目的:构建猪链球菌2型Δ0948互补株，验证对溶血素分泌和毒力的影响。方法:PCR扩增带启动子的SSU05_0948基因序列并连接至pAT18载体构建互补株，Western blot验证表达情况；绘制生长曲线比较互补株和野生株、突变株在不同时期的生长情况；CD1小鼠攻毒模型验证互补株能否恢复突变株毒力；溶血素(SLY)溶血活性及Western blot比较互补株和野生株、突变株不同时间点对SLY蛋白分泌的影响。结果:互补株构建成功但SSU05_0948基因的表达低于野生株；互补株在对数生长期的生长速度明显慢于野生株和突变株，但在平台期一致；CD1小鼠毒力试验证明互补株可以基本恢复突变株毒力；SLY蛋白溶血活性及Western blot实验证明SSU05_0948在对数期早中期可以抑制SLY蛋白的分泌，而在对数期晚期及平台期则不影响SLY蛋白的分泌，互补株可以恢复SLY蛋白的分泌。结论:猪链球菌互补株CΔ0948能够恢复突变株Δ0948的毒力，SSU05_0948影响SLY蛋白的分泌，为猪链球菌防治提供新思路。

目的 明确89K样毒力岛(PAI)的基因组特征及其在猪链球菌致病及耐药传播方面的作用.方法 通过生物信息学方法分析89K样PAIs的基因组特征;通过接合实验比较两种89K样PAIs的转移能力;采用最小抑菌浓度法测定临床分离株及接合子的耐药谱;通过C57BL/6小鼠和斑马鱼感染模型分别评估两个临床菌株及其89K样PAIs的接合子的致病性.结果 携带89K样PAIs的猪链球菌临床菌株GX54和GX82的序列型(ST)分别为ST665和ST107.菌株GX54携带的PAI大小为75Kb,在核苷酸水平上与ST7流行型菌株携带的89K PAI具有99.21％的相似性和79.00％的覆盖率,而菌株GX82携带的PAI大小为87Kb,与89K PAI具有98.80％的相似性和86.00％的覆盖率.这两个PAIs的插入位点与89K PAI相同,均位于rplL位点,且PAIs的两端均含有一段15 bp的att序列(5'-TTATTTAAGAGTAAC-3').此外,这两个PAIs均具有完整的模块化结构,包含完整的NisK-NisR样双组分信号转导系统和Ⅳ型分泌系统(T4SS).而在SalR-SalK样双组分信号转导系统中,仅SalR基因保持完整,SalK基因发生错义突变.与89K PAI相比,本研究中的两个PAIs在基因组成上呈现出一定的差异.75K PAI插入了4个基因,包括两个假定蛋白基因和两个耐药基因tet(O)和erm(B).而87K PAI则插入了12个基因,主要涉及编码与质粒相关的重组酶和假基因,以及与耐药相关的cat、tet(L)、erm(B)基因.此外,还包括编码转座酶、拓扑异构酶等基因.菌株GX54携带的75K PAI的转移频率为4.61×10-5,显著高于菌株GX82携带的87K PAI的转移频率8.46×10-6.与受体菌P1/7RIF相比,两个89K样PAIs的接合子P1/7RIF-GX54与P1/7RIF-GX82的四环素类和大环内酯类抗生素的抗性水平,以及对斑马鱼的致病力均显著增加,且两接合子组间的致病力差异无统计学意义(P＞0.05).菌株GX54和菌株GX82感染C57BL/6小鼠后,菌株GX54感染组小鼠死亡率显著高于菌株GX82感染组(P＜0.05).攻毒8 h后,两感染组小鼠的外周血细菌载量无统计学意义(P＞0.05),但菌株GX54感染组小鼠血清中的TNF-α水平显著高于菌株GX82感染组小鼠(P＜0.05),而IL-6水平在两感染组间无统计学意义(P＞0.05).sly、mrp、epf,ofs,revS,nadR,SSU05_0473,neuB及neuC等在高致病型猪链球菌中常见的毒力基因在GX54与GX82也存在.结论 本研究首次发现了猪链球菌ST665和ST107型临床菌株携带可移动的89K样PAIs.携带不同89K样PAIs的菌株毒力水平具有显著差异,该差异与菌株在感染早期诱导宿主产生TNF-α的水平密切相关,且并非由外周血中的细菌载量差异所引起.仅以包括89K样PAIs在内的已知毒力基因存在与否做为判断猪链球菌毒力水平的方法存在不足.

