目的:探讨细胞外信号调节激酶（ERK）抑制剂PD98059对脑钙蛋白酶（calpain）相关蛋白的影响，并了解calpain在脑缺血/再灌注损伤（CIRI）中的病理生理变化。方法:将42只大鼠按随机数字表法分为假手术（Sham）组（ n＝6）、模型组（ n＝12）、二甲基亚砜（DMSO）对照组（ n＝12）和PD98059组（ n＝12）。采用经食道起搏电刺激法诱发心室纤颤制备心搏骤停-心肺复苏（CA-CPR）模型诱导大鼠CIRI；Sham组仅进行麻醉、气管插管及动静脉置管等基本操作，不进行CA和CPR。DMSO对照组和PD98059组在自主循环恢复（ROSC）30 min时分别经股静脉注射DMSO或PD98059 0.30 mg/kg；Sham组和模型组给予等量生理盐水。记录各组大鼠CPR持续时间，以及ROSC 24 h存活率和神经功能缺损评分（NDS）；分别采用苏木素-伊红（HE）染色和尼氏染色后观察脑皮质病理学改变；采用蛋白质免疫印迹试验（Western blotting）检测磷酸化ERK（p-ERK）、ERK、钙蛋白酶抑制蛋白（calpastatin）、calpain-1和calpain-2的蛋白表达；采用双重免疫荧光法检测p-ERK与calpain-2共表达情况。 结果:各制模组大鼠CPR持续时间及各组大鼠24 h存活率差异均无统计学意义。模型组大鼠脑皮质细胞核明显变形固缩、细胞空泡和组织排列紊乱，尼氏小体较Sham组显著减少，NDS评分明显降低，且ERK磷酸化水平明显增高，calpain-2蛋白表达明显上调；DMSO对照组各项指标与模型组差异无统计学意义。而给予PD98059干预后，大鼠脑皮质病理损伤明显改善，尼氏小体明显增加，NDS评分较模型组明显升高〔分：75.0（72.0，78.0）比70.0（65.0，72.0）， P<0.05〕，ERK磷酸化水平和calpain-2蛋白表达水平较模型组明显降低〔p-ERK（p-ERK/ERK）：0.65±0.12比0.92±0.05，calpain-2蛋白（calpain-2/GAPDH）：0.73±0.10比1.07±0.14，均 P<0.05〕；各组脑皮质calpastatin和calpain-1蛋白表达水平差异均无统计学意义。双重免疫荧光染色显示，p-ERK与calpain-2在细胞质和细胞核中存在共表达，模型组p-ERK与calpain-2共表达率较Sham组明显升高〔（38.6±4.3）%比（9.2±3.5）%， P<0.05〕，而PD98059组p-ERK与calpain-2共表达率则较模型组明显降低〔（18.2±7.0）%比（38.6±4.3）%， P<0.05〕。 结论:ERK与calpain-2共同参与了CA-CPR致CIRI；PD98059在抑制ERK磷酸化的同时也抑制了calpain-2的表达；ERK/calpain-2可作为CIRI治疗新靶点。

Calpains are a group of calcium-dependent proteases that are over activated by increased intracellular calcium levels under pathological conditions. A wide range of substrates that regulate necrotic, apoptotic and autophagic pathways are affected by calpain. Calpain plays a very important role in neuronal death and various neurological disorders. This review introduces recent research progress related to the regula-tory mechanisms of calpain in neuronal death. Various neuronal programmed death pathways including apoptosis, autophagy and regulated necrosis can be divided into receptor interacting protein-dependent necroptosis, mitochondrial permeability transition-dependent necrosis, pyroptosis and poly (ADP-ribose) polymerase 1-mediated parthanatos. Calpains cleave series of key substrates that may lead to cell death or participate in cell death. Regarding the investigation of calpain-mediated programed cell death, it is necessary to identify specific inhibitors that inhibit calpain mediated neuronal death and nervous system diseases.

