目的 探讨补肾益精方对先天性视网膜色素变性RCS大鼠感光细胞凋亡的影响.方法 将先天性视网膜色素变性模型RCS大鼠24只随机分为补肾益精方组及蒸馏水组,分别给予补肾益精方药液及蒸馏水灌胃,12只健康SD大鼠常规饲养作为正常组.在给药7d及28 d后HE染色观察各组大鼠视网膜组织病理学变化,TUNEL法检测细胞凋亡情况,实时荧光定量PCR检测视网膜中睫状神经营养因子、脑源性神经营养因子以及碱性成纤维细胞生长因子表达情况.结果 HE染色切片光学显微镜下正常组SD大鼠视网膜结构清晰,层次分明,各层细胞排列整齐.蒸馏水组大鼠视网膜内核层及外核层均较正常组明显变薄,细胞排列稀疏,可见空泡样改变,感光细胞数减少,且随鼠龄增加减少日益显著.补肾益精方组大鼠视网膜内核层及外核层亦较正常组变薄,但与蒸馏水组相比增厚,感光细胞数较后者增多,细胞排列也较为整齐.给药7d及28 d时补肾益精方组每个高倍视野感光细胞数分别为140±9和80±9,蒸馏水组分别为113 ≈.8和44±6,补肾益精方组较蒸馏水组明显增多,差异有统计学意义(均为P＜0.05).TUNEL检测结果显示给药7d及28 d时补肾益精方组感光细胞凋亡率分别为31.67±5.39％及29.68±4.31％,蒸馏水组分别为50.34±5.21％及44.02±7.17％,补肾益精方组较蒸馏水组均明显降低,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).实时荧光定量PCR结果显示给药7d及28 d补肾益精方组视网膜睫状神经营养因子表达均较蒸馏水组增加(均为P＜0.05),给药7d时补肾益精方组视网膜脑源性神经营养因子表达较蒸馏水组明显增加(P＜0.05),28 d时两组差异无统计学意义(P＞0.05);给药7d及28 d两组碱性成纤维细胞生长因子的表达差异均无统计学意义(均为P＞0.05).结论 补肾益精方对RCS大鼠感光细胞凋亡有明显的抑制作用,其作用机制可能与补肾益精方促进视网膜分泌神经营养因子有关.

目的 观察滋阴明目丸对皇家外科学院(royal college surgeons,RCS)大鼠视网膜Bax及Caspase-3表达的影响.方法 实验对象分3组,分别为:空白组、模型组、滋阴明目丸组(每组雌雄各4只共8只).空白组:RCS(rdy+/+,p+/+)大鼠,灌胃生理盐水;模型组:RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠,灌胃生理盐水;滋阴明目丸组:RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠,灌胃滋阴明目丸混悬液.灌胃30 d后,免疫组化法检测各组大鼠视网膜组织中Bax及Caspase-3表达,RT-qPCR法及Western Blot法分别测定各组视网膜组织中Bax及Cas-pase-3 mRNA及蛋白相对表达水平.结果 Bax、Caspase-3蛋白在滋阴明目丸组视网膜中的阳性表达显著低于模型组,但高于空白组.与空白组比较,模型组Bax、Caspase-3平均光密度值均增加,滋阴明目丸组Bax平均光密度值增加(P<0.05或P<0.01);与模型组比较,滋阴明目丸组Bax、Caspase-3平均光密度值均显著减少(P<0.01).与空白组比较,模型组Bax、Caspase-3 mRNA、蛋白表达均增加,滋阴明目丸组Bax mRNA、蛋白表达均增加(P<0.05或P<0.01);与模型组比较,滋阴明目丸组Bax、Caspase-3 mRNA、蛋白表达均显著减少(P<0.01).结论 (1)滋阴明目丸RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠视网膜的超微结构具有保护作用;(2)滋阴明目丸能抑制RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠视网膜上Bax及Caspase-3的表达;(3)滋阴明目丸可能是通过下调视网膜上Bax及Caspase-3的表达,从而减轻视网膜感光细胞的凋亡,达到保护视细胞的目的.

