目的:探讨超细炭黑诱导人支气管上皮细胞（BEAS-2B细胞）自噬和凋亡的分子机制，并研究N-乙酰半胱氨酸（NAC）对超细炭黑致BEAS-2B细胞氧化损伤的干预效果和机制。方法:于2023年3月，以BEAS-2B细胞为研究对象，构建超细炭黑暴露气道体外模型。实验先设对照组和3个炭黑暴露剂量组（50、100、200 μg/ml），用相应浓度超细炭黑处理细胞24 h；再设对照组2、NAC+对照组、100 μg/ml炭黑暴露组、NAC+暴露组，相应组别分别用2 mmol/L NAC处理细胞1 h和100 μg/ml超细炭黑处理24 h。以CCK-8法检测细胞活力；化学荧光法检测细胞内活性氧（ROS）水平；比色法检测超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和过氧化氢酶（CAT）活力及丙二醛（MDA）含量；荧光定量PCR法和免疫印迹法测定自噬相关基因[Atg5、Atg7、Beclin1、微管相关蛋白轻链3B（LC3B）、p62、溶酶体关联膜蛋白2（LAMP2）]、凋亡相关基因[B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、半胱天冬酶3（Caspase3）、半胱天冬酶9（Caspase9）、多聚ADP核糖转移酶1（PARP1）] mRNA和蛋白相对表达；流式细胞术测定细胞凋亡情况。结果:与对照组比较，50、100、200 μg/ml炭黑暴露剂量组BEAS-2B细胞相对存活率明显降低，ROS和MDA水平明显增加，而SOD、GSH-Px和CAT活力明显降低（ P<0.05），超细炭黑暴露剂量与细胞相对存活率、ROS和MDA水平以及SOD、GSH-Px和CAT活力呈明显相关性（ rs= -0.755、0.826、0.934、-0.810、-0.880、-0.840， P<0.05）。与对照组比较，50、100、200 μg/ml炭黑暴露剂量组Atg5、Atg7、Beclin1、LC3B、p62、LAMP2、Bax、Caspase3、Caspase9、PARP1 mRNA和Atg5、Atg7、Beclin1、LC3BⅡ、p62、LAMP2、Bax、裂解半胱天冬酶3（C-Caspase3）、裂解半胱天冬酶9（C-Caspase9）、裂解多聚ADP核糖转移酶1（C-PARP1）蛋白相对表达水平以及LC3BⅡ/LC3BⅠ比值明显增加，而Bcl-2 mRNA和蛋白相对表达水平明显降低（ P<0.05），超细炭黑暴露剂量与上述指标的变化呈明显相关性（ rs=0.892、0.879、0.944、0.892、0.828、0.880、0.814、0.794、0.931、0.918、0.813、0.866、0.774、0.695、0.918、0.761、0.794、0.944、0.833、0.866、0.905、-0.886、-0.748， P<0.05）。与100 μg/ml炭黑暴露组比较，NAC+暴露组细胞相对存活率及SOD、GSH-Px和CAT活力明显增加，ROS和MDA水平明显降低，LC3B、p62和Caspase3 mRNA和蛋白相对表达水平及LC3BⅡ/LC3BⅠ比值明显降低，差异均有统计学意义（ P<0.05）。与对照组比较，50、100、200 μg/ml炭黑暴露剂量组BEAS-2B细胞凋亡率明显增加（ P<0.05），超细炭黑暴露剂量与细胞凋亡率呈明显正相关（ rs=0.944， P<0.05）。而与100 μg/ml炭黑暴露组比较，NAC+暴露组细胞凋亡率明显降低，差异有统计学意义（ P<0.05）。 结论:细胞自噬和凋亡可能是超细炭黑诱导BEAS-2B细胞氧化损伤重要的病理生理学机制。NAC可以通过调控氧化应激及级联的自噬和凋亡通路而减轻超细炭黑所致BEAS-2B细胞损伤的发生。