目的 构建Calpastatin N末端结构域Calpastatin domain L(CSL)(a.a.150-230)融合蛋白质粒,表达、提取、纯化CSL蛋白并进行生物学活性鉴定.方法 将CSL的cDNA片段插入pGEX-6p-3质粒载体后,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,大量培养后用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导蛋白表达,超声破碎法提取CS;蛋白.利用Glutathione-Sepharose 4B(GS-4B)beads和PreScission蛋白酶分离纯化蛋白,pull down assay检测其生物学活性.结果 CSL质粒经测序比对后表明构建成功;超声破碎法提取的CSL蛋白纯度和浓度均较高,并具有能够与GST-CT1融合蛋白浓度依赖性结合的生物学活性.结论 成功构建CSL融合蛋白质粒,提取纯化具有生物活性的CSL蛋白,为探讨Cav1.2钙通道自身调节机制奠定基础.

目的 探讨钙蛋白酶抑制蛋白(calpastatin)对柯萨奇B组病毒3型(coxsackievirus B3,CVB3)诱导的病毒性心肌炎小鼠心脏炎症损伤的作用.方法 取全身过表达calpastatin的转基因小鼠(Tg-CAST)及野生型小鼠(WT)腹腔注射CVB3,感染病毒7d后建立病毒性心肌炎模型.分为对照组、Tg-CAST组、WT病毒性心肌炎组、Tg-CAST病毒性心肌炎组.留取小鼠心肌、血清及脾脏组织标本,分别行组织病理学检查以及炎症损伤相关因子检测.结果 ①WT病毒性心肌炎小鼠心肌组织中炎症浸润面积、病毒包膜蛋白VP-1及血清cTnI水平均明显高于对照组(P＜0.001).与WT病毒性心肌炎小鼠相比,Tg-CAST病毒性心肌炎小鼠心肌炎症浸润面积、VP-1及cTnI水平均明显降低(P＜0.05).②WT病毒性心肌炎小鼠心肌、脾脏与血清中炎症因子HMGB1、TNF-α、IL-17水平及心肌p-NF-KB表达显著升高(P＜0.01),而Tg-CAST病毒性心肌炎小鼠相应指标均明显低于WT病毒性心肌炎小鼠(P＜0.05).结论 calpastatin可能通过抑制NF-KB通路活化降低病毒性心肌炎小鼠HMGB1、TNF-α、IL-17水平,进而改善心脏炎症损伤.

目的 研究黄连素(BBR)对冠心病大鼠心肌细胞凋亡的影响及其作用机制.方法 以高脂饮食喂养并注射脑垂体后叶素建立冠心病大鼠模型.将模型动物分为实验组和对照组,同时以正常SD大鼠设立空白组,实验组予以高、中、低剂量黄连素灌胃,对照组和空白组予以等黄连素体积的双蒸水灌胃,治疗周期为12周.酶联免疫吸附法(ELISA)和硝酸酶还原法检测血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)含量;实时荧光定量(RT-qPCR)检测Calpain1和Calpain2 mRNA表达水平;蛋白印记实验检测Cleaved-Caspase 3、Bcl-2、Bax、Calpain1及Calpastatin相对蛋白表达量.结果 ①与空白组相比,对照组TNF-α、IL-1β、IL-6含量均显著上升(P<0.05);与对照组相比,3种剂量组TNF-α、IL-1β、IL-6含量均有不同程度下降(P<0.05).②与空白组相比,对照组Calpain1 mRNA相对水平明显升高(P<0.01),Calpain2 mRNA无明显变化;与对照组相比,高、中、低剂量实验组Calpain1 mRNA相对水平呈剂量依赖性降低,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),而Calpain2无明显变化.③与空白组相比,对照组大鼠心肌组织Calpain1蛋白表达量增多(P<0.01),而Calpastatin蛋白表达明显下降(P<0.01);与对照组相比,实验组大鼠心肌组织Calpastatin蛋白表达明显增多(P<0.05或P<0.01),而Calpain1蛋白表达显著下降(P<0.01),并呈剂量依赖性.④与空白组相比,对照组大鼠心肌组织Bcl-2蛋白表达量明显降低(P<0.01),而Bax和Cleaved-Caspase3表达升高(P<0.01);与对照组相比,实验组大鼠心肌组织Bcl-2蛋白表达增多,Bax和Cleaved-Caspase 3蛋白表达明显下降,并呈剂量依赖性,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01).结论 黄连素能降低冠心病大鼠心肌细胞凋亡,该作用可能与增强Calpain1蛋白表达和活性,下调血清中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平有关.

