目的:研究转录调控因子OmpR在创伤弧菌中致病相关的生物学功能及分子机制。方法:通过基因无痕敲除技术构建创伤弧菌 ompR基因敲除株(Δ ompR)。通过生长曲线测定法检测不同渗透压下菌株的耐受力，细菌泳动试验检测运动性，结晶紫染色试验检测细菌生物膜形成能力，菌落计数法测定创伤弧菌Δ ompR株黏附细胞的变化，乳酸脱氢酶释放法测定创伤弧菌Δ ompR株对细胞毒性的变化，以明确Δ ompR株的致病性相关生物学表型；实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)法检测创伤弧菌Δ ompR株和野生株中毒力相关靶基因 ompN、 ompU、 ompA、 hcp2的mRNA水平变化。 结果:成功构建创伤弧菌Δ ompR株。与野生株相比，Δ ompR株在高渗透压培养基中生长缓慢，生物膜形成能力减弱，细菌运动性未有明显差异，Δ ompR株对细胞的黏附率和毒性显著低于野生株。Δ ompR株中渗透压调节及生物膜形成相关 ompN基因mRNA水平显著下调( P<0.05)，其他靶基因mRNA水平无明显变化。 结论:OmpR参与调控创伤弧菌高渗透压环境下生长、生物膜形成、对细胞的黏附及毒性。

[背景]植物根部存在大量对植物生长有促进或对病原菌有拮抗作用的有益细菌,是当前农业微生物研究的热点之一.其中,绿针假单胞菌HT66是一株可高效合成吩嗪-1-甲酰胺(PCN)的环境友好型生防菌株.[目的]探究在绿针假单胞菌HT66中ompR基因的生理功能,以及其对菌株生防作用的影响.[方法]通过基因无痕敲除的方法构建HT66菌株的ompR基因缺失突变株,对比研究突变株与野生株在生长速率、渗透压感应、生物膜的合成、pH耐受性、群集运动和PCN产量的变化.[结果]与野生株相比,ompR基因缺失突变株的细胞生物量微量减少,生物膜的合成减少31.5％,群集运动以及对渗透压和pH的耐受性明显下降,但是其PCN产量较野生株提高了57.8％.[结论]在HT66菌株中,ompR基因对其运动性、环境耐受性和生理生防功能均有一定程度的调控作用.本研究丰富了绿针假单胞菌的代谢通路,此报道将对后续PCN合成机制的研究和应用提供一定的理论依据.

目的:研究OmpR对伤寒沙门菌侵袭力的影响及相关分子机制.方法:利用空载体对照株(WT-pBAD33)、ompR缺陷株(ΔompR-pBAD33)和ompR回补株(C-ΔompR)进行HeLa细胞侵袭实验,探究伤寒沙门菌OmpR对于He-La细胞侵袭力的影响.进一步用荧光实时定量PCR(qRT-PCR)、凝胶阻滞实验(EMSA)分析伤寒沙门菌OmpR对侵袭相关基因iagA、invF、prgH的调控作用.结果:成功制备伤寒沙门菌C-ΔompR.在HeLa细胞侵袭实验中,ΔompR-pBAD33侵袭力显著低于WT-pBAD33(P<0.01),而C-ΔompR侵袭能力较ΔompR-pBAD33明显升高(P<0.01);qRT-PCR结果显示,ΔompR-pBAD33中侵袭相关基因iagA、invF、prgH的转录水平较WT-pBAD33明显下降(P<0.01);EM-SA结果表明,OmpR可直接与prgH基因启动子区域结合,与iagA和invF基因启动子区域未有结合.结论:OmpR通过直接调节prgH和间接调节iagA、invF增加侵袭相关基因的表达,从而增强伤寒沙门菌对上皮细胞的侵袭力.

探究荧光假单胞菌2P24中OmpR家族转录因子RstA的功能,明确其对EmhABC外排泵的调控作用及机制.利用共适应分析预测RstA的潜在功能;采用同源重组技术构建rstA、emhABC基因缺失菌株 ΔrstA和 ΔemhABC,检测野生型、ΔrstA、ΔemhABC对多种抗生素的敏感性;通过qRT-PCR和 β-半乳糖苷酶实验检测emhABC在野生型和 ΔrstA菌株中的转录、表达水平;表达纯化His-RstA蛋白并经凝胶阻滞实验检测RstA蛋白与emhABC基因启动子区域的结合活性.结果显示,RstA同EmhABC存在共适应性,并预测RstA与多种抗生素胁迫环境的适应相关;ΔrstA和 ΔemhABC对多种抗生素耐受性下降;与野生株相比,突变株 ΔrstA中emhABC的转录、表达水平均下降超过3倍;成功表达纯化His-RstA蛋白,经凝胶阻滞实验显示重组His-RstA蛋白可与emhABC基因启动子区域特异性结合.OmpR家族转录因子RstA通过结合在emhABC上游启动子区域正向调控EmhABC的表达,并影响荧光假单胞菌2P24的多重耐药性.