赤霉素(Gibberellins或gibberellic acid,GA)是植物生长发育所必需的植物激素之一,调控植物生长发育的多个过程.近年来随着植物分子生物学和功能基因组学的发展,有关GA信号转导途径及其调控植物生长发育的研究取得了一系列的进展.综述了GA信号转导途径的关键组分,包括GA受体GIBBERELLIN INSENSITIVE DWARF1(GID1)蛋白、F-box蛋白(拟南芥中的SLEEPY1[SLY1]和水稻中的GIBBERELLIN INSENSITIVE DWARF2[GID2])及DELLA蛋白,阐述了GA去除DELLA蛋白阻遏作用的分子模型,同时探讨DELLA蛋白通过其互作蛋白整合其它激素及环境信号调控植物生长发育的作用机理.

SLEEPY1(SLY1)属于F-box蛋白,是SCF复合体的主要组成元件之一,在赤霉素信号转导过程中发挥着重要的调节作用 本研究以夏黑葡萄为试材,利用电子克隆和RT-PCR技术克隆获得一个F-box蛋白基因全长cDNA序列,命名为VvSLY1.该基因全长为1096 bp,包含1个555 bp的完整开放阅读框(ORF),编码184个氨基酸.序列比对和结构域分析结果表明,该VvSLY1包含F-box蛋白家族的LGG和LSL保守结构域.进化树分析结果显示,VvSLY1与可可亲缘关系最近.qRT-PCR分析结果表明,在果实快速膨大发育阶段,外源赤霉素GA3处理会促进该基因的上调表达.

[背景]猪链球菌(Streptococcus suis,ss)是一种重要的人兽共患病原菌,有35种血清型,其中以猪链球菌2型(SS2)危害最为严重.研究发现,各种血清型SS分泌的溶血素(Suilysin,SLY)可能具有较好的免疫保护作用,因此,SLY作为SS基因工程亚单位疫苗的成分具有较大优势.[目的]获得SS2安徽强毒株(AH10-8株)溶血素基因(sly)的表达产物,并对其免疫原性进行测定分析.[方法]根据GenBank数据库中登录号为DQ443533.1的全长sly序列,设计合成一对分别带有BamH Ⅰ、Xho Ⅰ酶切位点的特异性引物,利用PCR从AH10-8株中扩增sly基因,构建pET-30a-sly原核表达重组质粒,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中,进行IPTG诱导表达和His-Tag镍柱纯化蛋白,SDS-PAGE检测SLY,Western blotting鉴定SLY的反应原性;利用昆明鼠和斑马鱼进行SLY免疫攻毒保护试验,间接ELISA方法检测昆明鼠血清IgG抗体效价,观察比较病理组织变化及其免疫保护率.[结果]重组质粒pET-30a-sly在大肠杆菌中实现高效表达,获得大小为60 kD的目的蛋白,与预期大小的SLY分子质量一致,能与SS2阳性血清发生特异性反应.SLY和AH10-8株灭活全菌体3次免疫昆明鼠后的血清IgG抗体效价分别为1∶6 400、1∶204 800(以AH10-8株全菌体的超声裂解物为包被抗原)和1∶102 400、1∶51 200(以SLY为包被抗原);SLY和AH10-8株灭活全菌体对昆明鼠和斑马鱼的免疫保护率分别为40％、80％和84％、92％;病理组织变化与攻毒对照组之间差异明显.[结论]成功表达的SLY具有良好的反应原性和免疫原性,可诱导机体产生保护性免疫反应,有望成为研制SS2新型疫苗的候选成分.

