目的:对飞行时间质谱多基因检测平台的检测性能进行验证，建立基于飞行时间质谱多基因检测平台的性能验证研究方案。方法:选择2017年9月至2018年10月来自中国医学科学院阜外医院已测部分心血管用药相关基因位点的DNA标本998例和全血标本20例，其中男性512例，女性506例。18~30岁280例，31~64岁442例，≥65岁296例。用飞行时间质谱法对998份DNA标本心血管用药相关11个基因进行检测，检测结果与已知结果进行比对，评价998例已测标本符合率；选择20例全血标本，对心血管用药相关11个基因分别进行飞行时间质谱检测和Sanger测序，对比两次结果，以Sanger测序为金标准进行准确度评价。从998例DNA标本中选择部分样本进行以下研究，选择10份包含所有位点为野生型的基因组DNA，用飞行时间质谱检测，进行特异性评价；选择4份包含所有位点杂合基因型标本，梯度稀释后检测，评价位点的测定下限；选择14份包含中国人群所有常见位点基因型标本，进行批间和批内精密度评价；选择2份包含代表性峰形的野生和纯合突变标本各1份，进行抗干扰研究。结果:该方法单次检测的符合率高于99.5%，飞行时间质谱平台与Sanger测序法检测完全一致，测定下限为0.4 ngDNA，批间和批内精密度均为100%，UNG酶的降解能力为10 5拷贝/μl的气溶胶，反应体系对基因组和PCR各中间产物气溶胶有很强的抗干扰能力，点样及检测过程中芯片不同基质间无交叉污染。 结论:飞行时间质谱多基因检测系统检测性能良好，可应用于临床检测，并且本文建立了基于飞行时间质谱平台多基因检测系统的性能验证研究方案，为广大科研和检验工作者研究该平台打下基础。

目的:探讨引起血流感染铜绿假单胞菌（ Pseudomonas aeruginosa， P. aeruginosa）的耐药性、毒力基因携带情况以及多位点序列分型（MLST）的型别。 方法:回顾性收集2014年11月至2021年12月山东第一医科大学第一附属医院引起血流感染的铜绿假单胞菌94株。使用基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱仪对铜绿假单胞菌进行菌种鉴定，使用Vitek 2 Compact 全自动细菌药敏分析系统对铜绿假单胞菌进行抗菌药物敏感性实验。应用聚合酶链式反应（PCR）方法对18种常见毒力基因的携带情况进行检测。应用MLST对分离菌株进行分型。采用卡方检验对碳青霉烯类抗生素耐药的铜绿假单胞菌（carbapenem resistant pseudomonas aeruginosa，CRPA）和碳青霉烯类抗生素敏感的铜绿假单胞菌（carbapenem susceptible pseudomonas aeruginosa，CSPA）菌株的耐药及毒力基因的携带情况进行比较。 结果:在94株铜绿假单胞菌中，有19株（20.2%）为多重耐药（MDR）菌株，其中有17株为碳青霉烯类抗菌药物耐药株，2株为碳青霉烯类抗菌药物敏感株。所有菌株均包含10种以上的毒力基因，除 exoU基因外，其余基因的检出率均在83%以上。本研究共发现66个ST型，包括59个已知ST型和7个新ST型。其中ST244（11株，11.7%）和ST270（7株，7.4%）为优势型别，两种型别的菌株具有相同的毒力基因分布，但对碳青霉烯类抗菌药物的耐药率有所差异，其中ST244型别的菌株中有54.5%（6株）的为CRPA，但7株ST270型别的菌株则均为CSPA。 结论:引起血流感染铜绿假单胞菌的耐药性处于较低水平，但存在一定数量的碳青霉烯类抗菌药物耐药菌株和多重耐药菌株。这些菌株具有较高毒力基因携带率和分子多态性特征，在临床上应予以关注。

