RNAscope是以新型探针设计为优势的新一代原位杂交技术，现正逐步应用于多个研究领域，研究范围亦在不断拓展之中。我国肝病人口基数大，基于组织学生物信息检测及研究评价的需求性大，该技术有独特原位水平的特异性与敏感性，弥补了免疫组织化学与传统原位杂交的技术缺陷。实现多重性及单分子水平检测，可在肝病领域多个方面进行核酸水平的定性、定量分析并与组织原位结合实现可视化评价以凸显"金标准"的价值。现就近年来RNAscope技术在肝脏组织学方面的应用进行综述。

目的:比较免疫组织化学（IHC）、DNA荧光原位杂交（FISH）及RNA原位杂交不同检测方法检测程序性死亡配体1（PD-L1）之间的一致性。方法:收集南京大学医学院附属鼓楼医院病理科2014—2018年诊断为EB病毒相关性胃癌（EBVaGC）59例，EB病毒阳性弥漫性大B细胞淋巴瘤（EBV +DLBCL）27例和三阴性乳腺癌（TNBC）30例。分别运用IHC、FISH及RNA原位杂交（RNAscope）检测PD-L1的状态。 结果:所有样本均成功进行上述3种方法学检测，59例EBVaGC中PD-L1 IHC阳性率为84.7%（50/59），FISH阳性率为10.2%（6/59），RNAscope显示81.4%（48/59）为高表达；27例EBV +DLBCL中PD-L1 IHC阳性率为74.1%（20/27），FISH阳性率为7.4%（2/27），RNAscope显示66.7%（18/27）为高表达；30例TNBC中PD-L1 IHC阳性率为66.7%（20/30），FISH阳性率为16.7%（5/30），RNAscope显示81.5%（22/30）为高表达。检测结果相关性分析显示：IHC与RNAscope相关性为0.759（ P<0.01），IHC和FISH相关性为0.759（ P=0.040），FISH与RNAscope相关性为0.077（ P=0.031）。 结论:PD-L1不同检测方法中，RNAscope与IHC检测一致性较强，FISH与IHC和RNAscope的一致性均较差，单纯依靠IHC诊断PD-L1状态存在误诊的可能，利用RNAscope技术可以检测其mRNA的表达水平。RNAscope是一种评价PD-L1状态的相对准确和客观的方法。

目的:研究不同剂量N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)溶液对小鼠视网膜神经节细胞(RGCs)的损伤作用，并检测新型长链非编码RNA(lncRNA)Tsix在小鼠视网膜兴奋性毒性模型中的表达水平及其对视网膜和RGCs的保护作用。方法:选取7～8周龄C57B6/J小鼠105只，采用随机数表法将小鼠随机分为正常对照组、2 mmol/L NMDA组、10 mmol/L NMDA组、20 mmol/L NMDA组和40 mmol/L NMDA组，每组21只。正常对照组小鼠右眼玻璃体腔内注入1 μl氯化钠溶液，不同剂量NMDA组分别注射相应剂量的NMDA溶液各1 μl。1周后，分别采用光相干断层扫描(OCT)、苏木精-伊红染色、视网膜铺片和免疫荧光染色法分析不同剂量NMDA组视网膜各层厚度、神经节细胞层(GCL)细胞数量和RGCs数量。采用RNAscope原位杂交技术检测不同剂量NMDA组GCL中lncRNA Tsix的表达。采用实时荧光定量PCR技术检测不同剂量NMDA组 Tsix基因的转录本水平。 结果:OCT结果显示，2、10、20和40 mmol/L NMDA组视网膜全层厚度分别为(255.00±6.63)、(252.40±6.41)、(248.67±6.20)和(229.11±10.37)μm，较正常对照组的(269.60±20.01)μm明显变薄，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。苏木精-伊红染色结果显示，正常对照组小鼠GCL细胞排列均匀、紧密，呈单层，细胞核大而圆，NMDA注射后细胞出现体积不均和空泡，有核固缩现象。各剂量NMDA组GCL细胞数量随NMDA剂量的增加而显著降低，与正常对照组相比差异均有统计学意义(均 P<0.05)。当NMDA浓度增至20 mmol/L时，GCL的细胞数量减少至正常对照组的一半。视网膜铺片结果提示，β3-微管蛋白阳性RGCs细胞数量随NMDA剂量的增加显著降低，与正常对照组比较差异均有统计学意义(均 P<0.05)；10 mmol/L NMDA组RGCs数量减少至正常对照组的一半。RNAscope结果显示，lncRNA Tsix主要在GCL细胞的细胞质中表达，且随着NMDA剂量的增加，表达lncRNA Tsix的阳性细胞率显著降低，各组总体比较差异有统计学意义( F＝13.670， P<0.01)。实时荧光定量PCR结果验证Tsix随NMDA剂量的增加表达趋势与RNAscope结果一致。 结论:NMDA对视网膜厚度和RGCs的损伤呈剂量依赖性，小鼠视网膜lncRNA Tsix的表达主要集中在GCL细胞的细胞质，且转录本水平随着NMDA剂量的增加而降低，对RGCs发挥保护作用。