目的 观察水飞蓟素(Sly)对糖尿病肾病(DN)大鼠肾损伤的改善作用,并探讨其作用机制.方法 将40只SD大鼠随机分为4组(每组10只):糖尿病肾病组(DN组)、水飞蓟素低剂量治疗组(Sly-L组)、水飞蓟素高剂量治疗组(Sly-H组)、对照组.DN组、Sly-L组、Sly-H组均采用链脲佐菌素诱导制备DN大鼠模型.Sly-L组大鼠每24 h给予低剂量Sly(60 mg/kg)灌胃1次,Sly-H组大鼠每24 h给予高剂量Sly(120 mg/kg)灌胃1次,DN组、对照组给予等量生理盐水灌胃.各组大鼠灌胃8周后,采用代谢笼收集24h尿液,取空腹鼠尾静脉血及眼眶血,然后处死大鼠,处死大鼠后迅速切取两侧肾脏,使用预冷生理盐水灌洗去除残留血液,滤纸吸干后备检.取鼠尾静脉血检测空腹血糖(FPG);取代谢笼收集的大鼠24 h尿液,采用双缩脲比色法测定24 h尿白蛋白和肌酐,计算尿白蛋白/肌酐比值(UACR);称取处死后大鼠体质量及肾脏质量,计算肾脏指数(肾脏重量/大鼠体质量,KI).取大鼠眼眶血,采用ELISA法检测各组大鼠血清炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6.取右肾组织,HE染色后光学显微镜下观察各组大鼠肾组织病理形态学变化,免疫组织化学法检测各组大鼠肾小管CD14.结果 与对照组相比,DN组、Sly-L组及Sly-H组大鼠FPG、UACR、KI水平显著升高(P均＜0.01),体质量显著降低(P均＜0.01).与DN组相比,Sly-L组、Sly-H组大鼠FPG、UACR、KI水平均显著降低(P均＜0.05).DN组肾小球体积增大,部分肾小管管腔轻度或中度扩大,肾小管上皮细胞空泡样变性,可见炎性细胞浸润;与DN组相比,Sly-L组及Sly-H组肾小管和肾小球病理损伤减轻.与对照组相比,DN组、Sly-L组血清TNF-α、IL-1β、IL-6及肾小管CD14均显著升高(P均＜0.05),Sly-H组血清IL-6水平显著升高(P＜0.05).与DN组相比,Sly-L组、Sly-H组血清TNF-αα、IL-1β、IL-6及肾小管CD14均显著降低(P均＜0.05).与Sly-L组相比,Sly-H组血清TNF-oα、IL-1β、IL-6及肾小管CD14均显著降低(P均＜0.05).结论 Sly可改善DN大鼠肾损伤,其作用机制与Sly可降低DN大鼠血清炎症细胞因子TNF-α、IL-1 β、IL-6的水平并抑制肾小管CD14的表达有关.

为了解F-box成员在小麦中响应生物和非生物逆境的表达情况及作用机制,本研究自小麦抗叶锈病近等基因系TcLr15中克隆了F-box基因TaFKOR23,该基因编码一个由421个氨基酸残基组成的蛋白,N端具有F-box结构域,中间带有2个明显的Kelch结构域,属于F-box/Kelch类型基因.系统进化分析表明,TaFKOR23与粗山羊草(Aegilops tauschii Coss.)和二穗短柄草(Brachypodium distachyon(L.)P.Beauv.)中的F-box/Kelch-repeat protein OR23同源性均较高.利用qRT-PCR对接种亲和及非亲和叶锈菌、激素处理、非生物逆境胁迫后TcLr15植株中该基因的表达模式进行分析.研究结果表明,TaFKOR23基因表达受叶锈菌侵染而略升高,但在亲和与非亲和组合间的表达量无明显差异;受脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)3种激素处理后,该基因均呈先升高后降低的表达趋势,且表达量于处理后12h达到最高,MeJA对该基因的诱导表达程度略高于SA和ABA;盐胁迫处理后,除了12h外,TaFKOR23整体呈现上升的表达趋势,最高表达峰出现在处理后48 h;TaFKOR23受聚乙二醇(PEG)处理的影响较小;该基因在旗叶中的表达量远高于其他部位.利用酵母双杂交文库筛选并验证与该基因编码蛋白互作的上游靶蛋白.经文库筛选得到11类可能与TaFKOR23互作的靶蛋白,进一步回转验证及β-半乳糖苷酶检测结果表明TaFKOR23与小麦S-期激酶相关蛋白(TaSkp1)、SEC1家族运输蛋白SLY1(TaSLY1)和几丁质酶2(TaChitinase 2)均存在相互作用.研究结果为深入解析小麦中Kelch类F-box基因的功能及代谢网络奠定了基础,并拓宽了对植物中Kelch类F-box基因的功能认识.