目的:研究多重耐药霍氏肠杆菌霍夫曼亚种临床分离株C37携带 blaNDM-1基因质粒的遗传特征，并对目前可公开获得的66个霍氏肠杆菌霍夫曼亚种的核心基因组进行系统发育分析，以研究霍氏肠杆菌霍夫曼亚种的全球流行情况。 方法:收集2014年8月至2021年8月中山大学附属第一医院分离的耐碳青霉烯阴沟肠杆菌复合物（CRECC）。采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术（MALDI-TOF MS）和16S rRNA Sanger测序对C37进行菌种鉴定。使用微量肉汤稀释法进行抗菌药物敏感性试验。采用聚合酶链反应（PCR）检测C37菌株携带的β内酰胺酶耐药基因和质粒介导的喹诺酮类耐药（PMQR）基因。使用接合试验确认C37菌株抗性基因的接合转移性。对C37菌株进行全基因组测序，提取霍氏肠杆菌霍夫曼亚种的核心基因组，对目前可公开获得的66个霍氏肠杆菌霍夫曼亚种进行系统发育分析。结果:霍氏肠杆菌霍夫曼亚种C37菌株对三代头孢、碳青霉烯类、氨基糖苷类及喹诺酮类抗菌药物耐药，携带 blaACT-5、 blaNDM-1、 qnrA1、 aac（ 6′） -Ib-cr、 oqxAB、 fosA、 dfrA15等多种抗性基因及IncX3、IncX4、IncFIB和IncFII质粒。多位点序列分型（MLST）分析显示其属于阴沟肠杆菌复合体（ECC）ST78型。系统发育分析显示ST78型霍氏肠杆菌霍夫曼亚种与碳青霉烯耐药基因传播密切相关。 结论:ST78型霍氏肠杆菌霍夫曼亚种与碳青霉烯耐药基因传播密切相关，是传播碳青霉烯耐药基因的高风险克隆，需密切监测其流行情况。

目的:研究2016与2019年成人致泻性大肠埃希菌（DEC）食源性腹泻临床特征与耐药性，了解北京市强化食品卫生安全措施前后DEC流行病学变迁。方法:分别收集2016和2019年就诊于北京同仁医院肠道门诊食源性成人腹泻患者1 926例和1 482例，共计3 408例。患者信息录入“肠道预警系统”，便标本分离培养，菌落行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）鉴定。大肠埃希菌采用多重荧光定量PCR对5种致病型进行分型。药物敏感性试验根据2019美国临床与实验室标准化协会标准判读。分类资料采用χ2检验或者Fisher精确检验进行统计分析。结果:3 408份标本共检出DEC 581株，肠产毒性大肠埃希菌（ETEC）占53.36%（310/581），未检出肠出血性大肠埃希菌（EHEC）。2016年DEC检出率为14.54%（280/1 926），肠聚集性大肠埃希菌（EAEC）占DEC检出率的18.21%（51/280），ETEC占71.79%（173/280）。2019年DEC检出率为20.31%（301/1 482），EAEC占DEC检出率的41.23%（116/301），ETEC占48.93%（137/301）。与2016年比较，2019年EAEC检出率增高（χ2=29.26， P<0.001），其次为肠致病性大肠埃希菌（χ2=9.37， P=0.002），而ETEC检出率下降（χ2=15.43， P<0.001）。与其他致病型相比，EAEC易引起恶心（χ2=32.72， P<0.001），感染肠侵袭性大肠埃希菌（EIEC）的患者便标本易观察到红细胞（χ2=16.44， P=0.001）和白细胞（χ2=26.82， P<0.001）。EIEC对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦及庆大霉素耐药率分别为80.95%（17/21）、66.67%（14/21）和57.14%（12/21）。2019年出现3株耐碳青霉烯类抗菌药物的EAEC，其中2株厄他培南及亚胺培南均耐药，1株仅厄他培南耐药。全基因测序显示存在多种耐药机制，以耐药结节性细胞分化家族外排泵、青霉素结合位点突变及产新德里金属β内酰胺酶5（NDM-5）为主。 结论:成人食源性腹泻患者DEC检出率高，以ETEC为主。与2016年相比，2019年ETEC下降，EAEC检出率显著升高，并于2019年分离到耐碳青霉烯类抗菌药物的致泻性大肠埃希菌菌株，其生物学特征及流行病学变迁应引起临床重视。

目的 对深圳市3例人感染猪链球菌(Streptococcus suis,Ss)分离株进行病原学及基因组学分析,为预防与控制Ss感染疫情提供依据.方法 对3家医院共3名重症患者的3份血平板培养可疑菌株进行生化鉴定、基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱和实时荧光PCR鉴定,获得3株猪链球菌血清2型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)阳性菌株.取阳性纯培养物进行药敏试验、提取核酸用于全基因组测序及分析.全基因组序列分析包括物种鉴定、耐药基因比对、多位点序列分型、毒力基因比对和基于coregene的系统进化树分析.结果 3例患者的血平板分离株均鉴定为Ss,VITEK 2生化结果鉴定为SS2,基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱鉴定结果为Ss.Ss通用基因gdh及血清型2型cps2基因实时荧光PCR结果均为阳性.药敏试验结果显示,3株菌均对红霉素、克林霉素耐药,对四环素药敏试验表现出差异.全基因组测序结果发现3株菌物种鉴定均为Ss,包括1株ST7型和2株ST1型.基于VFDB数据库毒力基因预测结果显示,3株菌均为mrp、sly和cps阳性,显示出高毒力株基因特征.基于coregene的系统进化树分析显示,3株菌处于不同进化分支,且ST1型的2株菌进化距离较近.结论 从3名重症患者中均检出SS2,3株菌均对红霉素和克林霉素耐药.在基因组学上均携带有高毒力株所具有的毒力基因,同时在多位点序列分型和系统进化树上表现出差异,表明在深圳地区存在不同基因型的高致病性SS2输入且已引起散发病例,需要引起高度关注.

