目的 探究2型登革病毒(DENV-2)感染人脐静脉内皮细胞(HUVECs)对细胞自噬的影响及黄芩苷(BA)抗DENV-2感染的具体作用机制.方法 HUVECs体外培养,设置对照组:HUVECs正常培养;DENV-2感染组:HUVECs+DENV-2;黄芩苷组:HUVECs+DENV-2+BA.用DENV-2感染HUVECs通过透射电镜观察自噬;Western blotting检测细胞自噬相关蛋白LC3、P62的表达,采用溶酶体红色荧光探针染色法观察DENV-2感染后HUVECs内溶酶体的pH变化;蛋白质组学筛查DENV-2感染HUVECs后差异蛋白的表达情况;使用CCK-8法测定黄芩苷对HUVECs活性的影响;RT-qPCR检测细胞内病毒RNA的复制情况;检测病毒NS1蛋白的表达情况;通过透射电镜观察细胞自噬;采用Lyso-Tracker Red染色法观察黄芩苷对DENV-2感染后HUVECs内溶酶体酸化的影响;检测细胞自噬相关蛋白ATG5、Beclin-1、LC3、P62的表达,自噬小体和溶酶体融合的关键蛋白STX17、SNAP29、VAMP8表达情况及PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达.结果 DENV-2感染可诱导细胞自噬小体的形成;DENV-2感染后LC3 Ⅱ/LC3 I表达逐渐增高,48 h达到峰值(P<0.05);p62表达水平在感染前中期无明显变化,48 h后降低(P<0.05);Lysotracker red染色结果显示DENV-2感染组红色亮点较多,且染色明亮.CCK-8结果显示50 μg/mL被视为黄芩苷对HUVECs细胞的最大无毒剂量.RT-qPCR结果显示随着黄芩苷浓度增加药物对病毒的抑制作用增强.黄芩苷可降低DENV-2 NS1蛋白的表达(P<0.001).与DENV-2组相比,经过黄芩苷(50 μg/mL)处理后,自噬减少,加入黄芩苷后抑制溶酶体酸化.黄芩苷组48 h LC3 II/LC3 I比值降低(P<0.05),48 h时p62表达增加(P<0.05).经过黄芩苷处理后DENV-2诱导的自噬相关蛋白Beclin-1、ATG 5、STX17、SNAP29和VAMP8的表达下调(P<0.01).蛋白组学结果显示PI3K-AKT通路在DENV的发病机制中可能发挥重要作用.加入PI3K抑制剂(LY294002)后,DENV-2的RNA表达水平降低,各组p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR蛋白相对表达水平的蛋白表达水平降低(P<0.01).用黄芩苷处理后,DENV-2感染组PI3K、AKT的mRNA表达水平均显著降低(P<0.05),而mTOR mRNA表达无明显变化.DENV-2感染组上调的p-PI3K、p-AKT的蛋白表达水平均降低(P<0.05),而p-mTOR表达无明显变化.DENV-2诱导的LC3、P62蛋白表达降低(P<0.05);在黄芩苷治疗组中也抑制了病毒诱导的自噬.结论 DENV-2感染可促进HUVECs细胞自噬的发生,黄芩苷可抑制DENV-2的RNA和NS1蛋白的表达,可能通过抑制自噬发生及自噬体和溶酶体融合,降低DENV-2诱导的自噬,其作用机制可能是通过PI3K/AKT信号通路调控.

目的:通过观测大鼠海马神经元线粒体自噬现象和标志物表达,探讨脾气虚的发生机制.方法:16只雄性SD大鼠随机分为正常组和脾气虚模型组(模型组),每组 8只;透射电镜观察海马神经元线粒体形态;提取海马神经元线粒体,JC-1 法检测膜电位△ψm),ELISA法检测 ATP水平,Western blot法检测不协调 51样自噬激活激酶 1(uncoordi-nated-51 like autophagy activating kinase 1,ULK1)、微管相关蛋白轻链 3(light chain 3,LC3)Ⅰ-和Ⅱ及交触融合蛋白 17(syntaxin17,STX17)表达.结采:与正常组比较,模型组线粒体数量减少,且自噬结构减少;模型组△ψm和 ATP水平明显下降,ULK1 、LC3-Ⅰ和STX17表达均显著减少,但 LC3-Ⅱ表达变化不明显.结论:海马线粒体自噬减退与脾气虚发生有关.

