为实现体外大规模制备单纯疱疹病毒HSV-IgM(HSV1,HSV2)人鼠嵌合抗体,本研究通过RNA 连接酶介导的 cDNA 末端快速扩增(RNA ligase-mediated rapid amplification of cDNA ends,RLM-RACE)技术获取其对应杂交瘤细胞基因序列,构建嵌合抗体至真核表达载体,在CHO-S细胞中稳定表达所需目的蛋白.同时优化稳定细胞株筛选工艺,对细胞池构建阶段和单克隆筛选阶段的加压条件进行摸索与探究,最后目的抗体采用蛋白L亲和纯化法进行纯化并进行生物活性检测;最终成功制备899 kDa和 909 kDa的稳定高表达重组IgM抗体(HSV1,HSV2)细胞株.结果表明,最适筛选压力为 20P200M(一轮加压)和 50P1000M(二轮加压);使用加压培养基进行单克隆筛选抗体表达量较高,HSV1-IgM和HSV2-IgM单克隆最终表达量分别为 1 620 mg/L和 623 mg/L.本研究为HSV1和HSV2的IgM系列重组抗体质控品开发以及体外高表达分泌IgM亚型抗体提供理论与实践基础.

以日本三角涡虫Dugesia japonica为研究对象,通过cDNA末端快速扩增技术首次获得涡虫hsp60基因,cDNA全长1 851 bp,编码575个氨基酸的蛋白质,命名为DjHSP60.生物信息学分析表明,DjHSP60含有HSP60家族的标签序列和末端重复序列GGM,亚细胞定位分析显示该蛋白定位于线粒体,属于线粒体HSP60家族.整体原位杂交和双荧光原位杂交显示,Djhsp60阳性细胞主要分布在实质组织中,具有干细胞的特征.涡虫切割后再生1 d,Djhsp60在伤口处的组织中表达显著增强,但随着再生进行,表达量逐渐降低.采用RNAi技术敲除Djhsp60导致涡虫头部逐渐退化,失去再生能力.原位杂交和qPCR研究结果证明,RNAi-Djhsp60下调干细胞相关基因的表达.上述结果揭示Djhsp60在涡虫再生中可能发挥重要作用,为进一步研究Djhsp60调控涡虫干细胞增殖的分子机制奠定了良好基础.

目的 克隆金钗石斛(Dendrobium nobile Lindl.)3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoAreductase,HMGR)基因,并进行生物信息学及接茵前后差异表达分析.方法 采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得DnHMGR2基因cDNA全长;生物信息学分析编码蛋白的理化特性、结构域等特征;用DNASTAR、MEGA软件分别进行氨基酸多序列比对和进化树构建分析;借助实时定量PCR技术检测基因接菌前后表达模式.结果 从金钗石斛中分离得到一个HMGR基因,命名为DnHM GR2(GenBank注册号KX825920).DnHMGR2基因cDNA全长2 095 bp,编码一条由562个氨基酸组成的多肽,相对分子质量为59.68×103,等电点6.18.DnHM GR2蛋白具有植物HMGR酶的典型结构域和结合基序.DnHMGR2与多种植物HMGR基因高度同源,与铁皮石斛的亲缘关系最近.DnHM GR2基因具有组织表达特异性,在金钗石斛叶、茎中的表达量较高,为根中的2.59和1.60倍;但接菌后各器官的表达量表现为茎＞叶＞根.结论 首次克隆得到金钗石斛中HMGR基因的全长cDNA,为进一步解析该基因在金钗石斛萜类物质合成代谢途径中的分子调控作用,及茵根真菌对石斛碱生物合成调控机制奠定了基础.

二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)是花青素合成途径中的关键酶.本研究以乌头(Aconitum carmichaeli)不同开放时期的花蕾为材料,测定其花青素含量,并采用同源克隆和cDNA末端快速扩增(RACE)技术从乌头花中获得了DFR基因cDNA全长,命名为AcDFR(GenBank登录号KY272864).结果显示,乌头花青素含量随着花的开放呈先上升后下降的趋势.AcDFR的cDNA全长为1233 bp,开放阅读框为1014 bp,预测编码337个氨基酸.氨基酸序列比对显示,AcDFR在NADPH结合区域和底物结合区域都高度保守,属于NADB_Rossmann超家族.系统进化分析表明,AcDFR与翠雀(Delphinium grandiflorum)DFR亲缘关系最近.AcDFR主要在乌头的花中表达,在根、茎、叶中几乎不表达,其表达量与花青素含量的变化呈正相关,随着不同的开花级数呈现先上升后下降的趋势.

目的 利用eDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆乙型肝炎病毒DNA聚合酶反式调节蛋白HBVDNAPTP1基因的全长cDNA序列.方法 提取肝母细胞瘤细胞系HepG2总RNA,应用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-PCR,RT-PCR)技术建立RACE cDNA文库,进行RACE实验,扩增HBVDNAPTP1基因全长cDNA序列.结果 经RACE实验,获得HBVDNAPTP1基因全长cDNA序列为2 537 bp,经RT-PCR验证确定该基因真实存在,且与GenBank数据库中注释的其他基因无同源性.结论 成功获取HBVDNAPTP1基因的全长cDNA序列,为进一步开展HBVDNAPTP1生物学功能及调控机制研究提供了线索和依据.