目的 分析急性化脓性乳腺炎患者脓液中金黄色葡萄球菌分离株的流行病学特征和耐药性,为临床治疗提供依据.方法 收集2018年10月至2020年12月在该院乳腺外科因急性化脓性乳腺炎就诊的133例门诊患者的乳腺脓液进行一般细菌培养,采用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)仪对菌株进行鉴定,采用BioTyper软件进行聚类分析,采用VITEK-2全自动微生物分析系统检测菌株的耐药性,采用聚合酶链反应(PCR)进行毒力基因[包括溶血素基因hla和hlb、杀白细胞毒素基因(PVL)]检测.采用多位点序列分型(MLST)技术对菌株进行分子分型.结果 共分离金黄色葡萄球菌100株,菌株对青霉素的耐药率最高(92.0％),其次为红霉素、苯唑西林和克林霉素,耐药率分别为55.0％、43.0％和23.0％,对其他抗菌药物的耐药率不超过10.0％,未检测到对万古霉素和利奈唑胺耐药的菌株.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MR-SA)有 43 株,占 43.0％.PVL 的检出率为 27.0％,hla 和 hlb 分别为 77.0％和 10.0％.MALDI-TOF MS 仪将100株金黄色葡萄球菌分成A、B、C、D 4个聚类,A型菌株为主要优势菌.MLST共检测到18种序列型,其中ST59(23.0％)是主要流行的序列型,其次为ST25(21.0％)和ST398(16.0％).结论 该院乳腺炎患者金黄色葡萄球菌分离株MRSA的毒力强,应加强对该类菌株的监测.

目的 构建可同时检测多个辐射相关基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)的高通量、高分辨率、快速的方法.方法 选取 2020 年 4～6 月火箭军特色医学中心 75 例年满 18 周岁的健康男性为研究对象,采集外周血并提取DNA.文献筛选辐射相关17种基因28个SNP,设计多重PCR引物和单碱基延伸引物,通过PCR扩增和延伸,应用DP-TOF型飞行时间质谱检测系统对SNP位点进行基因分型,并对其中7份样本用Sanger测序法进行验证.结果 构建的28个SNP均分型成功.75份DNA样本28个SNP的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(martix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)检测结果显示基因分型检出率为 100.0%.7 份DNA样本 28 个SNP的基因型与Sanger测序结果完全符合,其准确度为 100.0%.结论 成功构建可同时检测 17种基因28个辐射相关SNP的核酸质谱检测技术平台,该方法具有高通量、快速准确的优点.

为探讨超氧化物歧化酶(superoxide dismutasc,SOD)基因在玉米抗逆反应中的作用,研究选用2个抗旱性有明显差别的玉米品种为试验材料,采用RT-PCR、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及二维凝胶电泳(2-DE)耦联的基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱(MALDI-TOF)法,对ZmSOD基因的序列结构及其在干旱胁迫下的表达特性进行分析.结果表明:(1)从干旱敏感品种'登海605'(DH605)和抗旱品种'蠡玉35'(LY35)玉米叶片中分别成功克隆出ZmSOD1和ZmSOD2基因.DH605中ZmSOD1开放阅读框(ORF)全长456 bp,编码151个氨基酸,编码的蛋白等电点为5.76,分子量为15.05 kD.LY35中ZmSOD2ORF全长459 bp,编码152个氨基酸,编码的蛋白等电点为5.65,分子量为15.11 kD;ZmSOD1和ZmSOD2是亲水性稳定蛋白,都含有Cu/Zn-SOD结构域,蛋白序列N端无信号肽及无跨膜结构域.同源性和系统进化分析表明,玉米ZmSOD和谷子Cu/Zn-SOD2的亲缘关系最近,相似性高达96.05％.(2)在干旱条件下,ZmSOD1在DH605中转录水平明显降低,LY35中ZmSOD2转录水平显著升高;2-DE耦联的质谱分析显示:ZmSOD1在DH605中表达量明显降低,LY35中ZmSOD2表达量无显著性变化,却检测到Mn-SOD蛋白表达量显著增加.(3)相关分析显示,干旱条件下,DH605叶片中ZmSOD1转录水平和其蛋白丰度及SOD酶活性呈极显著性正相关,LY35叶片中ZmSOD2转录水平与SOD酶活性呈显著性正相关.研究结果为进一步探索SOD基因在调节玉米抗性以及逆境胁迫应答过程中的作用机制提供了基础.