Inherited retinal degeneration is a major cause of incurable blindness characterized by loss of retinal photoreceptor cells. Inherited retinal degeneration is characterized by high genetic and phenotypic het-erogeneity with several genes mutated in patients affected by these genetic diseases. The high genetic heterogeneity of these diseases hampers the development of effective therapeutic interventions for the cure of a large cohort of patients. Common cell demise mechanisms can be envisioned as targets to treat patients regardless the specific mutation. One of these targets is the increase of intracellular calcium ions, that has been detected in several murine models of inherited retinal degeneration. Recently, neurotroph-ic factors that favor the efflux of calcium ions to concentrations below toxic levels have been identified as promising molecules that should be evaluated as new treatments for retinal degeneration. Here, we discuss therapeutic options for inherited retinal degeneration and we will focus on neuroprotective approaches, such as the neuroprotective activity of the Pigment epithelium-derived factor. The character-ization of specific targets for neuroprotection opens new perspectives together with many questions that require deep analyses to take advantage of this knowledge and develop new therapeutic approaches. We believe that minimizing cell demise by neuroprotection may represent a promising treatment strategy for retinal degeneration.

钙蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin,CAST)在肌肉生长和肉质特征形成中发挥重要作用.为探究草鱼(Ctenopharyngodon idellus)(♀)×赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)(♂)正交F1的肉质相关分子基础,通过RACE(Rapid-amplification of cDNA ends)技术分别克隆了草鱼(♀)×赤眼鳟(♂)F1及其亲本的CAST基因cDNA全长,并利用生物信息学方法分析比较了三种鱼的CAST结构差异.结果表明:草鱼(♀)、赤眼鳟(♂)及草鱼(♀)×赤眼鳟(♂)F1的CAST基因cDNA全长分别为3036、3165和3086 bp,编码901、893和904个氨基酸;预测蛋白质分子量分别为93.72、92.77和94.02 kD;推测的理论等电点分别为5.92、6.01和6.02.草鱼(♀)×赤眼鳟(♂)F1 CAST与草鱼(♀)和赤眼鳟(♂)核苷酸序列相似性分别为94.52％和90％.三种CAST蛋白均包括4个含有典型七肽的钙蛋白酶抑制结构域.草鱼(♀)、赤眼鳟(♂)和F1 CAST氨基酸残基中分别存在73、82和75个潜在的磷酸化修饰位点.蛋白三级结构分析显示草鱼(♀)、赤眼鳟(♂)和F1 CAST中分别含有24、12和20个β-折叠,且均呈链状结构.综合可知,F1 CAST在序列相似度、磷酸化位点数、蛋白质结构及进化地位与草鱼(♀)均更接近.该研究结果为阐明草鱼(♀)×赤眼鳟(♂)正交F1肉质形成机理提供了分子基础.

目的 构建姜黄素(CUR)纳米乳给药系统并研究其对大鼠心肌缺血再灌注的保护作用和作用机制.方法 制备姜黄素纳米乳(CUR-NMs)并通过透射电镜对其进行形态表征;以冠状动脉左前降支结扎法建立大鼠心肌缺血再灌注模型,随机将大鼠分为假手术组、模型组、CUR处理组和CUR-NMs处理组,CUR处理组和CUR-NMs处理组在缺血前4 h分别腹腔注射CUR(20 mg/kg)和CUR-NMs(20 mg/kg)预处理,模型组以等体积溶剂预处理;检测各组大鼠血流动力学变化;TUNEL染色检测大鼠心肌细胞凋亡情况;试剂盒检测CK、LDH、MDA和SOD水平;蛋白印记实验检测心肌calpain1、calpastatin、Bcl-2、cleaved-caspase 3蛋白表达变化.结果 制备的CUR-NMs大小均一,形态圆整,粒径为(121±23)nm.模型组大鼠缺血30 min再松开灌注2 h后LVDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax指标均明显下降(P<0.01),血清LDH、CK、MDA明显升高,SOD显著降低(P<0.01);相较于模型组,CUR处理组和CUR-NMs处理组大鼠LVDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax均有不同程度升高(P<0.05或P<0.01),LDH、CK、MDA显著下降,SOD明显升高(P<0.05或P<0.01);与CUR处理组相比,CUR-NMs处理组LVDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax升高幅度更大(P<0.01),LDH、CK、MDA降低,SOD升高(P<0.05或P<0.01).与假手术组相比,模型组心肌细胞凋亡明显增加(P<0.01),calpain1和cleaved-caspase 3蛋白表达明显上调,Bcl-2和calpastatin蛋白表达显著下调(P<0.01);相较于模型组,CUR处理组和CUR-NMs处理组心肌细胞凋亡明显减少(P<0.01),calpain1和cleaved-caspase 3蛋白表达显著下调,Bcl-2和calpastatin蛋白表达明显上调(P<0.05或P<0.01);与CUR处理组相比,CUR-NMs处理组心肌细胞凋亡明显减少(P<0.01)calpain1 和 cleaved-caspase 3 蛋白表达下调,Bcl-2 和calpastatin蛋白表达上调(P<0.05或P<0.01).结论 CUR-NMs可改善大鼠心肌缺血再灌注损伤,且效果优于CUR;该效应可能与增强细胞摄取、抑制calpain1蛋白表达和活性有关.

