目的:探究多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]抑制剂尼拉帕利作为胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)放疗增敏剂的可行性及作用机制.方法:生物信息学分析PARP抑制剂奥拉帕利和他拉唑帕利在胶质瘤中的作用机制及其与放疗的相关性;CCK-8测定尼拉帕利在GBM细胞(A172、U251和U87)中的最适作用浓度和最适作用时间;克隆形成实验检测尼拉帕利对GBM细胞放疗敏感性的影响;流式细胞术检测尼拉帕利联合放疗对GBM细胞周期的影响,蛋白质印迹检测尼拉帕利联合放疗对DExD-box解旋酶(DExD-box helicase,DDX21)蛋白表达的影响,免疫荧光法研究尼拉帕利联合放疗对DDX21在GBM中细胞核定位的影响,以探讨尼拉帕利在GBM中放疗增敏的作用机制.结果:生物信息学分析表明,在519个肿瘤细胞系中,PARP抑制剂在胶质瘤中发挥作用的途径主要与核糖体生物合成和功能相关;在44个实体肿瘤细胞系中,同源重组修复能力与核糖体生物合成能力高度正相关.尼拉帕利在A172和U87细胞系中的IC5.值分别为(10.77±3.31)μmol/L和(32.37±2.84)μmol/L;在尼拉帕利浓度为348 nmol/L和1 044 nmol/L时A172细胞的辐射剂量增强因子(DEF37)分别为1.99和2.17,在1 056 nmol/L和3 169 nmol/L时U87细胞的DEF37分别为1.10和1.44,尼拉帕利对p53野生型的A172细胞和U87细胞具有放疗增敏作用,但对p53突变型的U251细胞无放疗增敏作用;在A172细胞和U87细胞中尼拉帕利联合放疗组的G2/M期细胞均明显多于对照组,尼拉帕利联合放疗可以使A172和U87细胞阻滞在对射线敏感的G2/M期,从而实现放疗增敏.最后,尼拉帕利联合放疗处理U87细胞后,DDX21蛋白表达无显著变化(P＞0.05),免疫荧光结果提示尼拉帕利联合放疗处理U87细胞后,DDX21从核仁到核质重新定位;敲低DDX21会引起U87细胞产生放疗抵抗,尼拉帕利对DDX21敲低后的U87细胞仍有放疗增敏作用.结论:尼拉帕利通过使DDX21从核仁到核质重新定位,影响核糖体生物合成,产生G2/M期细胞周期阻滞,从而增加U87细胞的放疗敏感性.

目的 探讨DNA甲基转移酶-1(DNMT1)在人脑胶质瘤细胞中的生物学功能及其调控机制.方法 利用中国胶质瘤基因组图谱(CGGA)、肿瘤基因组图谱(TCGA)、基因表达综合数据库(GEO)中脑胶质瘤相关转录组测序(mRNA-seq)数据、单细胞测序数据,对迁移调控蛋白1(SHTN1)进行生存分析、临床相关分析等生物信息学分析;采用慢病毒转染构建DNMT1稳定低表达的人脑胶质瘤细胞株,以DNMT1-NC为对照,使用实时定量聚合酶链反应检测各组细胞SHTN1 mRNA水平,以验证DNMT1与SHTN1的表达相关性;BSAS测序验证DNMT1对SHTN1的甲基化调控作用,采用Kruskall-Wallis检验比较每个CpG位点甲基化差异.结果 SHTN1高表达组脑胶质瘤患者生存优于低表达组(P＜0.05);SHTN1在胶质母细胞瘤(GBM)中的表达水平显著低于正常脑组织,并且SHTN1在不同脑胶质瘤WHO分级和不同病理亚型中表达差异有统计学意义;人脑胶质瘤中SHTN1与DNMT1的表达水平呈负相关;体外实验DNMT1敲减组中SHTN1的mRNA水平显著高于对照组[U251:敲减组SHTN1表达丰度高于对照组(1.692比1.000,P＜0.01);U87:敲减组SHTN1表达丰度高于对照组(1.420比1.002,P＜0.05)].BSAS测序验证SHTN1的3个CpG位点在DNMT1敲减组的甲基化水平下调(P＜0.05).结论 SHTN1的低表达可能与脑胶质瘤患者不良预后相关,DNMT1能通过DNA甲基化作用调控SHTN1的表达.