目的:探讨移植色素上皮衍生因子(pigment epithelial-derived factor,PEDF)蛋白修饰人脐带来源间充质干细胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,hUCMSCs)在治疗大鼠视网膜色素变性的作用.方法:分离和培养hUCMSCs,以PEDF重组慢病毒转染hUCMSCs.实验RCS大鼠(royal college of surgeon rat,RCS)随机分为3组干预,每组8只.实验组视网膜下腔注射PEDF-hUCMSCs;hUCMSCs对照组注射等量hUCMSCs,PBS对照组注射等量PBS.注射后4、8wk观察视网膜电图(electroretinogram,ERG),检测视网膜外核层厚度,观察绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)了解细胞的存活情况,通过视网膜切片免疫荧光染色观察其在体吞噬功能,通过MERTK蛋白的表达检测重建吞噬能力来评价疗效.结果:携带PEDF基因的重组慢病毒载体,能高效感染hUCMSCs,感染后的hUCMSCs进行传代培养,慢病毒可延长目的基因在细胞内的表达.移植后8 wk视功能上ERG中b波幅值实验组明显高于对照组,移植后4、8 wk形态学上视网膜外核层(outer nuclear layer,ONL)厚度实验组均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05).移植后4、8 wk时GFP染色发现转染PEDF慢病毒的hUCMSCs细胞均能在视网膜下腔存活,视网膜切片行免疫荧光染色显示移植的PEDF-hUCMSCs对感光细胞脱落的外节碎片有吞噬作用.移植后4、8 wk时MERTK蛋白的表达检测实验组蛋白条带灰度值明显高于对照组,提示实验组中MERTK蛋白表达也明显增加,RPE重建吞噬能力提高.结论:移植PEDF蛋白修饰hUCMSCs对RCS大鼠视网膜有保护作用.

目的:观察补肾益精方对外周血骨髓间充质干细胞在视网膜变性模型(RCS)大鼠视网膜募集及睫状神经营养因子(CNTF)分泌的影响,探讨补肾益精方治疗视网膜退行性病变的作用机制.方法:实验研究.采用尾静脉注射方式将1×107个GFP标记的骨髓间充质干细胞(GFP-MSCs)注射至3周龄RCS大鼠外周血,然后按随机数字表法分为蒸馏水组及补肾益精方(BSYJ)组,每组39只.注射后第1天开始分别采用蒸馏水及补肾益精方药液灌胃,正常SD大鼠作为对照组常规饲养.给药7d、14d及28 d时分别采用视网膜铺片、免疫荧光显微镜观察GFP-MSCs在视网膜的募集情况;实时荧光定量PCR及免疫荧光双染技术检测视网膜表达CNTF的情况;TUNEL法检测视网膜细胞凋亡情况;采用单因素方差进行数据分析.结果:给药7d、14d和28 d时,蒸馏水组GFP-MSCs的数目少于BSYJ组,其中给药28 d时,2组差异有统计学意义(t=2.71,P=0.001).给药7d、14d和28 d时,BSYJ组CNTF表达较蒸馏水组均明显增加,3组差异有统计学意义(F=5.763,P=0.003;F=3.165,P=0.042;F=4.839,P=0.004).给药7d和28 d时,BSYJ组视网膜细胞凋亡率明显少于蒸馏水组,3组差异有统计学意义(F=0.002,P=0.001;F=0.307,P=0.004).结论:补肾益精方能够促进外周血干细胞在视网膜上的募集以及促进CNTF的表达,这可能是补肾益精方延缓RCS大鼠视网膜细胞凋亡和病变进程的作用机制之一.

目的:论证视网膜色素变性经典动物模型RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠具有的"虚中夹瘀"的病理机制.方法:实验研究.将10只RCS(rdy+/+,p+/+)大鼠(雌雄各5只)设为空白组;RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠共10只(雌雄各5只)设为模型组.观察2组大鼠的一般形态学及行为学特征,评价2组大鼠的生物学差异.ELISA法测定其虚证和瘀证指标,虚证指标包括视网膜匀浆组织中cAMP、cGMP含量和cAMP/cGMP值以及血浆中前列腺素(PG)、雌二醇(E2)含量;瘀证指标为血浆中P-selectin含量、血液流变学指标检测.组织切片HE染色观察2组大鼠视网膜结构.对2组数据行独立样本t检验.结果:模型组大鼠明显消瘦、神疲乏力、反应迟钝、行动缓慢、被毛蓬起无光泽、易受惊吓、食量小、大便略松软,其中雌性大鼠血浆中E2含量值明显低于空白组的雌性大鼠,差异有统计学意义(t=2.67,P=0.03);雄性大鼠血浆中PG含量值低于空白组的雄性大鼠,差异有统计学意义(t=4.12,P=0.003).空白组大鼠视网膜组织匀浆cAMP、cGMP、cAMP/cGMP均高于模型组,差异有统计学意义(t=18.87、12.63、11.76,P<0.001).当血流切变力分别为5/s、100/s、200/s时,模型组大鼠血黏度值高于空白组,差异有统计学意义(t=5.58、4.40、6.80,P<0.001).模型组大鼠血浆黏度值、全血高切相对指数、全血低切相对指数、纤维蛋白原均高于空白组,差异有统计学意义(t=5.20,8.25,9.08,6.15,P<0.001).模型组大鼠血浆中P-selectin含量明显高于空白组,差异有统计学意义(t=4.30,P=0.003).模型组大鼠视网膜各层结构明显较空白组紊乱,视网膜厚度萎缩变薄,病变主要位于视网膜外层及视锥与视杆细胞.结论:视网膜色素变性经典模型RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠具有形体消瘦,肾精亏虚且虚中加瘀等病理生理特点.