利用cDNA末端快速分离(RACE)技术从陇油6号油菜中克隆得到一个新的谷胱甘肽还原酶基因GR2,全长2073 bp,开放阅读框1692 bp,编码563个氨基酸,预测蛋白质分子量为60.7 kDa,等电点7.9.实时荧光定量PCR分析表明:GR2基因在油菜根、茎、叶中均有表达,其中在叶中表达量最高.GR1和GR2基因的转录以及谷胱甘肽还原酶(GR)活性受到低温、高温、干旱、高盐胁迫的诱导,表明油菜谷胱甘肽还原酶在抵御低温、高温、干旱、高盐胁迫过程中发挥重要作用.脱落酸(ABA)预处理后再进行上述胁迫处理,与单独上述胁迫相比,GR1和GR2基因的转录以及GR活性水平明显上升,表明ABA可以诱导GR1和GR2基因表达和GR酶活性.MAPKK抑制剂U0126预处理后再进行上述胁迫处理,与单独上述胁迫相比,GR1和GR2基因的转录以及GR活性水平明显下降,表明U0126对GR1、GR2基因表达以及GR酶活性有抑制作用.

采用反转录PCR和cDNA末端快速扩增技术从异育银鲫Carassius auratus gibelio肝脏中克隆了过氧化物还原酶(Prx)基因的cDNA全长序列.结果显示,异育银鲫过氧化物还原酶(CaPrx)基因cDNA全长1 035 bp,开放阅读框长594 bp,编码197个氨基酸.在氨基酸序列的N端和C端各有一个保守的Cys残基,属于2-半胱氨酸类Prxs家族.多序列比对和系统进化树分析表明,异育银鲫与鲫Carassius auratus、青鱼Mylopharyngodon piceus、斑马鱼Danio rerio、犀角金线鲃Sinocyclocheilus rhinocerous和朝鲜鳑鲅Rhodeus uyekii等鱼类的Prx基因具有很高的同源性.实时荧光定量PCR结果显示,CaPrx基因在异育银鲫体内广泛表达,在血细胞和肝脏中表达量最高,在鳃和头肾的表达量较少.在感染鲤疱疹病毒Ⅱ型的个体中,肝脏和脾脏的CaPrx基因表达量显著下降,表明其抗氧化作用因病毒的感染而受到了一定的破坏.

目的:研究雷公藤萜类成分的生物合成相关基因,在雷公藤转录组信息数据的基础上,以雷公藤悬浮细胞为研究材料,克隆TwCYP88A1基因.方法:采用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆雷公藤TwCYP88A1基因,实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)分析其组织表达谱.结果:TwCYP88A1 cDNA全长1 594 bp,编码491个氨基酸,等电点9.16,相对分子质量55.957 kDa,具有半胱氨酸铁血红素配体信号活性催化位点.植物组织表达分析表明TwCYP88A1基因在雷公藤叶中的表达量最高,根中最低.结论:从雷公藤悬浮细胞中克隆得到TwCYP88A1基因全长cDNA,对其进行生物信息学分析,揭示其组织表达谱,为深入分析雷公藤细胞色素P450酶、解析雷公藤萜类化合物的生物合成下游途径奠定基础.

根据前期小叶女贞转录组研究的结果,利用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)从叶片中克隆到1条编码糖基转移酶的基因(xynzUGT).该基因cDNA全长1598 bp,由66 bp 5'-UTR,1440 bp ORF,92 bp 3'-UTR组成,其中ORF编码1条含480个氨基酸残基的酶蛋白(xynzUGT),其相对分子质量和等电点分别为54826.67 Da和5.82.利用生物信息学方法分析酶蛋白的结构,结果表明在一级结构中含有一段糖基转移酶高度保守的PSPG盒,在二级结构中含有α螺旋(38％)、β折叠片(12.1％)和无规蜷曲(49.9％),在三级结构中由肽链折叠形成2个正对的α/β/α类Rossmann折叠区域,并且两者之间夹着一个底物结合口袋.通过系统进化树分析发现,xynzUGT有可能催化酪醇等苯丙素类物质发生糖基化,进一步开展酶蛋白与酪醇的分子对接模拟实验,结果显示位于结合口袋的Gly138和Ser285通过氢键与酪醇发生相互作用.SDS-PAGE电泳分析表明,原核表达系统成功表达出相对分子质量为58370.57 Da的xynzUGT重组蛋白,但它以非可溶性的包涵体形式存在.利用分子伴侣和酶蛋白共表达的方法,在一定程度上可促进酶蛋白的可溶性表达.以上研究结果为进一步开展体外酶促反应研究,并阐明酶的功能机制奠定了基础.

目的 克隆青天葵黄酮类药效成分生物合成途径第一步关键酶——查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)的编码基因,并分析其序列特征及编码蛋白的功能.方法 在前期青天葵转录组测序获得的CHS基因序列片段的基础上,采用逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)和cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)从青天葵叶片中获取编码CHS的cDNA全长并克隆其编码区;利用生物信息学方法对其编码蛋白进行同源性比对和功能分析.结果 克隆获得的青天葵CHS基因编码区长度为1173 bp,编码391个氨基酸.编码蛋白的氨基酸序列预测显示,青天葵CHS蛋白为酸性、亲水性蛋白,分子量约为96.9 kDa;不含有信号肽、转运肽和跨膜结构域,可能定位于细胞质中;具有CHS保守功能域,归属于CHS超家族,与文心兰等同科植物CHS蛋白的同源性可达87%.结论 成功克隆得到青天葵查尔酮合成酶基因,为后续的基因功能鉴定和生物合成调控奠定了基础.