目的:探讨长链非编码RNA（lncRNA）LBX2-AS1通过表皮生长因子受体（EGFR）信号通路调控胶质瘤细胞增殖、迁移及凋亡的机制。方法:2018年4月至2021年8月，将脑胶质瘤U251细胞（简称U251细胞）分为对照组和观察组，每组4株，对照组采用常规培养，观察组利用靶向LBX2-AS1的特异性小干扰RNA（siRNA）转染。采用四甲基偶氮唑盐法检测U251细胞增殖能力，划痕实验检测U251细胞转移率，流式细胞仪检测U251细胞凋亡率，蛋白印迹法检测U251细胞总蛋白及血管内皮生长因子（VEGF）、磷酸化磷酸肌醇3激酶（p-PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）、磷酸化Ras（p-Ras）和磷酸化Raf（p-Raf）蛋白的表达。结果:观察组U251细胞增殖能力、转移率明显低于对照组[（27.15 ± 1.38）%比（63.54 ± 2.47）%、（37.09 ± 3.74）%比（82.17 ± 9.24）%]，U251细胞凋亡率明显高于对照组[（69.17 ± 5.83）%比（17.58 ± 1.22）%]，差异有统计学意义（ P<0.01）。观察组U251细胞总蛋白及VEGF、p-PI3K、p-Akt、p-Ras、p-Raf蛋白表达水平明显低于对照组（1.52 ± 0.23比2.39 ± 0.31、0.73 ± 0.08比1.68 ± 0.45、0.57 ± 0.11比1.89 ± 0.31、0.68 ± 0.06比1.74 ± 0.51、0.84 ± 0.12比1.99 ± 0.63和0.71 ± 0.08比1.52 ± 0.37），差异有统计学意义（ P<0.01）。 结论:lncRNA LBX2-AS1在胶质瘤细胞中高表达，沉默lncRNA LBX2-AS1的表达通过EGFR通路抑制脑胶质瘤细胞的增殖和转移。

目的:探讨黄芩苷对U-251胶质瘤细胞增殖和侵袭的影响及可能机制。方法:人星形细胞瘤细胞(U-251胶质瘤细胞)购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。采用0、10、20、50、100和200 mg/L等浓度黄芩苷处理U-251胶质瘤细胞筛选出半数抑制浓度(IC 50)。将U-251胶质瘤细胞分为对照组(未行任何处理)、黄芩苷组(50 mg/L黄芩苷处理)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)组(50 mg/L黄芩苷和10 μg/L浓度TNF-α处理)，分别采用克隆形成实验和Transwell实验检测细胞增殖和侵袭；酶联免疫吸附法检测炎症因子白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)水平；蛋白免疫印迹法检测增殖细胞核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、核因子活化B细胞-κ轻链增强子(NF-κB)、磷酸化-NF-κB(p-NF-κB)、NF-κB抑制蛋白α(IκBα)和磷酸化-IκBα(p-IκBα)蛋白表达水平，组间两两比较采用SNK- q检验。 结果:黄芩苷处理U-251胶质瘤细胞48 h的IC 50为47.91 mg/L。黄芩苷组U-251胶质瘤细胞克隆形成率、侵袭细胞数、IL-1β和IL-6水平、PCNA、MMP-2、MMP-9、p-NF-κB和p-IκBα蛋白表达水平低于TNF-α组和对照组[克隆形成率分别为(21.04±2.42)%、(49.73±5.04)%和(56.29±5.37)%，侵袭细胞数分别为(40.02±4.16)、(68.18±5.22)和(76.25±6.50)个，IL-1β分别为(19.26±2.04)、(35.18±3.82)和(42.08±4.12) ng/L，IL-6分别为(113.38±10.24)、(204.55±20.16)和(216.07±18.52) ng/L，PCNA分别为(0.28±0.03、0.56±0.05和0.64±0.06)，MMP-2分别为(0.09±0.01、0.19±0.02和0.22±0.02)，MMP-9分别为(0.14±0.01、0.28±0.02和0.31±0.03)，p-NF-κB为(0.17±0.02、0.38±0.04和0.35±0.03)，p-IκBα为(0.14±0.01、0.41±0.04和0.37±0.03)]，差异均有统计学意义( F＝157.904、112.532、103.507、100.032、137.829、139.004、158.786、102.137、77.871， P<0.05)。 结论:黄芩苷通过抑制NF-κB信号通路调控炎症反应抑制U-251胶质瘤细胞增殖和侵袭。