目的:通过在单细胞水平分析小鼠磨牙细胞间异质性，构建牙髓细胞发育的时空图谱，进一步揭示牙齿发育的过程和调控机制。方法:分别收集出生后0、3 d的C57BL/6小鼠下颌第一磨牙各10颗，制备单细胞悬液，采用单细胞转录组测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）技术进行测序。从本课题组前期研究中提取出生后7 d小鼠磨牙scRNA-seq数据，与0、3 d数据进行合并分析。使用Seurat程序对测序数据进行质控、标准化、降维和聚类分析；Monocle程序进行拟时序分析，预测发育轨迹；Scillus程序进行基因本体分析，对细胞功能进行注释。使用原位杂交技术对标记基因进行体内定位，明确不同亚群细胞的体内分布和时空变化。结果:Seurat分析显示小鼠磨牙细胞具有26个细胞亚群，可分为牙髓细胞、牙囊细胞、上皮细胞、免疫细胞、内皮细胞、管周细胞、胶质细胞和红细胞等八大类细胞，其中牙髓细胞包含5个亚群：成熟牙髓细胞，标记基因为柯萨奇病毒腺病毒受体（coxsackie virus and adenovirus receptor，Cxadr）；牙乳头细胞，标记基因为SPARC相关模块化钙结合蛋白2（SPARC related modular calcium binding 2，Smoc2）；周期细胞，标记基因为Ⅱ型DNA拓扑异构酶（DNA topoisomerase Ⅱ alpha，Top2a）；前成牙本质细胞，标记基因为棕榈酰蛋白羧酸酯酶（notum palmitoleoyl-protein carboxylesterase，Notum）；成牙本质细胞，标记基因为牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，Dspp）。随着牙胚发育，成熟牙髓细胞的比例逐渐增加，周期细胞和成牙本质细胞比例逐渐降低。原位杂交染色和基因本体分析结果显示，Cxadr+成熟牙髓细胞定位于牙冠上部，主要功能为成骨和“细胞外结构组织”；Smoc2+牙乳头细胞位于根尖，主要功能与“细胞外结构组织”和器官发育相关；Top2a+周期细胞位于牙冠下部，进行有丝分裂；Notum+前成牙本质细胞邻近上皮根鞘，和Dspp+成牙本质细胞的主要功能同为生物矿化。Monocle分析显示牙髓细胞有2条发育轨迹，从Smoc2+牙乳头细胞起始，经过Top2a+周期细胞，再分化为Cxadr+成熟牙髓细胞或成牙本质细胞。结论:scRNA-seq技术能在转录组水平充分揭示细胞间的异质性，为研究器官发育过程和调控机制提供了有力工具。

目的:探讨国际颈管腺癌标准与分类（IECC）在中国妇女宫颈腺癌中的临床病理意义及预后评估价值。方法:收集浙江大学医学院附属妇产科医院2013年1月至2019年12月宫颈腺癌病例286例，复习HE切片，按IECC重新分类，分析各组织学类型与p16免疫组织化学染色、人乳头状瘤病毒（HPV）mRNA原位杂交（RNAscope）结果、国际妇产科联盟（FIGO）分期等临床病理参数以及预后之间的相关性。结果:宫颈腺癌发病年龄19~77岁（中位年龄47岁）。FIGOⅠ期223例，Ⅱ期22例，Ⅲ期38例，Ⅳ期3例。按IECC分类，HPV相关腺癌（HPVA）213例（74.5%）、非HPV相关腺癌（NHPVA）60例（21%）和腺癌-非特指类型（NOS）13例（4.5%）。HPVA、NHPVA的组织学亚型分别以普通型（156例，54.5%）和胃型（46例，15.9%）最常见。HPVA、NHPVA和腺癌-NOS，p16阳性占比分别为173/188（91.8%）、17/64（26.6%）和8/13，HPV mRNA阳性占比分别为144/161（89.4%）、0/18和7/13。与HPVA相比，NHPVA具有发病年龄大、FIGO分期高、神经侵犯、脉管内瘤栓、p53突变型表达率高等特点（ P<0.05）。年龄>47岁、NHPVA、胃型、FIGOⅡ~Ⅳ期、脉管内瘤栓、神经侵犯、p53突变型表达等为总生存、肿瘤复发的预后不良因素（ P<0.01）。在HPVA，黏液型组预后比普通型组差（ P<0.05）。多因素生存分析发现，FIGOⅡ~Ⅳ期、NHPVA和p53突变型表达是宫颈腺癌总生存的独立预后不良因素，FIGOⅡ~Ⅳ期和胃型腺癌为肿瘤复发的独立预后因素（ P<0.05）。 结论:IECC将宫颈腺癌分为HPVA和NHPVA有很好的病因学、临床病理意义与预后评估价值。