同型融合和蛋白质分选复合体(HOPS)由VPSll、VPS16、VPS18、VPS33、VPS39和VPS41这6种蛋白组成,能够通过膜融合机制来调节生物体内的膜泡运输.已有研究表明其可以作为融合因子来促进自噬体与溶酶体膜融合过程.为在体外确定HOPS复合体与自噬性SNARE蛋白STX17是否具有直接相互作用,首先利用PCR技术从已有质粒中扩增得到6种基因的编码序列,将其连接至pGEX 4T-1-GST或pET-His-NusA原核表达载体上,经菌落PCR初步鉴定和DNA测序无误后成功构建6种原核表达重组质粒并转化至大肠杆菌BL21(DE3);利用谷胱甘肽琼脂糖树脂与镍柱对重组蛋白进行纯化,烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶酶切掉GST或His-NusA标签,得到分子量约为105 kDa的HA-VPS 11蛋白、97 kDa的Flag-VPS16蛋白、108 kDa的HA-VPS18蛋白、70 kDa的Flag-VPS33蛋白、97 kDa的HA-VPS39蛋白和98 kDa的Flag-VPS41蛋白;通过体外GST pull-down技术对6种蛋白的功能进行验证,证实自噬性SNARE蛋白STX17和6种重组蛋白在体外均具有直接相互作用,为深入探究HOPS复合体参与自噬体与溶酶体膜融合过程中的功能及作用机制奠定实验基础.

目的 对分离自慢性肝病患者的泛耐药鲍曼不动杆菌(XDRAB)进行耐药基因、菌株分型.方法 来自于慢性肝病患者的XDRAB菌株62株,PCR法检测菌株耐药基因(OXA-51、OXA-23、GIM、OXA-58、IMP-R、VIM-2、OXA-24、VIM-1及SPMI基因),多位点序列分型(MLST)法对XDRAB菌株进行分型.结果 62株XDRAB菌株中均表达OXA-51、OXA-23、GIM基因.62株菌株中表达OXA-58、IMP-R、VIM-2、OXA-24、VIM-1及SPMI基因的分别为51、35、22、17、15、14株,未见表达SIM-1基因的菌株.62株菌株中ST381型、ST425型、ST492型、ST464型、ST191型、ST208型、ST218型分别为15、12、11、7、6、4、1株,有6株菌株出现未知ST型(STx1 ～ STx4),其中STx1型、STx2型、STx3型、STx4型分别为3、1、1、1株.结论 XDRAB菌株中表达OXA-23和GIM、OXA-58、IMP-R耐药基因.XDRAB主要ST分型为ST381、ST425和ST492.