1例60岁男性患者因肺癌先后行一线和二线治疗26个月，因肿瘤进展，予特瑞普利单抗200 mg+贝伐珠单抗500 mg+培美曲塞1 g静脉滴注、第1天，21 d为1个周期。治疗前患者甲状腺功能正常。第2次特瑞普利单抗治疗后（首次用药后第30天），患者出现心率加快、畏热、多汗、体重减轻等症状；甲状腺功能检查结果：三碘甲状腺原氨酸（T 3）3.4 nmol/L，甲状腺素（T 4）305.0 nmol/L，游离三碘甲状腺原氨酸（FT 3）13.1 pmol/L，游离甲状腺素（FT 4）55.7 pmol/L，促甲状腺激素（TSH）0.02 mU/L，甲状腺球蛋白（Tg）32.7 μg/L，抗甲状腺球蛋白抗体（TgAb）531.0 kU/L，抗甲状腺过氧化物酶抗体（TPOAb）318.0 kU/L，促甲状腺激素受体抗体（TRAb）1.00 U/L。考虑甲状腺功能亢进，暂停抗肿瘤治疗，予美托洛尔治疗后好转。首次用药后第97天，患者出现畏寒、头晕、乏力、眼睑浮肿、体重增加等症状，实验室检查示T 3 0.3 nmol/L、T 4 20 nmol/L、FT 3 1.0 pmol/L、FT 4 1.8 pmol/L、TSH>100.00 mU/L，癌胚抗原251 μg/L。考虑甲状腺功能减退。因肿瘤进展，重启特瑞普利单抗治疗，同时补充甲状腺素，患者甲状腺功能逐渐好转并保持正常。首次用药13个月余后复查，T 3 1.3 nmol/L，T 4 137.0 nmol/L，FT 3 3.8 pmol/L，FT 4 21.1 pmol/L，TSH 6.03 mU/L，Tg 3.9 μg/L，TgAb 432.0 kU/L，TPOAb 222.0 kU/L。

目的:探讨ATP结合盒转运子E1(ABCE1)在胶质瘤组织的表达及其与细胞增殖、周期和转移的关系。方法:选取安阳市人民医院和河南省肿瘤医院2018年12月到2020年12月手术收集的71例神经胶质瘤和癌旁组织作为研究对象，采用蛋白质免疫印迹(Western blot)分析ABCE1蛋白表达水平。将神经胶质瘤细胞U251分为对照组和ABCE1 KD组，分别采用对照短发卡RNA(shRNA)和ABCE1 shRNA慢病毒感染建立稳定细胞系，采用细胞计数试剂盒(CCK-8)和克隆形成实验分析两组细胞增殖；采用流式细胞术分析两组细胞凋亡变化；采用划痕实验和Transwell分析两组细胞迁移能力；采用Western blot分析两组细胞凋亡和迁移相关蛋白表达水平。计量数据比较采用 t检验。 结果:癌旁组织ABCE1蛋白表达水平(0.87±0.12)明显低于神经胶质瘤组织(2.09±0.22)，差异有统计学意义( t＝3.109， P<0.05)。对照组细胞吸光度值(1.88±0.22)明显高于ABCE1 KD组(1.30±0.18)，差异有统计学意义( t＝2.019， P<0.05)。克隆形成实验结果显示，对照组细胞克隆形成率[(59.32±6.09)%]明显高于ABCE1 KD组[(30.12±4.99)%]，差异有统计学意义( t＝5.891， P<0.05)。对照组细胞凋亡率[(3.01±0.34)%]明显低于ABCE1 KD组[(19.43±3.09)%]，差异有统计学意义( t＝3.011， P<0.05)。对照组细胞迁移数量[(97.43±5.89)个]明显高于ABCE1 KD组[(57.91±4.32)个]，差异有统计学意义( t＝4.009， P<0.05)。对照组细胞半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3蛋白表达水平(1.38±0.31)明显低于ABCE1 KD组(2.01±0.23)，差异有统计学意义( t＝3.118， P<0.05)。对照组细胞黏着斑激酶(FAK)蛋白表达水平(1.19±0.15)明显高于ABCE1 KD组(0.55±0.19)，差异有统计学意义( t＝2.791， P<0.05)。 结论:ABCE1蛋白神经胶质瘤组织中表达水平显著增加，并参与胶质瘤细胞的增殖、凋亡和迁移等恶性细胞生物学过程。

