形态结构.随着CSF-eNs的标志物多囊肾疾病蛋白2-样1离子通道(polycystin kidney disease 2-like 1,PKD2L1)的发现,目前多采用特异性抗体进行免疫组织化学染色进行标记.近年来对CSF-cNs的研究逐渐深入,发现其在神经体液调节中发挥重要作用,亦与视觉、睡眠、疼痛、抑郁症等有密切联系.本文对CSF-cNs目前的研究进展做一综述,有助于加深对其形态及功能的理解,有望为研究神经系统调节机体的复杂机制开拓新思路.

通过基因工程方法,将含霍乱毒素B亚单位(CTB)和前列腺特异性膜抗原(PSMA)表位肽的重组质粒pET28a-CTB-PSMA624-632,转化表达宿主菌BL21 (DE3).CTB蛋白的表达有利于开发粘膜佐剂和霍乱弧菌基因工程疫苗,同时抗原肽疫苗也是肿瘤免疫治疗的理想候选.本研究采用正交实验法,优化条件以增加大肠杆菌中CTB-PSMA624-632蛋白的表达量.选取了5个单因素作为考察因子,分别为:预诱导时间、诱导时间、诱导温度、IPTG浓度、诱导转速.先做了4水平的实验L16(45).根据极差分析的数据对影响较大的3个因素又做了细调型的3水平实验L9(33).结果表明,在早期指数生长期的诱导能得到相对高水平的包涵体形式的CTB-PSMA624-632蛋白,并且此蛋白的表达随着诱导温度升高到37℃而逐渐增加;相比于使用正常浓度的IPTG诱导得到的蛋白表达量,用100 μmol/L诱导足以诱导蛋白的表达,这比通常使用的IPTG浓度小10倍;此外,诱导时间5h与7h对蛋白的表达量差距甚微,因此选定较短时间的5h,240 r/min的诱导转速也被认为是能诱导目的蛋白CTB-PSMA624-632具有高表达量的最优条件.

目的 探讨侧脑室注射霍乱毒素B亚单位(CTB)对小鼠免疫细胞及细胞因子的影响.方法 C57雌性小鼠侧脑室注射CTB,运用流式细胞术检测外周血免疫细胞亚群变化;流式微球捕获芯片技术(CBA)检测血清中细胞因子及趋化因子的变化.结果 CTB能够明显升高单核巨噬细胞、CD4+T细胞及B细胞的比例;炎症因子γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-9(IL-9)及趋化因子巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)、巨噬细胞炎性蛋白-1β(MIP-1β)、B淋巴细胞趋化因子(BLC)、γ干扰素诱导的单核因子(Mig)、调节活化正常T细胞表达与分泌的趋化因子(RANTES)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)也相应升高.结论 侧脑室注射CTB能够明显改变小鼠免疫应答状态.