目的 观察益气明目丸对视网膜色素变性大鼠视网膜中Bax、Caspase-3表达的影响.方法 24只RCS大鼠分为3组,每组8只,雌雄各半,其中,空白组:RCS(rdy+/+,p+/+)大鼠灌胃生理盐水;模型组:RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠灌胃生理盐水;益气明目丸组:RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠灌胃益气明目丸悬浊溶液.灌胃30 d后,HE染色观察各组视网膜各层结构,免疫组织化学染色法检测各组视网膜组织中Bax、Caspase-3的平均光密度值,Western blot法测定各组视网膜组织中Bax、Caspase-3蛋白的相对表达量.结果 HE染色结果显示,益气明目丸组大鼠视网膜厚度明显高于模型组,感光细胞核数目也较模型组增多,外丛状层、外核层、视杆视锥层较模型组结构更清晰.免疫组织化学染色检测结果显示,益气明目丸组Bax、Caspase-3平均光密度值(0.133±0.030、0.069±0.024)均较模型组(0.211±0.036、0.119±0.027)减少(均为P＜0.01).Western blot检测结果显示,益气明目丸组Bax蛋白、Caspase-3蛋白相对表达量(0.374±0.051、0.628±0.045)均明显低于模型组(0.768±0.061、0.802士0.074),差异均有统计学意义(均为P＜0.01).结论 益气明目丸对视网膜色素变性大鼠视网膜的超微结构具有保护作用;益气明目丸通过抑制视网膜上Bax、Caspase-3的表达减轻视网膜感光细胞的凋亡,达到保护视细胞的目的.

目的 研究在英国皇家外科学院(RCS)大鼠视网膜色素变性( RP)发展过程中,介导细胞免疫的T淋巴细胞和自然杀伤(NK)细胞及其分泌的细胞因子γ干扰素( IFN-γ)的变化. 方法 选取出生后20日龄(P20)、P40、P60 RCS-rdy--P+大鼠(简称RCS大鼠)和相应日龄RCS-rdy+-P+大鼠(简称对照大鼠)各12只,细胞因子液相悬浮芯片检测大鼠视网膜匀浆中多种炎性细胞因子的质量浓度.实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)检测各日龄大鼠视网膜中白细胞介素-2(IL-2)、CC类趋化因子配体2(CCL2)、CXC趋化因子配体9(CXCL9)、CXCL10和IFN-γ mRNA的表达水平;免疫组织化学技术检测大鼠视网膜中T淋巴细胞(CD4+、CD8+)和NK细胞(CD161+)的分布;流式细胞术检测大鼠视网膜中T淋巴细胞(CD4+、CD8+)和NK细胞(CD161+)的比例,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大鼠视网膜组织匀浆中IFN-γ的质量浓度. 结果RCS组大鼠视网膜中淋巴细胞相关细胞因子和趋化因子mRNA表达水平均表现出随日龄增加而表达上调的趋势,P60 RCS大鼠视网膜中IL-2、CCL2、CXCL9、CXCL10、CXCL11和IFN-γ mRNA表达水平均较P20 RCS大鼠和对照组大鼠表达水平明显升高,差异均有统计学意义(均P<0.05). P60 RCS大鼠视网膜中CD4、CD8、CD161细胞阳性率分别为(9.09±0.89)% 、(18.77±0.38)%和(9.41±0.38)% . P60 RCS大鼠视网膜中IFN-γ阳性细胞比例为(8.29±0.27)%,较对照大鼠的(0.28±0.02)%显著升高,差异有统计学意义(t=29.03,P=0.00). P60 RCS大鼠视网膜中CD4+、CD8+和CD161+淋巴细胞主要分布在内层视网膜,且IFN-γ阳性标记与淋巴细胞表面标记呈共定位.不同日龄RCS大鼠和对照大鼠视网膜中IFN-γ质量浓度比较,差异均有统计学意义(F组别=16.49,P<0.01;F时间=21.05,P<0.01),其中P60 RCS大鼠视网膜中 IFN-γ质量浓度较 P20 RCS大鼠、P40 RCS大鼠和对照组大鼠明显升高,差异均有统计学意义(均P<0.05). 结论 RCS大鼠RP改变了视网膜内相对免疫豁免的微环境,视网膜中淋巴细胞趋化因子和细胞因子表达水平逐渐升高,并在病变后期引起淋巴细胞的浸润和激活,导致IFN-γ在视网膜中浓度显著升高,表明细胞免疫参与其病理机制.