应用转录组测序技术(RNA-seq)筛选鼠伤寒沙门菌baeSR和acrB相关的靶基因,为鼠伤寒沙门菌耐药机制的深入研究奠定基础.采用RNA-seq技术分析baeSR和acrB基因缺失后表达量变化的相关耐药基因,通过GO富集和KEGG通路探索其主要功能,qRT-PCR验证部分差异基因.以|log2(Fold Change)|>1且q value<0.005为条件,其中以CR△acrB和CR为比较组,共筛选到1320个差异表达基因,894个下调,426个上调;以CR△baeSR△acrB和CR为比较组,共筛选到1377个差异表达基因,972个下调,405个上调.GO富集分类结果显示差异基因主要集中在跨膜运输、细胞黏附、纤毛或鞭毛运动等功能;KEGG数据库显示,差异基因主要富集在代谢途径、ABC转运系统、双组份信号转导系统、鞭毛组装、β-内酰胺抗性等通路.其中,ompR、csgD、fliA、fliG可通过调节细菌生物膜形成能力调控其对多种抗生素的耐药性;emrA、mdtC、yejE属于外排泵相关基因,可介导细菌对黏菌素、新生霉素等的耐药性;STM3031可赋予沙门菌头孢曲松抗性;pmrF可参与调节细菌对多粘菌素的抗性.鼠伤寒沙门菌acrB和baeSR基因缺失可影响相关耐药基因的表达.

目的:探讨伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Typhi,S.Typhi)在不同生长时期和不同应激条件下非编码RNA ArpH的表达水平,以及双组分调节系统和氧应激调节因子对ArpH的调控作用.方法:利用RNA印迹、qRT-PCR分析伤寒沙门菌在不同生长期ArpH的表达;利用qRT-PCR分析伤寒沙门菌在酸、氧、高渗和热等不同应激环境下ArpH的表达;利用qRT-PCR分析伤寒沙门菌双组分调节系统基因(ompR、rcsB)和氧应激调节因子基因(oxyR)对ArpH表达的影响.结果:ArpH在伤寒沙门菌的对数晚期表达量最高,在从对数早期开始到达稳态期的转变中,其表达量逐渐增加,而进入稳态期后明显回落;ArpH表达水平在酸应激下明显下降,氧应激下明显增高,而高渗应激和42℃热应激下ArpH的表达无显著变化;当ompR、rcsB和oxyR基因缺失时,ArpH表达量均明显下降.结论:ArpH参与伤寒沙门菌对酸、氧应激的调节;伤寒沙门菌双组分调节系统OmpR、RcsB和氧应激调节因子OxyR对ArpH均有正向调控作用.

目的:研究OmpR对伤寒沙门菌巨噬细胞内生存能力的影响及相关分子机制.方法:利用空载体对照株(WT-pBAD33)、ompR缺陷株(ΔompR-pBAD33)和ompR回补株(C-ΔompR)进行巨噬细胞THP-1胞内生存能力实验,探究伤寒沙门菌OmpR对于巨噬细胞内生存能力的影响.进一步用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、β-半乳糖苷酶活性、凝胶阻滞实验(EMSA)分析伤寒沙门菌OmpR对ssrA、ssrB和spiC的调控作用.结果:ΔompR-pBAD33巨噬细胞内生存能力显著低于WT-pBAD33,C-ΔompR部分恢复了其生存能力;qRT-PCR和β-半乳糖苷酶活性实验结果表明,ΔompR-pBAD33中巨噬细胞内生存相关基因ssrA、ssrB和spiC的转录水平较WT-pBAD33明显下降;体外表达纯化His-OmpR蛋白后进行的EMSA表明,OmpR可直接与ssrA、ssrB和spiC基因启动子区域结合.结论:OmpR通过直接调节巨噬细胞内生存相关基因ssrA、ssrB和spiC的表达,从而增强伤寒沙门菌巨噬细胞内生存能力.