目的:探究白术内酯-1（ATL-Ⅰ）对矽肺患者肺泡巨噬细胞的作用。方法:于2019年12月，利用随机抽样的方法，选择2019年7至9月在中国煤矿工人北戴河疗养院进行治疗的12例男性矽肺患者，收集其肺泡巨噬细胞分为对照组、ATL-Ⅰ组（100 μmol/L）以及二甲基亚砜（DMSO）组（100 μmol/L）。采用酶联免疫吸附试验检测炎症因子白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）的表达水平，用蛋白免疫印迹法检测自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3（LC3）、自噬底物蛋白p62、溶酶体关联膜蛋白2（LAMP2）、凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3和核因子κB（NF-κB）及其磷酸化型（p-NF-κB）的表达水平。结果:与对照组和DMSO组比较，ATL-Ⅰ组肺泡巨噬细胞IL-1β、IL-6和TNF-α的表达明显降低（ P<0.05），且p-NF-κB、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值也明显降低（ P<0.05）；但ATL-Ⅰ组NF-κB、LAMP2、p62以及Cleaved caspase-3表达与对照组和DMSO组差异均无统计学意义（ P>0.05）；对照组与DMSO组的上述指标表达差异均无统计学意义（ P>0.05）。 结论:ATL-1可能减少矽肺患者肺泡巨噬细胞炎症因子的释放，抑制自噬的活性，但未能降低其凋亡水平。

探索柠檬精油中发挥抗肿瘤作用的活性物质以及抑制头颈癌细胞SCC15 和CAL33 增殖的分子机制,该研究利用噻唑蓝[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay,MTT]鉴定出抑制头颈癌细胞增殖的活性物质为柠檬醛,并测定了柠檬醛抑制头颈癌细胞和正常细胞的IC50;同时,利用 5-ethynyl-2'-deoxyuridine(EdU)实验检测柠檬醛对头颈癌细胞增殖率的影响,通过克隆形成实验检测柠檬醛对头颈癌细胞体外肿瘤球形成的影响.通过流式细胞术检测柠檬醛对头颈癌细胞周期阻滞和凋亡诱导情况;采用蛋白印迹检测柠檬醛对头颈癌细胞周期和凋亡相关蛋白表达水平的影响.结果表明柠檬醛可有效抑制头颈癌细胞的生长增殖,具有抗肿瘤活性,其抑制CAL33 和SCC15 的半数抑制浓度分别为 54.78、25.23 μg·mL-1.进一步分析发现细胞周期相关蛋白 S期激酶关联蛋白 2(SKP2)、原癌基因(C-MYC)、细胞周期依赖性激酶 1(CDK1)、周期蛋白B(cyclin B)均呈下调趋势,细胞周期阻滞于G2/M期.此外,柠檬醛能够促使细胞凋亡相关蛋白半胱天冬蛋白酶-3(caspase-3)、半胱天冬蛋白酶-9(caspase-9)和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)剪切形式呈现上调趋势,而且使自噬相关蛋白微管相关蛋白 1 轻链 3B(LC3B)、泛素结合蛋白(P62)、自噬效应蛋白Beclin1(Beclin1)和溶酶体相关膜蛋白 1(LAMP1)表达呈上调趋势,暗示柠檬醛诱导头颈癌细胞发生凋亡和激活自噬.利用双标质粒系统mCherry-GFP-LC3 分析发现柠檬醛阻碍自噬体和溶酶体融合,使自噬流进程受阻.因此,柠檬精油中发挥抗头颈癌细胞增殖的主要活性成分是柠檬醛,该成分对头颈癌细胞具有显著的抑制作用,其分子机制可能是柠檬醛通过阻滞细胞周期,诱导细胞发生凋亡和自噬,最终抑制肿瘤细胞增殖.