目的:研究长链非编码RNA00707在乳腺癌组织中的表达及其与乳腺癌临床病理特征的相关性。方法:建立人脂肪间充质干细胞（hAD-MSCs）与人乳腺癌MCF7细胞间接共培养体系。并诱导MCF7细胞上皮-间充质转化（EMT），通过lncRNAs芯片技术，最终获得差异表达的长链非编码RNA00707。收集民航总医院及衡道病理中心提供的2015—2019年乳腺癌组织标本136例。应用RNAscope技术检测并统计分析乳腺癌组织中Linc00707的阳性表达与肿瘤大小、组织学分级、腋窝淋巴结转移及血管内癌栓的关系。结果:121例阳性病例，Linc00707呈细胞核及细胞质内点簇状棕褐色颗粒。（1）Linc00707在T2、T3、T4组的阳性表达率均高于T1组。（2）Linc00707在乳腺癌组织学Ⅱ、Ⅲ级中的阳性表达率高于乳腺癌组织学Ⅰ级，差异有统计学意义（ P<0.05）。（3）Linc00707在有淋巴结转移的N1、N2、N3组的阳性表达率明显高于无淋巴结转移的N0组。（4）Linc00707阳性表达率在有无血管内癌栓之间差异无统计学意义（ P>0.05）。（5）Linc00707在<50岁与≥50岁之间阳性表达率差异无统计学意义（ P>0.05）。 结论:Linc00707在乳腺癌中的阳性表达与肿瘤大小、组织学分级、腋窝淋巴结转移呈正相关，结果显示Linc00707能够促进乳腺癌的生长、增殖、侵袭和转移。

目的:探讨伴有微乳头状浸润结构的宫颈腺癌的病理形态、免疫表型及分子学特征。方法:收集南京医科大学第一附属医院2013年5月至2019年9月伴有微乳头状浸润结构的宫颈腺癌5例，进行免疫组织化学、RNAscope检测、荧光原位杂交及二代测序检测并电话随访。结果:5例患者年龄48~53岁，平均50.6岁。镜下无纤维血管轴心的肿瘤细胞簇，成桑葚样或假腺腔样排列，被貌似血管腔的透明空隙包围，肿瘤细胞簇内及周围间质中可见较多炎性细胞浸润。并可见脉管内癌栓（5/5）和淋巴结转移（4/5）。MUC1以及E-cadherin呈反向表达。RNAscope检测：3例E7RNA均为阳性。分子检测：4例可见PIK3CA突变，3例可见TERT启动子，2例可见NF1突变。随访：2例死亡，3例存活病例中1例复发正接受放疗。结论:伴有微乳头状浸润结构的宫颈腺癌是人乳头状瘤病毒相关性腺癌，具有侵袭性强，预后差的特点，形态学上与其他器官相似，需要引起重视。PIK3CA突变或可成为针对此亚型肿瘤的治疗靶点。