目的:制备由聚乳酸－羟基乙酸共聚物(PLGA)包载全氟戊烷(PFP)与化疗药替莫唑胺(TMZ)的液气相变型纳米粒(TMZ/PFP/PLGA NPs)，联合低强度聚焦超声(LIFU)辐照，探讨其体外超声显影能力及对人胶质瘤细胞的体外干预效果。方法:采用复乳法制备TMZ/PFP/PLGA NPs，检测其基本理化性质及药物包载能力，观察纳米粒体外超声显影效果；CCK-8法检测纳米粒的体外细胞毒性及与LIFU协同干预对胶质瘤细胞存活率的影响；Western blot检测协同干预后细胞内凋亡相关蛋白Bcl-2、bax及caspase-3的表达水平变化。结果:在透射电镜下，TMZ/PFP/PLGA NPs呈形态规则的类圆形核壳结构，粒径(137.9±63.31) nm，对TMZ的包封率为(83.01±5.57)%，载药量(3.19±0.22)%；纳米粒与U251细胞共孵育24 h后细胞存活率仍可保持在70%以上，在同时施加LIFU辐照的协同作用下，可使细胞凋亡加速，细胞存活率明显下降；Western blot检测结果显示，协同干预可明显下调细胞内凋亡相关蛋白Bcl-2的表达，同时明显上调bax蛋白与caspase-3蛋白的表达(均 P<0.05)。 结论:TMZ/PFP/PLGA NPs本身具有良好的基本理化性质，在高效包载化疗药物替莫唑胺的同时，具有较低的体外细胞毒性，在LIFU辐照下的协同干预可明显加速U251胶质瘤细胞凋亡，具有良好的应用前景。

目的:探讨B细胞淋巴瘤/白血病11A(BCL11A)对胶质母细胞瘤(GBM)细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响，并分析其可能的机制。方法:通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测BCL11A在不同级别脑胶质瘤组织及不同GBM细胞株中的表达水平。在高表达BCL11A的GBM细胞株中感染shRNA慢病毒，构建稳定敲低BCL11A的GBM细胞株。设立阴性对照(NC)组(仅感染随机无关对照shRNA)和BCL11A敲低组(BCL11A-KD组)。通过qRT-PCR和Western blot实验检测敲低BCL11A的效果；通过CCK-8实验和克隆形成实验检测敲低BCL11A后GBM细胞的增殖能力；应用Transwell小室法检测敲低BCL11A后GBM细胞株的迁移和侵袭能力；采用Western blot实验检测敲低BCL11A后GBM细胞相关信号分子的表达情况。结果:与低级别胶质瘤[世界卫生组织(WHO)Ⅰ~Ⅱ级]和正常脑组织相比，BCL11A在高级别胶质瘤(WHO Ⅲ~Ⅳ级)中呈高表达(均 P<0.05)。BCL11A在原代胶质瘤细胞PT2及GBM细胞株U251和TG-905中的表达水平较高，而在A172、SF295和U87-MG中几乎不表达。qRT-PCR和Western blot检测结果显示，通过感染shRNA慢病毒，可成功构建稳定敲低BCL11A的U251和TG-905细胞株。CCK-8实验结果显示，U251和TG-905细胞NC组的吸光度值分别为1.72±0.05、1.87±0.05，高于BCL11A-KD组(分别为1.15±0.05、1.18±0.05)(均 P<0.001)。克隆形成实验结果显示，U251和TG-905细胞NC组的克隆数分别为(15.3±1.5)个和(9.0±1.0)个，高于BCL11A-KD组[分别为(8.8±1.0)个、(2.3±0.6)个](均 P<0.001)。Transwell小室实验结果显示，U251细胞NC组和BCL11A-KD组在迁移实验中进入上室底部的细胞数分别为(111.0±10.2)个和(55.3±5.5)个，侵袭实验中分别为(85.3±7.8)个和(35.0±4.6)个，两组差异均有统计学意义(均 P<0.01)。TG-905细胞NC组和BCL11A-KD组在迁移实验中进入上室底部的细胞数分别为(95.0±5.0)个和(66.7±7.0)个，侵袭实验中分别为(93.0±3.6)个和(46.7±7.4)个，两组差异均有统计学意义(均 P<0.01)。Western blot结果显示，U251和TG-905细胞敲低BCL11A的表达可显著下调波形蛋白的表达。 结论:BCL11A通过调控波形蛋白的表达影响GBM细胞的增殖、迁移和侵袭能力。BCL11A-波形蛋白调控通路或可为GBM分子靶向治疗提供依据。