目的 探讨香叶木素对结直肠癌细胞增殖、凋亡和迁移的影响,分析其机制是否与调控STX 17-AS 1/miR-383-5p轴有关.方法 通过细胞计数试剂盒(CCK-8)、集落形成实验、划痕愈合实验、流式细胞术、实时定量PCR(RT-qPCR)分析香叶木素(10、20、40 μmol/L)对结直肠癌细胞HCT116的活力、集落形成数、划痕愈合率、凋亡以及STX 17-AS1、miR-383-5p表达的影响.RT-qPCR分析2019年本院29例结直肠癌患者癌组织和对应癌旁组织中STX17-AS1、miR-383-5p相对水平.双荧光素酶报告实验分析STX 17-AS1和miR-383-5p的靶向关系.分别转染STX17-AS1的小干扰RNA、miR-383-5p模拟物至HCT116细胞,观察抑制STX17-AS1或过表达miR-383-5p对HCT116细胞增殖、迁移和侵袭的影响.结果 香叶木素(10、20、40 μmol/L)处理显著降低HCT116细胞活力、集落形成数、划痕愈合率(P＜0.05),增加细胞凋亡率(P＜0.05),降低STX17-AS1表达水平(P＜0.05),增加miR-383-5p表达水平(P＜0.05).结直肠癌组织中STX17-AS1的表达水平较癌旁组织显著升高(P＜0.05),miR-383-5p的表达水平较癌旁组织显著降低(P＜0.05).STX17-AS1与miR-383-5p直接结合.抑制STX 17-AS1表达显著降低HCT116细胞活力、集落形成数、划痕愈合率(P＜0.05),增加细胞凋亡率(P＜0.05),增加miR-383-5p表达水平(P＜0.05).过表达miR-383-5p显著降低HCT116细胞活力、集落形成数、划痕愈合率(P＜0.05),增加细胞凋亡率(P＜0.05).过表达STX17-AS1或抑制miR-383-5p表达显著减弱香叶木素对HCT116细胞活力、集落形成数、划痕愈合率和凋亡率的影响(P＜0.05).结论 香叶木素通过下调STX 17-AS 1/miR-383-5p轴可抑制结直肠癌细胞增殖和迁移,诱导细胞凋亡.

目的 分析孕中期羊水游离RNA(AfcfRNA)转录组,筛选神经发育共表达关键基因.方法 利用基因共表达网络分析,建立AfcfRNA转录组的基因共表达网络模块.筛选各共表达模块中的神经特异性基因,建立神经系统特异性共表达模块.利用基因间相互作用筛选神经组织特异性共表达模块中的关键基因.结果 通过加权基因共表达网络分析共建立27个以颜色命名的共表达模块,在Human Protein Atlas数据库中筛选到832个神经组织特异性基因.在蓝色、棕色、蓝绿色以及黄色模块中富集到前脑发育、神经突触组装和功能、神经递质释放过程、轴突发生以及学习和记忆过程相关的GO术语.通过基因间相互作用以及基因在孕中期的平均表达量分析,共发现蓝色模块(SLC18A3、TACR3、SYT2)、棕色模块(SSTR5、STX1A、SNAP25、GHSR、SSTR4、GABBR2)、蓝绿色模块(DRD2、SLC32A1、GNG3、OPN4、PENK)以及黄色模块(RAB3A、HCRT、GRM5)中的17个关键基因.结论 该研究获得了神经系统发育密切相关的并且具有共表达关系的关键基因,可作为潜在的产前诊断中监测神经系统发育的标志物.

目的 研究苯并(a)芘(BaP)影响人脐静脉内皮细胞(HUVEC)自噬的机制.方法 HUVEC经BaP(2.5、5、10μmol/L)处理24h后,分别采用间接免疫荧光法、Western blot、吖啶橙染色和单丹磺酰尸胺染色等技术方法,检测自噬体及其内容物降解、目标蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)、选择性自噬接头蛋白p62、Beclin-1、自噬相关蛋白5(Atg5)、Atg7、Atg12、组织蛋白酶B(CTSB)、组织蛋白酶D(CTSD)、突触融合蛋白17(STX17)、溶酶体关联膜蛋白2(LAMP2)表达、溶酶体数量与功能,及相关上游关键调控蛋白丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(Akt)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)、转录因子EB(TFEB)磷酸化水平.结果 BaP暴露组HUVEC内,检测结果显示:(1) LC3 puncta水平、LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ比率增加,自噬起始关键蛋白(Beclin-1、Atg5、Atg7、Atg12)表达升高,Akt蛋白磷酸化则明显降低;(2) p62 puncta和p62蛋白水平明显升高;(3)溶酶体数量增加,并伴随着溶酶体特征性水解酶(CTSB、CTSD)表达升高,相应地ERK、TFEB磷酸化水平增加;(4)调控自噬体与溶酶体融合的关键蛋白STX17与LAMP2降低.结论 BaP通过降低STX17与LAMP2表达水平,阻抑了HUVEC正常的自噬流.