目的 观察"秩边透水道"针刺对弱精子症模型小鼠生殖功能的影响,并探讨可能作用机制.方法 将42只C57BL/6雄性小鼠随机分成空白组、模型组和针刺组各14只.模型组和针刺组小鼠给予环磷酰胺30 mg/(kg·d)腹腔注射7天建立弱精子症小鼠模型,空白组腹腔注射7天0.9％氯化钠溶液10 ml/(kg·d).造模成功后,针刺组小鼠给予"秩边透水道"针刺,每日 1次,每次20 min,每周6次,共3周;其余两组只进行固定而不针刺.日常观察各组小鼠的一般情况,并记录干预前后体质量变化.干预结束次日每组随机取6只雄鼠检测精子质量以及睾丸、附睾质量并计算相应指数;ELISA法检测血清中睾酮(T)、促卵泡生成素(FSH)、促黄体生成激素(LH)含量;HE染色和TUNEL染色观察睾丸和附睾病理组织形态和细胞凋亡情况;荧光定量PCR法和Western blot法分别检测睾丸组织死亡相关因子(Fas)、Fas相关死亡域蛋白(FADD)、B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)、B淋巴细胞瘤2关联X的蛋白(Bax)和半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)mRNA和蛋白表达变化.将每组剩余的8只雄鼠与处于动情周期的同品系雌鼠进行1∶1合笼,检测合笼后每组小鼠的妊娠率和每胎胚胎数量.结果 与空白组比较,模型组小鼠体重减轻,睾丸质量、睾丸指数、附睾质量和附睾指数下降,精子总数、精子活力和精子活率下降,血清T、FSH和LH含量下降,细胞凋亡率升高,Fas、FADD、Bax和Caspase-3 mRNA和蛋白表达水平提高,Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平降低(P＜0.01),睾丸组织和附睾组织病理形态异常,生精小管排列紊乱,管腔内生精细胞数量减少;合笼后雌鼠的妊娠率和每胎胚胎数量降低(P＜0.01).与模型组比较,针刺组小鼠睾丸质量、睾丸指数、附睾质量、附睾指数、精子总数、精子活力和精子活率均提高,血清T、FSH和LH含量提高,细胞凋亡量降低,Fas、FADD、Bax和Caspase-3 mRNA和蛋白表达水平降低,Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平提高(P＜0.05或P＜0.01),睾丸组织和附睾组织形态改善,生精小管排列紧密,管腔内生精细胞数量增加;合笼后雌鼠的妊娠率和每胎胚胎数量提高(P＜0.01).结论 "秩边透水道"针刺可以改善弱精子症模型小鼠睾丸组织细胞凋亡,提高生殖功能,其机制可能与调节睾丸组织外在膜受体途径(Fas介导的途径)和内在线粒体途径(Bcl-2/Bax调控的途径)的关键因子有关.

背景:研究发现胰高血糖素样肽1及其类似物具有显著的神经保护作用,并且已有部分药物应用到阿尔茨海默病临床三期研究阶段,然而其发挥神经保护作用的具体机制尚不明确,有待进一步探讨阐明.目的:拟通过生物信息学和网络药理学分析方法筛选出阿尔茨海默病发病机制的相关基因,以及索马鲁肽(一种胰高血糖素样肽1受体激动剂)治疗阿尔茨海默病的相关靶点,对两者进行综合分析挑选出潜在靶点基因,并在细胞水平加以验证.方法:利用DisGeNET数据库筛选出阿尔茨海默病患者与健康人群的差异基因,利用PubChem在线数据库得到索马鲁肽的化学结构式和2D结构图,利用DAVID在线数据库进行GO/KEGG富集分析,利用STRING数据库进行蛋白互作网络的构建,利用HPA数据库判断目的蛋白在人体各组织中的分布特点,最后使用蛋白印迹技术和免疫荧光技术检测索马鲁肽干预HT22细胞之后的蛋白表达情况.结果与结论:①利用DisGeNET数据库内数据得到3 374个阿尔茨海默病患者与健康人群的差异基因,同时获得索马鲁肽潜在药物的101个靶基因,取两者交集得到23个相关基因;结合蛋白互作网络从中筛选出10个关键基因,分别是沉默信息调节因子1(SIRT1)、CASP9、CCND1、CASP1、KEAP1、DLG4、CASP4、GRB2、GRIA1、EDNRA;②GO基因功能分析显示关键基因主要富集在:半胱氨酸型内肽酶的正向调节活动,蛋白溶解的正向调节,半胱氨酸型内肽酶的正向调节,涉及凋亡活动过程的细胞质部分,AMPA谷氨酸受体复合物,炎症复合物,CARD结构域结合,半胱氨酸型内肽酶活性,半胱氨酸型内肽酶活性参与凋亡过程;KEGG信号通路分析结果主要为:结直肠癌,非小细胞癌,子宫内膜癌,上述均与免疫浸润、炎症、自噬凋亡相关;此外,根据关键基因的关联度排名及在HPA在线数据库不同组织中的分布情况,挑选出最显著的差异基因为SIRT1;③细胞实验显示,SIRT1蛋白表达在β-淀粉样蛋白1-42干预后的HT22细胞中显著下调,而经过索马鲁肽处理后明显上升;④结果显示,SIRT1可能是索马鲁肽治疗阿尔茨海默病的靶点基因.