目的 探讨益气明目丸治疗视网膜色素变性的可能作用机制.方法 24只RCS大鼠随机分为空白组、模型组、益气明目丸组,每组8只.空白组RCS(rdy+/+,p+/+)大鼠(无视网膜色素变性)和模型组RCS(rdy-/,p-/-)大鼠(视网膜色素变性模型)均灌胃生理盐水12ml/(kg·d),益气明目丸组RCS(rdy-/,p-/-)大鼠灌胃益气明目丸悬浊溶液7.8g/(kg·d).灌胃30天后,HE染色观察各组大鼠视网膜各层结构,采用免疫组化法和Western blot法检测各组大鼠视网膜中Fas、FasL蛋白表达.结果 HE染色显示,益气明目丸组大鼠视网膜厚度明显较模型组大鼠视网膜增厚,视网膜色素上皮条带部分可见,部分外核层光感受器感觉纤毛层部分可见,光感受器细胞核数目较模型组多,外从状层、外核层、视杆视锥层较模型组结构清晰且增厚.免疫组化法结果显示,与空白组比较,模型组Fas、FasL蛋白表达均明显升高(P＜0.01);与模型组比较,益气明目丸组Fas、FasL蛋白表达均明显下降(P＜0.05或P＜0.01),且与空白组比较差异均无统计学意义(P＞0.05).Western blot法结果显示,与空白组比较,模型组Fas、FasL蛋白表达均明显升高(P＜0.01);与模型组比较,益气明目丸组Fas蛋白表达差异无统计学意义(P＞0.05),FasL蛋白表达明显降低,但仍高于空白组(P＜0.01).结论 益气明目丸对视网膜色素变性大鼠视网膜的超微结构具有保护作用,其机制可能是通过抑制视网膜Fas、FasL蛋白表达,从而减轻视网膜感光细胞的凋亡,达到保护视细胞的目的.

目的 观察枸杞加丹参对视网膜色素变性大鼠视网膜组织形态学以及αB多肽(CRYAB)mRNA的影响.方法 将24只雌雄不拘的视网膜色素变性RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠按照随机数字表法分为模型组及杞参组,每组8只,雌雄各4只.另RCS(rdy+/+,p+/+)大鼠8只,雌雄各4只,为空白组.常规喂养1周后开始灌胃,1次/d.空白组与模型组给予生理盐水,杞参组给予成人等效剂量的枸杞+丹参.连续灌胃30 d后处死,在光学显微镜下观察各组RCS大鼠视网膜的外核层厚度等形态学改变,采用qPCR检测RCS大鼠视网膜CRYAB mRNA的表达.结果 HE染色结果显示:空白组各层视网膜结构排列整齐有序,形态规则;模型组较空白组视网膜结构排列明显疏松、变性萎缩,外核层厚度明显变薄,差异有高度统计学意义(P＜ 0.01);而杞参组虽与空白组比较结构较紊乱,厚度变薄,但较模型组厚度增加,差异有高度统计学意义(P＜0.01).qPCR结果显示:空白组大鼠在视网膜中可见CRYAB mRNA的表达,模型组大鼠视网膜CRYAB mRNA的表达较空白组明显降低(P＜0.01),杞参组大鼠视网膜CRYAB mRNA的表达较模型组升高,差异有高度统计学意义(P＜0.01).结论 RCS大鼠能很好地模拟人视网膜色素变性的发病特点,其视网膜各层结构紊乱变性,外核层变薄,视网膜CRYAB mRNA的表达被抑制,而枸杞+丹参能诱导视网膜CRYAB mRNA的表达,对视网膜色素变性RCS大鼠的视网膜有一定的保护作用.

目的 观察滋阴明目丸对RCS大鼠视网膜Fas/FasL表达的影响.方法 选择RCS大鼠,(1.51±0.27)月龄,共24只,按随机数字表法将其分为三组:空白组、模型组、滋阴明目丸组(雌雄各4只,n=8).空白组:RCS(rdy+/+,p+/+)大鼠,灌胃生理盐水;模型组:RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠,灌胃生理盐水;滋阴明目丸组:RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠,灌胃滋阴明目丸.灌胃30 d后,免疫组化染色观察标本视网膜各层结构的形态学变化,Western blot法测定RCS大鼠视网膜Fas/FasL表达水平.结果 免疫组化染色结果显示:空白组大鼠视网膜各层结构清晰;模型组大鼠视网膜的厚度低于空白组,且各层结构不清晰;滋阴明目丸组大鼠视网膜厚度低于空白组但高于模型组,视网膜各层结构较清晰.Western blot法检测结果显示:滋阴明目丸组大鼠视网膜Fas、FasL蛋白相对表达量明显低于模型组,差异有高度统计学意义(P＜0.01).结论 滋阴明目丸对视网膜的超微结构具有保护作用,能抑制视网膜上Fas/FasL的表达,从而减轻视网膜感光细胞的凋亡,达到保护视细胞的目的.