目的:探讨通过诱导蛋白质广泛去类泛素化修饰途径抑制子宫内膜癌的干性维持潜能，达到子宫内膜癌侧群细胞化疗增敏的目的。方法:流式细胞术分选培养CD133 +CD44 +的KLE子宫内膜癌侧群细胞克隆球，Western blot法检测小泛素相关修饰蛋白1(SUMO1)及肿瘤侧群细胞干性维持基因八聚体结合转录因子4(Oct4)和性别决定区Y-box2(Sox2)蛋白的表达情况。慢病毒介导KLE侧群细胞稳定转染SUMO特异性蛋白酶1(SENP1)基因，Western blot法检测SENP1、SUMO1、Oct4和Sox2的蛋白表达；比较过表达与未过表达SENP1基因的KLE侧群细胞克隆形成率，流式细胞术检测细胞周期变化，四甲基偶氮唑蓝实验和流式细胞术检测子宫内膜癌侧群细胞对顺铂的化疗敏感性，子宫内膜癌荷瘤鼠模型检测SENP1过表达对顺铂的化疗敏感性影响。 结果:CD133 +CD44 +和CD133 -CD44 -子宫内膜癌KLE细胞克隆形成率分别为(23.64±5.03)%和(4.64±1.25)%，差异有统计学意义( P＝0.003)，CD133 +CD44 +子宫内膜癌KLE细胞中SUMO1、Oct4和Sox2蛋白表达水平高于CD133 -CD44 -子宫内膜癌KLE细胞(均 P<0.05)。与未转染SENP1基因的KLE侧群细胞比较，SENP1过表达的KLE侧群细胞SUMO1、Oct4、Sox2蛋白表达水平降低，细胞克隆形成率由(25.67±5.44)%下降至(7.46±1.42)%，细胞周期发生由G 0/G 1期向G 2期的偏移，顺铂半数抑制浓度由(55.46±6.14) μg/ml下降至(11.55±3.12) μg/ml，细胞凋亡率由(9.76±2.09)%上升至(16.79±3.44)%，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。过表达SENP1能够降低KLE侧群细胞增殖能力，增加化疗敏感性。 结论:通过过表达SENP1能够诱导蛋白质去SUMO化修饰，抑制子宫内膜癌侧群细胞的干性维持潜能，进而增强其化疗敏感性。

目的:研究小泛素相关修饰物(small ubiquitin-related modifier,SUMO)修饰对 SPOP(speckle type BTB/POZ protein)蛋白水平和细胞定位的影响,并尝试在肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)中探讨SUMO特异性蛋白酶1(sentrin-specific proteases 1,SENP1)和SPOP之间的相关性.方法:利用野生型(wild type,WT)和Senp1敲除的小鼠胚胎成纤维细胞研究Senp1对Spop蛋白水平和细胞定位的影响,并通过比较外源WT-Spop和Spop的SUMO修饰位点突变体的蛋白表达量,进一步确认SUMO修饰对Spop蛋白水平的影响.后续通过邻位连接技术(proximity ligation assay,PLA)研究WT-Spop及其SUMO修饰位点突变体与SUMO1的结合能力.最后通过ccRCC患者的RNA表达数据和ccRCC细胞系探讨SENP1和SPOP在ccRCC中的相关性.结果:Senp1敲除下调小鼠胚胎成纤维细胞中Spop的蛋白量和稳定性,但不影响其细胞核定位.突变Spop的SUMO修饰位点后,其与Sumo1的结合能力下降,蛋白量也有所降低.SENP1和SPOP的表达在ccRCC中呈正相关.结论:Senp1通过去SUMO化修饰稳定Spop蛋白,SENP1和SPOP的表达在ccRCC中呈正相关.