目的:探讨AMP活化蛋白激酶(AMPK)/转录因子EB(TFEB)介导的溶酶体生物发生在限时进食(TRF)对非酒精性脂肪性肝炎(NASH)小鼠肝脏及油酸(OA)诱导的人肝母细胞瘤HepG2细胞损伤的缓解作用及其分子机制.方法:(1)用高脂高胆固醇饮食构建小鼠NASH模型,将18只C57BL/6J小鼠分为正常对照(NC)组、模型(model)组和TRF组,每组6只.饲养10周后麻醉小鼠,摘眼球取血,分离血清,检测小鼠血清中的总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的水平;收集小鼠肝脏,计算肝脏系数,检测肝脏TC和TG的水平.苏木精-伊红(HE)和Masson马松染色观察肝脏形态学变化;Western blot法检测肝脏溶酶体关联膜蛋白1(LAMP1)、AMPK、p-AMPK和核TFEB、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素1β(IL-1β)蛋白表达水平.(2)用OA干预HepG2细胞建立肝损伤模型,用血清剥夺模拟禁食条件.将HepG2细胞分为对照(control)组、血清剥夺(FBS-)组、OA组和OA+FBS-组;用siRNA敲低TFEB探讨TFEB介导的溶酶体生物发生与肝细胞脂质积累和肝损伤的关系;用AMPK抑制剂化合物C(CC)抑制AMPK活性研究AMPK与TFEB介导的溶酶体生物发生的关系.油红O染色检测肝细胞脂质积累;试剂盒检测肝细胞TG、TC、ALT和AST水平;Western blot法检测肝细胞LAMP1、AMPK、p-AMPK和核TFEB蛋白表达水平.结果:(1)TRF干预显著降低了NASH小鼠的血清TC、TG、ALT和AST水平及肝脏中IL-1β、TNF-α、TG和TC的表达,缓解了肝组织中的脂肪变性和炎症浸润(P<0.05);(2)血清剥夺干预减少了OA诱导的HepG2细胞中的脂滴数量以及TG、ALT和AST水平(P<0.01);(3)Western blot结果显示,TRF干预后NASH小鼠肝脏中TFEB核易位水平、LAMP1蛋白水平和AMPK磷酸化水平显著升高(P<0.01);血清剥夺干预后,OA诱导的HepG2细胞中TFEB核易位水平、LAMP1蛋白水平和AMPK磷酸化水平显著增加(P<0.01);(4)siRNA干预后,TFEB和LAMP1蛋白水平降低,血清剥夺对OA组脂肪积累和肝损伤的改善作用被显著削弱(P<0.05);(5)CC干预后,AMPK磷酸化水平、LAMP1蛋白水平和TFEB核易位水平显著降低(P<0.01).结论:(1)TRF能够减轻NASH小鼠肝脏的脂质积累和炎症;(2)TRF对NASH小鼠肝脏的有益作用可能与其促进AMPK/TFEB介导的溶酶体生物发生有关.