目的:初步探讨同种异体骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植治疗创伤性脑损伤(TBI)的遗传安全性。方法:(1)体内实验：分离提取并传代培养雄性SD大鼠的BMSCs。将微量药物注射套管植入并固定于12只雌性SD大鼠左侧侧脑室3 d后，用气压精密打击器对大鼠右侧大脑皮层进行打击以制备成中度TBI模型。分别于造模后4 h、3 d、6 d、9 d、12 d时经套管对TBI大鼠进行单次/多次BMSCs输注(2.5×10 5个/次，总体积10 μL)，并分别取造模后48 h、72 h、10 d和14 d时TBI大鼠(每时间点3只)的脑组织制备成石蜡标本，应用免疫荧光染色检测小胶质细胞激活情况，应用RNAscope ?技术检测星形胶质细胞、神经元、小胶质细胞与移植的BMSCs的共定位情况，以观察同种异体BMSCs移植至TBI宿主体内后是否与宿主脑内细胞发生整合现象。(2)体外实验：先将冻存复苏的小胶质细胞株BV2用绿色荧光蛋白(GFP)阳性慢病毒颗粒转染，再将pHrodo RED探针预标记的BMSCs与经脂多糖预处理的BV2细胞分别按一定比例(BV2∶BMSCs=1∶1、1∶2、2∶1)进行共培养，36 h、72 h后于共聚焦荧光倒置显微镜下观察2种细胞间是否发生吞噬现象，以观察小胶质细胞对BMSCs的具体作用形式。 结果:(1)体内实验：造模后48 h、72 h、10 d和14 d时，TBI大鼠的脑组织石蜡切片中均未发现移植的BMSCs与星形胶质细胞、神经元存在共定位现象，但在造模后10、14 d时，TBI大鼠的小胶质细胞明显被激活并迁移至左侧侧脑室及脉络丛附近，且与移植的BMSCs发生共定位现象。(2)体外实验：不同比例的BV2细胞与BMSCs共培养36 h、72 h后均发生吞噬现象。结论:同种异体BMSCs移植后并未与TBI宿主的星形胶质细胞、神经元发生整合现象，但其可被小胶质细胞吞噬，表明同种异体BMSCs移植治疗TBI具有遗传安全性。

目的:探讨长链非编码RNA RP11-159K7.2在鼻腔鼻窦鳞状细胞癌（sinonasal squamous cell carcinoma，SNSCC）进展中的作用与机制。方法:选取2009—2014年哈尔滨医科大学附属第二医院耳鼻咽喉头颈外科SNSCC手术患者的癌组织和癌旁非癌组织标本65例，通过RNAscope原位杂交技术检测RP11-159K7.2在SNSCC组织及癌旁组织中的表达，观察其与预后的关系。运用规律成簇间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白9（CRISPR/Cas9）方法敲减RPMI-2650细胞（SNSCC细胞系）RP11-159K7.2的表达。体外实验分别用细胞增殖试剂盒8（CCK-8）增殖实验、划痕实验和Transwell实验等观察下调RP11-159K7.2后，SNSCC细胞增殖、迁移和侵袭等生物学行为的变化。体内实验观察RP11-159K7.2下调后，SNSCC裸鼠移植瘤生长的改变。机制研究运用蛋白质芯片方法，筛选RP11-159K7.2可能结合的蛋白质，运用蛋白免疫印迹法（WB）和RNA免疫共沉淀技术鉴定RP11-159K7.2结合的蛋白质。采用SPSS 17.0软件进行统计学处理。结果:RP11-159K7.2在SNSCC组织中的表达显著高于癌旁组织，与T分级、淋巴结转移及分化程度密切相关（χ2值分别为4.697、4.235和10.753， P值均<0.05）。RP11-159K7.2高表达患者的5年生存率明显低于RP11-159K7.2低表达患者（ P=0.013 7）。RP11-159K7.2下调后，SNSCC细胞的增殖、迁移及侵袭能力显著下降，SNSCC移植瘤生长受到明显抑制。RP11-159K7.2可能结合的蛋白质有31种，其可直接与核因子-κB（NF-κB）蛋白结合，对SNSCC细胞增殖和侵袭的调控依赖NF-κB。 结论:RP11-159K7.2在SNSCC中表达增高，有望成为SNSCC预后评估的潜在分子标志物。其在SNSCC中的作用机制与结合和调控NF-κB蛋白有关。

目的:探讨鼻嗜酸细胞性乳头状瘤（sinonasal oncocytic papilloma，SNOP）与人乳头瘤病毒感染（human papillomavirus，HPV）的相关性，并分析其临床病理特点。方法:收集2017年3月至2020年11月经北京同仁医院病理科确诊的24例鼻嗜酸细胞性乳头状瘤标本，观察其组织形态学特点，采用RNAscope技术检测瘤体组织中的HPV mRNA，免疫组织化学法检测标本组织中Ki-67、P16、P53和P63的表达。结果:20例为初诊病例，4例为复发病例。镜下肿瘤组织呈乳头状，可呈外生性和内翻性生长。瘤体细胞呈高柱状，细胞内含大量红染的嗜酸性物质。瘤细胞呈多层排列，在瘤细胞间可见许多充满粘液的微囊。所有患者HPV16/18、HR-HPV18和LR-HPV 6检测HPV mRNA均为阴性。免疫组织化学结果显示Ki67表达均在1%~5%之间；P16有11例阳性；P53有8例阳性，4例弱阳性；P63有13例阳性。结论:鼻嗜酸细胞性乳头状瘤的发病可能与黏膜炎症关系密切，与HPV感染关系不明确。Ki-67、P16、P53和P63的异常表达可能参与了SNOP发病过程。