目的 探讨小泛素样修饰(SUMO)特异性蛋白酶 1(SENP-1)对慢性间歇性低氧(CIH)诱导大鼠心肌损伤的影响及机制.方法 将 32 只雄性 SD 大鼠分为对照组、CIH组、阴性对照腺相关病毒干预(AAV-shNC)组和SENP-1 shR-NA腺相关病毒干预(AAV-shSENP-1)组,每组8 只.CIH诱导6 周后,进行超声心动图检查;ELISA检测血清中肌钙蛋白I(cTNI)、肌酸激酶MB同工酶(CKMB)、肌红蛋白(Mb)、乳酸脱氢酶(LDH)和心肌组织中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平;HE染色观察心肌组织病理变化;DCFH-DA 荧光探针标记法检测心肌组织活性氧(ROS)水平;试剂盒法检测心肌组织中低氧诱导因子-1α(HIF-1α)蛋白SUMO化水平;qRT-PCR和Western blot法检测心肌组织SENP-1 和HIF-1α mRNA及蛋白表达水平.结果 与对照组比较,CIH组大鼠心肌组织病理损伤严重,左心室舒张阶段末期内径(LVEDD)、左心室收缩阶段末期内径(LVESD)及血清 cTNI、CKMB、Mb 和 LDH 水平均升高(P<0.05),心肌组织中ROS、MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α水平及 SENP-1 和 HIF-1α mRNA 及蛋白表达水平升高(P<0.05),而左心室射血分数(LVEF)、左心室短轴缩短率(LVFS)及血清GSH和SOD水平降低(P<0.05),心肌组织HIF-1α蛋白SUMO化水平降低(P<0.05).与CIH组比较,AAV-shSENP-1 组大鼠心肌组织病理损伤减轻,LVEDD、LVESD 及血清 cTNI、CKMB、Mb 和 LDH 水平降低(P<0.05),心肌组织中 ROS、MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平及SENP-1 和HIF-1α mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.05),LVEF、LVFS和血清GSH、SOD水平升高(P<0.05),心肌组织HIF-1α蛋白SUMO化水平升高(P<0.05).结论 抑制SENP-1 表达可减轻CIH诱导的大鼠心肌炎症和氧化应激水平,改善心肌损伤和心功能障碍,其作用机制可能与提高HIF-1α SUMO化水平,进而抑制HIF-1α表达有关.

目的:探讨小泛素相关修饰物(small ubiquitin-related modifier,SUMO)特异性蛋白酶1(SUMO specific protease 1,SENP1)和ERα在Ⅰ型子宫内膜癌中的表达,并分析两者之间的相互关系.方法:收集Ⅰ型子宫内膜癌组织及其配对癌旁组织各50例,采用免疫组织化学法检测SENP1蛋白及雌激素受体(ERα)的表达,分析其表达与患者临床病理参数的关系.结果:Ⅰ型子宫内膜癌中SENP1蛋白在癌旁组织中的表达明显高于肿瘤组织.SENP1蛋白在高分化肿瘤中的表达明显高于低分化肿瘤组织.SENP1阳性表达与ERa表达呈正相关,而与患者的年龄、肿瘤浸润的深度、肿瘤分期及淋巴结转移无关.结论:SENP1在Ⅰ型子宫内膜癌的发生、发展中发挥重要作用,有望成为治疗子宫内膜癌的新靶点.

SUMO蛋白酶(Ulp1)是切割小分子泛素修饰(SUMO)融合蛋白获得天然N端靶蛋白的一种工具酶,具有酶切效率高、特异性好等优点.但现有市售SUMO蛋白酶Ulp1价格昂贵、操作复杂,限制了SUMO融合体系的运用.利用基因工程技术,合成基因ulp1(Leu403-Lys621),并在N端和C端加入多聚组氨酸标签(His6),构建重组表达载体psvT7-ulp1,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)和BL21 trxB(DE3)中.经过高通量筛选技术快速确定最优的表达条件为采用BL21(DE3)作为表达宿主,转接后7h加入IPTG,IPTG的终浓度为0.1mmol/L,诱导时间为16h,最终蛋白质表达量占菌体总蛋白质量的34.5％,重组蛋白Ulp1的表达量为190mg/L,通过Ni-NTA一步纯化即可得到纯度95％以上的Ulp1.通过酶切反应,测定酶活为5.19U/μl,比酶活为5.23×104U/mg,是先前报道比酶活的1.87倍,通过酶活动力学分析,Ulp1的表观米氏常数Km=0.359g/L,Vm =5.10μg/(ml·min).将SUMO融合表达体系用于单链抗体(single-chain antibody fragment,scFv)的表达,得到可溶的SUMO-scFv融合蛋白,使用表达的Ulp1进行酶切并纯化,获得纯度高于90％且N端不合多余氨基酸的scFv,操作步骤简单,显著改善了scFv在大肠杆菌中难以高效可溶性表达纯化的现状.