目的 探讨小檗碱减轻造影剂肾病(CIN)的作用及其可能机制.方法 30只SD大鼠随机均分为对照组(A组)、小檗碱组(B组)、CIN模型组(C组)、小檗碱治疗组(D组)和阿托伐他汀治疗组(E组).检测大鼠SCr和BUN水平,HE染色评估肾小管损伤情况,测定肾脏组织中谷胱甘肽(GSH)含量,透射电子显微镜下观察小鼠肾脏组织线粒体损伤,TUNEL染色评估肾脏细胞凋亡情况,Western blot法检测Bcl-2、谷胱甘肽过氧化酶4(GPX4)、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、Kelch样ECH关联蛋白1(KEAP1)、核因子2相关因子2(Nrf2)和叉头蛋白O3A(FO)XO3A)蛋白表达,免疫组织化学染色检测SLC7A11、GPX4、Nrf2和FOXO3A的表达.结果 C组SCr和BUN水平、肾脏细胞凋亡、肾小管损伤组织学评分高于A组和B组(P＜0.01);而D组和E组SCr和BUN水平、肾脏细胞凋亡、肾小管损伤组织学评分低于C组(P＜0.05或P＜0.01).HE染色结果显示,C组肾小管闭塞,并伴随大量肾小管结构破坏和溶解,细胞内可见空泡样变性;D组肾小管结构较少被破坏,细胞空泡样变性减少.C组GSH含量少于A组(P＜0.05);而D组GSH含量高于C组(P＜0.05).透射电子显微镜下可见C组线粒体体积缩小、膜密度增高、嵴数量减少,而D组和E组线粒体形态、嵴数量得到恢复,线粒体体积趋于正常,并可见自噬小体和自噬溶酶体形成.C组GPX4、Bcl-2和FO)XO3A蛋白表达低于A组和B组(P＜0.01);与C组相比,D组Bcl-2、GPX4、SLC7A11、Nrf2和FOXO3A蛋白表达增加,KEAP1蛋白表达降低(P＜0.05或P＜0.01).结论 小檗碱通过促进KEAP1/Nrf2/FOXO3A信号通路的活化抑制铁死亡,进而减轻碘佛醇诱导的大鼠CIN.

目的 探索桃红四物汤(THD)改善紫杉醇(PTX)导致的大鼠外周神经损伤的作用机制.方法 考察THD(1 g/mL含药血清)、PTX(0.1 μmol/L)单用和联用下对施万细胞系RSC96细胞增殖率以及自噬溶酶体关联膜蛋白2(LAMP2)、自噬标记蛋白酵母Atg6同源物(Beclin1)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)表达的影响,并与自噬促进剂雷帕霉素和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)进行比较.考察THD高、低剂量对PTX导致的外周神经损伤模型大鼠坐骨神经中髓鞘碱性蛋白质(MBP)、鞘磷脂蛋白(MPZ)、S100钙结合蛋白(S100)、LAMP2、Beclin1、PI3K、Akt、mTOR表达的影响.结果 THD+PTX作用下RSC96细胞增殖率显著高于PTX单用;THD+PTX、THD+3-MA作用下RSC96细胞中LAMP2、Beclin1蛋白的表达显著高于PTX、3-MA单用,PI3K、Akt、mTOR蛋白的表达显著低于PTX、3-MA单用(P＜0.05).与模型组相比,THD高、低剂量组大鼠坐骨神经中MBP、MPZ、S100、LAMP2、Beclin1蛋白表达均显著升高,PI3K、Akt、mTOR蛋白表达均显著降低(P＜0.05).结论 THD可能通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路来激活施万细胞自噬,从而改善PTX导致的外周神经损伤.