目的:探讨长链非编码RNA CRNDE对胶质瘤干细胞特性改变的影响及其机制。方法:应用免疫磁珠法从人胶质瘤细胞系U251中分离出CD133 +U251干细胞(U251s)。将实验细胞分为U251s组、U251s-CRNDE组及U251组、U251-CRNDE组，其中U251s-CRNDE组、U251-CRNDE组细胞预先用CRNDE短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体转染以下调CRNDE的表达。应用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测各组细胞中 CRNDE mRNA的表达水平，应用细胞计数试剂(CCK)-8法检测各组细胞的增殖变化，应用Transwell小室实验检测各组细胞的侵袭能力，应用划痕实验检测各组细胞的迁移能力，应用平板克隆实验检测各组细胞的克隆形成能力，应用流式细胞术检测各组细胞的周期改变，应用Western blotting法检测U251s组、U251s-CRNDE组细胞中干细胞标志蛋白A2B5、CD133、巢蛋白、Sox2、Oct-4、Nanog以及磷脂酰肌醇激酶(PI3K)-蛋白激酶B(AKT)-雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路关键蛋白PI3K、AKT、磷酸化(p)-AKT、mTOR蛋白的表达水平。 结果:与U251组相比，U251s组细胞中 CRNDE mRNA的表达水平明显升高，差异有统计学意义( P<0.05)。U251s-CRNDE组与U251s组细胞相比，U251-CRNDE组与U251组细胞相比，前者的细胞增殖率、穿膜细胞数量、细胞迁移率、细胞集落形成数目、G2/M期细胞比例明显降低，G1/G0期细胞比例明显升高，差异均有统计学意义( P<0.05)。与U251s组相比，U251s-CRNDE组细胞中CD133、巢蛋白、Sox2、Oct-4及PI3K、AKT、p-AKT、mTOR蛋白的表达水平明显降低，差异均有统计学意义( P<0.05)。 结论:CRNDE在胶质瘤干细胞中表达增高，而下调CRNDE的表达后可以抑制胶质瘤干细胞的特性，且这种影响与PI3K-AKT-mTOR信号通路的调控有关。

目的:探索基于显微注射方法构建胶质母细胞瘤(GBM)融合大脑类器官模型的可行性，观察该模型肿瘤组织对替莫唑胺(TMZ)的敏感性。方法:GBM组织和脑肿瘤旁组织标本(定义为正常脑组织)来源于中南大学湘雅医院神经外科行手术治疗的患者。采用绿色荧光蛋白(GFP)标记过的人诱导多能干细胞株(hiPSCs)培养24 d构建大脑类器官模型，通过免疫荧光染色方法检测蛋白标志物的表达，评估模型是否成功建立。采用显微注射方法将用红色荧光染料标记过的患者来源的GBM单细胞或U-251 MG细胞株注射到培养约30 d的大脑类器官中，构建GBM融合大脑类器官模型。采用免疫荧光染色法、HE染色等方法观察GBM细胞在大脑类器官中的增殖及浸润情况。采用免疫荧光染色法检测GBM融合大脑类器官中肿瘤细胞基质金属蛋白酶类(MMPs)及BrdU的表达情况，采用HE染色观察形态及结构变化。将10 μmol/L TMZ加入GBM融合大脑类器官模型及GBM肿瘤类组织中培养48 h，采用免疫荧光染色法检测两种模型中Caspase-3的表达。结果:(1)hiPSCs培养至第24天，形成具有明确芽和分层边缘的块状组织样结构；免疫荧光染色显示，该结构阳性表达前脑、脑室样结构、前额叶皮质及海马的标志蛋白FOXG1、N-cadherin、Auts2及Frizzled 9，以及星形胶质细胞标志蛋白胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元标志蛋白TUJ1。(2)荧光显微镜下及HE染色均显示肿瘤细胞在大脑类器官内快速增殖，呈浸润性生长。免疫荧光检测显示，与大脑类器官比较，GBM融合大脑类器官的肿瘤细胞中，MMP2和MMP13的表达明显增加，Fibronectin、MMP3及MMP9的表达明显减弱，差异均有统计学意义(均 P<0.05)，MMP10的表达差异无统计学意义( P>0.05)；GFAP和BrdU的表达水平均增高(均 P<0.05)。(3)TMZ处理48 h后，免疫荧光染色显示，GBM类肿瘤组织中Caspase-3的表达明显高于GBM融合大脑类器官。 结论:采用显微注射方法能够成功构建GBM融合大脑类器官模型。该模型中的肿瘤组织对TMZ的敏感性低于GBM肿瘤类组织。