目的:高效可溶性表达泛素样特异性蛋白酶1(ULP1).方法:根据大肠杆菌密码子的偏好性优化合成编码ULP1的基因片段序列,将其克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3),用0.5 mmol/L IPTG于37℃诱导表达8h,观察重组蛋白ULP1的表达情况;优化诱导时间及IPTG浓度,并鉴定重组蛋白ULP1的生物学活性.结果:重组蛋白ULP1表达的最佳条件为37℃、0.1 mmol/L的IPTG诱导表达5h,目的蛋白以可溶性表达为主;Western印迹结果表明,重组蛋白ULP1能够被His单克隆抗体识别,重组蛋白ULP1能够特异性酶切SUMO-GFP.结论:表达了具有生物学活性的SUMO蛋白酶ULP1.

目的:观察开口箭皂苷对甲状腺髓样癌TT细胞(MTC-TT)及荷瘤小鼠模型中SUMO特异性蛋白酶2(SENP2)的水平变化,探讨开口箭皂苷治疗甲状腺髓样癌的作用机制.方法:不同浓度的开口箭皂苷作用于MTC-TT细胞,分别给予2、4、8、16、32、64μg/mL开口箭皂苷处理24、48、72 h,采用CCK8法检测各浓度下MTC-TT细胞增殖抑制率并计算出半数抑制浓度(IC50),将实验分为4组,低浓度组(TL组,浓度为0.5 IC50开口箭皂苷)、中浓度组(TM组,浓度为IC50开口箭皂苷)、高浓度组(TH组,浓度为2 IC50开口箭皂苷)和对照组(N组,培养基中无开口箭皂苷).将药物作用于各浓度组MTC-TT细胞48 h后,流式细胞术检测细胞凋亡;Westem blot检测MTC-TT细胞中SENP2的蛋白表达;RT-PCR检测MTC-TT细胞中SENP2的基因表达.结果:开口箭皂苷对MTC-TT细胞增殖有抑制作用(P＜0.05),且随浓度增加抗增殖作用越强(P＜0.05或P＜0.01),开口箭皂苷对MTC-TT细胞的IC50值为31.54μg/mL;TM组和TH组G0/G1期细胞相对减少(P＜0.05或P＜0.01),TL、TM、TH组G2/M期细胞增加(P＜0.05或P＜0.01),细胞阻滞在G2/M期;TT细胞株中SENP2的蛋白和mRNA表达水平均显著下降.结论:开口箭皂苷可以抑制MTC-TT细胞增殖和诱导其凋亡,其作用机制可能与抑制SENP2的表达有关.