目的 调查脊髓损伤患者致病性大肠埃希菌分子分型、流行病学和毒力特征.方法 选取2017年1月-2019年12月入院治疗的脊髓损伤合并泌尿系感染患者86例,共分离、鉴定出致病性大肠埃希菌56株,进行多位点序列分型和药敏试验,采用多重聚合酶链反应(PCR)方法检测毒力因子基因和超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)情况.结果 86例脊髓损伤合并泌尿系感染患者共检出病原菌105株,前3位分别为大肠埃希菌53.33％、肺炎克雷伯菌16.19％、铜绿假单胞菌8.57％.大肠埃希菌对头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星、亚胺培南及美罗培南耐药性较低,均<15％,但对头孢他啶、头孢呋辛、头孢唑林、哌拉西林、环丙沙星、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦及磺胺甲噁唑/甲氧苄啶耐药性较高,均>50％.56株致病性大肠埃希菌共鉴定出24个ST分子分型,其中前5位ST型分别为ST131、ST1193、ST405、ST38、ST648;毒力因子基因dsdA、tonB、fimH、degP、ompR检出率较高,均>80％,而ireA、neuC、fliC在致病性大肠埃希菌中检出率较低,均<25％;大肠埃希菌中产ESBLs菌株检出44株,检出率为78.57％,其中仅携带有1种基因型有40株(90.91％),以blaCTX-M-14检出率最高(54.55％).结论 脊髓损伤患者致病性大肠埃希菌以ST131分子分型流行,具有较强的耐药性,且携带有多种毒力因子基因,临床应加强医院感染监测与隔离防护措施,阻碍耐药性大肠埃希菌的传播.

目的 分析尿道致病性大肠杆菌(UPEC)临床分离菌株的种系分型、毒力基因型及生物被膜形成能力.方法 采集临床尿路感染患者尿样进行细菌培养,对菌落计数大于105 CFU/mL的样品再进行挑选,将选出的疑似大肠杆菌的菌落用微生物及蛋白快速鉴定质谱仪(MALDI Biotyper)鉴定出UPEC分离株.利用多重聚合酶链反应(PCR)检测UPEC分离株种系分型基因chuA、yjaA以及DNA片段TSPE4.C2;利用PCR检测UPEC分离株中9种毒力基因(fimH、tonB、ireA、fyuA、cnf-1、vat、hlyD、ompR和phoU)的分布情况;通过结晶紫染色法定量检测UPEC分离株生物被膜形成能力.结果 共选取UPEC分离株42株,其种系分型以B2型和D型为主,分别占40.5％和31.0％.对9种毒力基因进行检测发现,Ⅰ型菌毛编码基因fimH检出率最高,为92.9％;摄铁相关基因tonB、ireA和fyuA的检出率分别为90.5％、66.7％和76.2％;受检的3种毒素相关基因中,编码细胞坏死因子的cnf-1基因检出率最高(52.4％),溶血素基因hlyD和空泡化毒素基因vat的检出率分别为21.4％和28.6％;其余毒力基因ompR和phoU的检出率均低于30.0％.所有受检菌株均能形成生物被膜,其中16株(占38.1％)具有强生物被膜形成能力,15株(占35.7％)具有中等生物被膜形成能力,其余11株菌株具有弱生物被膜形成能力.进一步分析发现,强生物被膜形成菌株大多属于B2型,且其携带毒力基因数量高于弱生物被膜菌株,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 UPEC临床分离株生物被膜形成能力与其种系分型和毒力基因分布具有一定关联性,进一步了解UPEC临床分离株的生物学特征尤其是生物被膜形成能力和毒力基因分布情况,可为尿路感染防控提供重要参考依据.

[目的]探究OmpR在副溶血弧菌生物学特性和致病性中发挥的作用.[方法]利用同源重组技术构建了副溶血弧菌ompR基因缺失株(ΔompR)和互补株(CΔompR),分析各菌株的生长特性、运动性和生物被膜形成能力的差异;比较各菌株对细胞黏附、细胞毒性和小鼠致病性的影响.[结果]ompR基因缺失对副溶血弧菌的生长特性、运动性以及细胞毒性无显著影响.但与野生株相比,ΔompR的生物被膜的形成能力显著降低;感染ΔompR的小鼠存活率升高了 25％,病变程度更低;ΔompR在小鼠心脏、肝脏和肾脏中的载菌量显著低于野生株,互补株毒力基本恢复至野生株水平.[结论]OmpR参与副溶血弧菌生物被膜形成和致病过程,是副溶血弧菌潜在的毒力因子.