目的 分析该院近2年住院患者耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae,CRE)的临床特征、耐药性及碳青霉烯酶基因型特点,为临床有效抗感染治疗及院感防控提供依据.方法 回顾性分析兰州大学第一医院2020年1月—2021年12月临床分离CRE327株.采用全自动时间飞行质谱检测系统(VITEK MS)及全自动细菌鉴定药敏分析仪(VITEK 2 Compact)进行菌株鉴定及药敏试验,药敏结果依据CLSI M100-S31判读;PCR方法检测blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaVIM和blaOXA--485种碳青霉烯酶耐药基因.结果 2020年1月—2021年12月我院临床标本中分离出327株CRE,主要为肺炎克雷伯菌70.64％(231/327),其次为阴沟肠杆菌17.13％(56/327)和大肠埃希菌6.73％(22/327);标本来源为痰50.76％(166/327)、血液13.15％(43/327)、分泌物10.09％(33/327)及尿液8.26％(27/327)等;科室分布主要是重症监护室41.9％(137/327)、儿科23.24％(76/327)及普外科14.37％(47/327)等.327株CRE对阿米卡星、庆大霉素、四环素、复方磺胺甲恶唑、左氧氟沙星和氨曲南耐药率分别是46.2％、61.80％、71.90％、74.60％、79.00％和81.4％.327株CRE中有317株(96.94％)检测到本研究关注的碳青霉烯酶耐药基因,其中168株菌携带blaKPC-2基因(肺炎克雷伯菌124株、阴沟肠杆菌27株、大肠埃希菌10株、产酸克雷伯菌4株、弗劳地柠檬酸杆菌3株);107株携带blaNDM-1基因(肺炎克雷伯菌75株、阴沟肠杆菌14株、大肠埃希菌11株、产酸克雷伯菌7株);42株携带blaNDM-5基因(肺炎克雷伯菌25株、阴沟肠杆菌15株、弗劳地柠檬酸杆菌1株、奇异变形杆菌1株);7株菌携带blaIMP-4基因(肺炎克雷伯菌3株,同时携带blaNDM-1基因,阴沟肠杆菌4株,同时携带blaNDM-5基因).未检出blaOXA-48和blaVIM基因.结论 该院近两年对临床常用抗菌药物耐药形势严峻,CRE菌株以携带blaKPC-2和blaNDM-1基因为主,应加强碳青霉烯类抗菌药物控制和使用,预防CRE菌株感染和传播.

目的 基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱系统(MALDI-TOF MS)建立早期血流感染致病菌检测体系.方法 选取大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、变形杆菌、肺炎链球菌等10种临床最常见的病原菌作为检测对象,结合多重PCR技术和Mass ARRAY iPLEX单碱基延伸技术、MALDI-TOF MS技术,模拟细菌感染血液样本建立MALDI-TOF MS细菌核酸检测体系,测定其灵敏度;选取2017年3-5月在解放军总医院急诊科收集的疑似脓毒症患者血液样本33例对该体系进行验证,并将检测结果与微生物科血培养结果进行比较.结果 本研究所建立的MALDI-TOF质谱血液致病菌检测系统可同时检测分属两组的10种细菌,所有细菌样本均可见延伸峰;灵敏度为100CFU/ml;与33例临床血培养鉴定结果的阴性符合率为100％(27/27),6例血培养阳性样品中有2例为摩氏摩根菌和人葡萄球菌感染,因这两种细菌不包含在10种检测对象之内而未能通过质谱检出,其余4例血培养阳性样品与质谱检测结果的符合率为100％.结论 本研究建立的MALDI-TOF质谱检测体系可从全血样本中直接检测10种临床常见血流感染致病菌,无需进行培养,与传统血培养及生化鉴定相比具有耗时短、灵敏度高、准确度高等优势,可在一定程度上满足临床早期、快速诊断血流感染致病菌的需求.