目的 了解湖南省首例猪链球菌14型菌株的生物学性状及病原学特征.方法 采集患者的关节液接种到血琼脂平板,进行猪链球菌的分离培养,通过镜检、生化和血清凝集试验确认后,用聚合酶链反应(PCR)检测猪链球菌种特异性基因(16S rRNA)、2型荚膜多糖基因(cps2J)、14型荚膜多糖基因(cps14J)以及相关毒力基因:溶菌酶释放相关蛋白(mrp)、溶血素(sly)、纤粘连蛋白结合蛋白(fbps)、胞外因子(ef)、谷氨酸脱氢酶(gdh)、毒力相关序列or f2基因(or f2)和甘油醛-3一磷酸脱氢酶的编码基因(gapdh).结果 患者的关节液中分离到猪链球菌14型菌株,种特异性基因16S rRNA阳性,荚膜多糖基因cps2J阴性、cps14J阳性,毒力基因mrp阴性,其余sly、fbps、ef、gdh、orf2、gapdh均为阳性.结论 湖南省已经出现了猪链球菌14型的流行,并携带多种毒力基因,需密切关注其流行趋势.

目的 鉴定浙江省2005-2020年散发猪链球菌感染者分离株血清型并检测其毒力基因,了解该地区临床致病株毒力基因的分布情况与分子流行病学特征.方法 收集猪链球菌感染者临床分离株,采用传统细菌学方法及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI TOF MS)鉴定的同时,利用聚合酶链(PCR)技术检测其链球菌属(tuf)、猪链球菌种(16S rRNA)、猪链球菌7型(Cps7H)、猪链球菌9型(Cps9D)与2型猪链球菌(Cps2J)/兼荚膜毒力基因以及毒力基因:溶菌酶释放蛋白(mrp)、胞外因子(epf)、溶血素(sly)、毒力相关序列(orf2)、纤连蛋白(fbps)、谷氨酸脱氢酶(gdh)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(gapdh)等24种毒力基因携带情况.结果 28株人源分离株经综合鉴定均为2型猪链球菌,毒力基因群检测结果显示,除salKR毒力基因以及1株ZJ-31菌株外,96.43％ (27/28)的菌株均携带23种毒力基因;16S rRNA基因测序构建系统发育树,结果显示除来自2018年的ZJ-31菌株单独在另一分枝外,其它菌株同源性极高均在同一分枝.结论 浙江省十几年来散发猪链球菌病的人源分离株大多为2型猪链球菌强毒力株,遗传进化显示近年来已出现个别不同来源分枝群菌株.

背景:番茄(Solanum lycopersicum)是广泛种植的最具价值的果蔬之一,番茄晚疫病会导致其产量和品质降低.microRNAs (miRNAs)是一类内源性非编码RNA,广泛参与基因转录后调控.已有研究表明miR399家族可参与调控植物抗病过程.目的:探究番茄miR399(sly-miR399)对番茄抗晚疫病的影响.方法:构建sly-miR399的过表达和沉默载体,利用农杆菌介导在番茄叶片中瞬时表达;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测相关基因表达水平;台盼蓝染色并统计分析瞬时过表达和瞬时沉默sly-miR399的番茄叶片的病斑情况.结果:瞬时过表达sly-miR399导致其靶基因UBC24的表达量下降了75％,病程相关蛋白(pathogenesis related proteins,PRs) SlPR1、SlPR2、SlPR3和SlPR5的表达量分别上升了3.6倍、2.2倍、2.3倍和6.4倍,茉莉酸(JA)信号通路相关基因SlJAl、SlLOX1和SlLOX2的表达量分别上升了1.3倍、2.5倍和1.5倍,JA转录抑制因子SlJAZ1的表达量下降了50％,接种晚疫病菌后,叶片上相对病斑面积明显减小;瞬时沉默导致其靶基因的表达量上升了1.8倍,PRs基因的表达量分别下降了65％、82％、52％和80％,SlJA1、SlLOX1和SlLOX2的表达量分别下降了84％、50％和65％,SlJAZ1的表达量上升了1.8倍,病菌接种后叶片上相对病斑面积明显变大.结论:初步揭示了sly-miR399在番茄抗晚疫病过程中的正调控因子作用.