目的 从美洲钩虫 (Necator americanus) cDNA中扩增编码NaKuI10基因片段, 构建原核表达系统, 重组表达并纯化rNaKuI10, 采用化学发色法和平板溶解试验等检测其对有关丝氨酸蛋白酶的抑制作用及纤溶活性.方法 根据GenBank MH218867序列, 从美洲钩虫cDNA中扩增出编码成熟肽NaKuI10基因片段并连接入表达载体, 构建原核表达重组质粒pET32a-sumo/NaKuI10, 鉴定正确的重组质粒转化至大肠埃希菌 (Escherichia coli) BL21 (DE3) 中, 用IPTG诱导表达, 超声破碎细菌后用镍亲和层析纯化表达产物, 在纯化柱上用SUMO蛋白酶切割融合标签获得rNaKuI10, 用发色底物法检测rNaKuI10对各丝氨酸蛋白酶的抑制活性, 通过纤维蛋白平板法和纤维蛋白原降解试验观察rNaKuI10对纤溶酶纤溶活性的抑制作用.结果 成功构建了重组质粒pET32a-sumo/NaKuI10, 表达产物纯化后获得可溶性rNaKuI10.2倍及等摩尔比的rNaKuI10分别能抑制100％及90.4％的人纤溶酶活性, 22.4％及10.3％的人胰蛋白酶活性.但1、2、5倍摩尔比的rNaKuI10对人中性粒细胞弹性蛋白酶, 组织蛋白酶G, 蛋白酶3, 胰糜蛋白酶, 胰弹性蛋白酶, 凝血酶, 凝血因子Xa (FXa) 、FXIa、FXIIa、FIXa, 活化蛋白C, 血浆激肽释放酶及FVIIa/TF均无明显抑制作用.rNaKuI10对人纤溶酶的抑制常数 (ki) 为 (0.83±0.10) nmol/L.2 000nmol/L的rNaKuI10接近完全抑制1 000nmol/L的人纤溶酶对纤维蛋白平板中纤维蛋白的溶解作用, 等摩尔比的rNaKuI10可完全抑制人纤溶酶对纤维蛋白原的降解作用.结论 NaKuI10是一种抑制活性强且特异性较好的纤溶酶抑制剂, 其生物学功能还需进一步研究.

目的 评价选择性脑低温对大鼠脑缺血再灌注时皮质小泛素样修饰蛋白(SUMO)化的影响.方法 清洁级健康雄性SD大鼠120只,8周龄,体重200～ 250 g,采用随机数字表法分为4组(n=30):假手术组(S组)、缺血再灌注组(I/R组)、选择性脑低温组(H组)和37℃生理盐水组(N组).采用线栓法阻断大鼠右侧大脑中动脉,缺血2h后I/R组拔除线栓恢复灌注,H组拔除线栓即刻由右侧颈内动脉以100 ml·kg-1·h-1速率输注10～13℃生理盐水20 min,N组以同样速率输注37℃生理盐水20 min.于再灌注后6、24和48 h时进行神经功能缺陷评分,采用TUNEL法检测缺血侧皮质细胞凋亡率,Western blot法测定缺血侧皮质SUMO特异性蛋白酶3(SENP3)、结合状态SUMO2/3表达水平.结果 与S组比较,其余3组大鼠各时点神经功能缺陷评分和细胞凋亡率升高,结合状态SUMO2/3表达上调,I/R组和N组SENP3表达上调,H组SENP3表达下调(P＜0.01);与I/R组比较,H组神经功能缺陷评分和细胞凋亡率降低,结合状态SUMO2/3表达上调,SENP3表达下调(P＜0.05).结论 选择性脑低温减轻大鼠脑缺血再灌注损伤的机制与其增强皮质SUMO化有关.

目的 探讨SUMO特异性蛋白酶1(SENP1)在膀胱癌发生、发展中的作用及其机制.方法 选择膀胱癌组织130例份及其相应癌旁正常组织80例份,采用免疫组化法检测SENP1、缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)表达.分析膀胱癌组织SENP1表达与HIF-1α、VEGF表达的关系及其与患者临床病理参数的关系.结果 膀胱癌组织与癌旁正常组织SENP1阳性表达率分别为59.23％(77/130)、11.25％(9/80),二者比较P<0.01.膀胱癌组织SENP1阳性表达与HIF-1α、VEGF阳性表达均呈正相关关系(r分别为0.338、0.494,P均<0.01).膀胱癌临床高分期(T2、T3期)、浸润性生长及复发状态者癌组织SENP1、HIF-1α、VEGF阳性表达率均明显高于临床低分期(T1期)、非浸润性生长及初发状态者(P<0.05或<0.01).结论 SENP1高表达可促进膀胱癌的发生及发展,其机制可能与上调HIF-1α、VEGF表达有关.