目的:观察电针对脊髓损伤大鼠运动功能及钙蛋白酶表达的影响,探讨电针改善急性脊髓损伤的机制.方法:将30只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组和电针组,每组10只.脊髓打击器打击大鼠胸10节段脊髓制备急性脊髓损伤模型.电针组造模后给予督脉穴("脊中"和"命门")电针治疗,每次30 min,1次/d,共治疗28 d.采用Basso Beattie Bresnahan(BBB)评分法对大鼠后肢运动功能进行评估;尼氏染色法观察脊髓组织病理变化;荧光定量PCR法检测脊髓组织中钙蛋白酶calpain1、calpain2及钙蛋白酶抑制蛋白(calpastatin)mRNA表达水平;Western blot法检测脊髓组织中calpain1、calpain2及calpastatin蛋白表达水平.结果:造模后,模型组大鼠BBB评分明显低于假手术组(P<0.01),治疗14、28 d时,电针组BBB评分明显高于模型组(P<0.01).与假手术组比较,模型组脊髓损伤处的神经元数量减少,尼氏体染色细胞减少,甚至消失,而电针组大鼠脊髓神经元形态、尼氏体染色细胞数均优于模型组.与假手术组比较,模型组大鼠脊髓calpain1 mRNA和蛋白表达水平明显升高(P<0.01),calpastatin mRNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.01);与模型组比较,电针组脊髓calpain1 mRNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.01),calpastatin mRNA和蛋白表达水平明显升高(P<0.01);各组calpain2 mRNA和蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05).结论:电针可改善脊髓损伤大鼠的运动功能,该作用可能与抑制损伤脊髓组织中calpain1活性有关.

目的 探讨细胞蛋白质降解通路调控分子在小鼠神经系统中的表达和分布情况.方法 以6周龄野生型C57BL/6J小鼠眼、脑、脊髓、坐骨神经和肌肉组织为材料,采用蛋白质印迹法检测不同组织、解剖部位和亚细胞结构中蛋白质降解通路相关蛋白的分布和表达差异.结果 蛋白质降解通路相关蛋白组织蛋白酶D(Cathepsin D)、溶酶体关联膜蛋白2(lysosomal-associated membrane protein 2,LAMP2)、自噬微管相关蛋白轻链3A/B(microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3,LC3A/B)、自噬相关蛋白3(autophagy-related protein 3,Atg3)、Ras相关GTP结合蛋白7(Ras-related GTP-binding protein 7,Rab7)、钙蛋白酶(Calpain)大小亚基以及钙蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin)在小鼠眼、脑、脊髓和肌肉中均有分布,但表达水平有一定差异.与小鼠脊髓相比,坐骨神经中Calpastatin含量没有明显差异(P＞ 0.05),但泛素、Cathepsin D、LAMP2、LC3A/B、Atg3、Rab7、Calpainl 大亚基含量明显减少(P＜0.05),Calpain小亚基含量明显增加(P ＜ 0.05).结论 生理条件下泛素-蛋白酶体系统和自噬系统在细胞中广泛存在,且在神经元中其主要发生于胞体;而Calpain系统中剪切型Calpain小亚基的含量在轴突束中相对较高,这提示在神经元轴突中Calpain降解通路可能发挥主要功能.