目的 研究不明原因反复流产患者蜕膜组织CD4、CD8免疫细胞的局部表达及与TM、PAI-1、F1+2、D-二聚体等凝血相关因子的关联性,为不明原因流产患者治疗提供帮助.方法 采用细胞免疫芯片技术对不明原因流产患者50例子宫蜕膜组织进行CD4、CD8细胞计数并计算CD4/CD8比值;酶联免疫吸附试验方法测定患者血浆血栓调节蛋白(TM)、纤溶酶原激活抑制物-1(PAI-1)、凝血酶原片段F1+2;全自动免疫荧光分析法测定D二聚体(D-dimer,D-D)因子浓度.同时以正常妊娠无流产征兆主动要求人工流产的50人为对照组,比较上述指标在两个群体中的表达,并进行对比分析研究.结果 与对照组比较,患者蜕膜组织CD4水平及CD4/CD8比值均下降,CD8水平呈高表达,血浆TM、PAI-1、F1+2因子呈高表达,D-D呈低表达状态.两组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 反复流产患者蜕膜组织局部免疫功能表达异常,血液处于一定程度的高凝状态而纤溶系统受损.修复上述状态可对治疗不明原因反复流产患者提供新思路.

目的 探究过表达滋养细胞中乙酰肝素酶(HPSE)对细胞因子表达的影响,并且初步预测HPSE对滋养细胞作用的潜在分子机制.方法 选择早孕期人绒毛膜滋养细胞株HTR8/SVneo为研究对象,并构建HPSE过表达稳定转染HTR8/SVneo滋养细胞株,纳入检验组,以及HPSE正常表达稳定转染HTR8/SVneo滋养细胞株,纳入对照组.采用细胞因子抗体芯片半定量检测,对检验组和对照组滋养细胞株中343种细胞因子的变化情况进行检测.应用Image J软件分析和找出差异细胞因子蛋白.采用Western blotting检测2组滋养细胞株中表达水平差异最大的细胞因子AXL受体酪氨酸激酶表达水平,以验证细胞因子抗体芯片半定量检测结果 .通过STRING蛋白数据库构建蛋白相互作用关系网络,并应用The Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery(DAVID)在线生物信息学分析软件,进行基因本体(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路分析.结果 ①细胞因子抗体芯片半定量检测结果显示,与对照组滋养细胞株相比,检验组滋养细胞株过表达HPSE后,其细胞因子表达下降,并且检验组与对照组滋养细胞株中细胞因子蛋白表达水平比值<0.6667的细胞因子,即差异细胞因子共计15种,分别为AXL、细胞间黏附分子(ICAM)1、TEK受体酪氨酸激酶、尿激酶型纤溶酶原激活物受体(PLAUR)、金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)2、基质金属蛋白酶(MMP)9、淋巴细胞激活基因(LAG)3、肿瘤坏死因子受体超家族成员(TNFRSF)1B、TNFRSF1A、细胞毒性和调节性T细胞分子(CRTAM)、TIMP4、人血小板反应蛋白(THBS)1、白细胞介素17受体B(IL17RB)、连接黏附分子样蛋白(AMICA)及C-C类趋化因子16(CCL16).②Western blotting检测结果显示,检验组滋养细胞株中AXL蛋白表达水平明显低于对照组滋养细胞株,并且差异有统计学意义(t=—6.931,P=0.020),这与细胞因子抗体芯片半定量检测结果一致.③通过STRING蛋白数据库分析结果发现,HPSE可通过血管内皮生长因子(VEGF)A,肿瘤蛋白p53(TP53)和CD44与MMP9产生关联,而MMP9又可直接或者间接与除LAG3、CCL16和IL17RB之外的其他12种差异细胞因子相关联,从而建立相互作用关系网络图.④细胞因子GO功能富集分析结果发现,差异细胞因子主要涉及细胞凋亡负调控和细胞外基质(ECM)分解等41个生物学过程.KEGG信号通路分析结果显示,差异细胞因子主要涉及癌症蛋白多糖信号通路和肿瘤坏死因子信号通路等6条信号通路.结论 过表达HPSE可调控滋养细胞中细胞因子的表达,可能通过MMP9参与的癌症蛋白多糖信号通路影响滋养细胞的生物学功能.本研究结果可为后续研究HPSE对滋养细胞相关疾病影响,提供研究方向和研究基础.