目的 探究突触融合蛋白17(syntaxin17,STX17)在Aβ诱导的小鼠海马神经细胞死亡中的作用.方法 基于WGCNA方法选取与阿尔茨海默病显著相关的基因,与自噬基因库和SNARE家族基因取交集筛选关键基因;C57BL/6小鼠海马组织中注射浓度为1 g/L的Aβ31-35和使用终浓度为5 μmol/L Aβ31-35处理HT22海马神经细胞,采用Western Blot检测STX17、LC3 Ⅱ、P62的蛋白表达情况;CCK-8法检测Aβ31-35处理的HT22海马神经细胞存活率;慢病毒介导HT22海马神经细胞STX17过表达后,Western blot检测Aβ31-35处理后LC3 Ⅱ、P62的蛋白表达情况.结果 与阿尔茨海默病显著相关的Salmon和Black模块分别与自噬基因库和SNARE亚家族取交集获取关键基因STX17.与对照组比较,经Aβ31-35处理后,HT22细胞细胞存活率[(81.81±11.65)％]明显下降(P＜0.05),小鼠海马组织和HT22细胞中STX17蛋白表达均显著降低(P＜0.05),LC3 Ⅱ和P62蛋白表达均显著升高(P＜0.05);慢病毒介导HT22海马神经细胞STX17过表达后,显著逆转Aβ31-35诱导的LC3 Ⅱ、P62的蛋白表达上调(P＜0.05),并改善Aβ31-35诱导的HT22海马神经细胞存活率下降[(101.91±13.81)％vs(79.21±8.75)％,P＜0.05].结论 STX17通过促进自噬来改善Aβ诱导的小鼠海马神经细胞死亡.

目的 探讨登革2型病毒(DENV-2)对原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs)自噬小体形成、自噬体-溶酶体融合及溶酶体降解途径的影响.方法 于DENV-2感染HUVECs 36 h时,采用透射电子显微镜观察HU-VECs中自噬小体形成情况;于DENV-2感染HUVECs 12、24、36及48 h时,采用Western blot检测HUVECs中的微管相关蛋白轻链3Ⅱ(LC3-Ⅱ)表达水平;于DENV-2感染2、4、6、8、10、12、18、24、30、36及48 h时,采用West-ern blot检测HUVECs中自噬选择性底物p62蛋白表达水平;于DENV-2感染后24、36及48 h,采用Western blot检测HUVECs中突触融合蛋白17(STX17)、突触体相关蛋白29(SNAP29)、囊泡相关膜蛋白8(VAMP8)的表达水平;采用溶酶体红色荧光探针(Lysotracker red)染色法观察DENV感染后HUVECs内溶酶体的pH变化;DENV-2感染HUVECs 24、36及48 h给予自噬抑制剂CQ处理或不处理的HUVECs中LC3-Ⅱ蛋白表达水平.结果 透射电子显微镜结果显示,DENV-2感染可诱导自噬小体的形成;Western blot结果显示,DENV感染后12、24、36及48 h时LC3-Ⅱ表达显著增高(P<0.05);p62表达水平在感染早中期无明显变化,30 h后显著增高(P<0.05),36 h到达峰值;DENV-2感染后各时间点STX17蛋白表达水平均降低(P<0.05);感染24 h时,SNAP29、VAMP8蛋白水平增高(P<0.05),但随后36 h和48h蛋白表达均下降(P<0.05);Lysotracker red染色结果和Western blot结果显示DENV-2感染阻碍了溶酶体正常酸化.结论 DENV-2感染可激活HUVEC自噬,诱导自噬小体的形成,但DENV-2阻碍了自噬-溶酶体融合,抑制溶酶体正常酸化.

宫颈癌是全世界女性发病率及死亡人数第4 位的癌症[1] ,高危人乳头瘤病毒( high risk-human papilloma virus,HR-HPV)持续感染可导致女性患宫颈癌[2].全世界每年新发宫颈癌病例中近1/3发生在中国,在中国宫颈癌仍是重要的公共卫生问题[3].因此,深入研究HR-HPV引起宫颈癌变的机制对于减少宫颈癌变的发生发展有非常重要的临床意义.