目的:分析RAB7/mTOR/TFEB信号通路在心肌细胞线粒体自噬中的作用及其机制.方法:建立并培养稳定转染的RAB7过表达和阴性对照腺病毒,分别命名为对照组和过表达RAB7组.流式细胞术检测细胞ROS水平和细胞凋亡率,溶酶体和线粒体的相互作用通过共定位的荧光成像显示,应用蛋白印迹测定RAB7、mTOR、TFEB、LC3B-Ⅱ、CaMKIIδ和P62表达水平.结果:与对照组相比,过表达RAB7组mTOR表达升高,TFEB表达降低,ROS水平升高,细胞凋亡率增加,溶酶体和线粒体之间的相互作用显著增加.线粒体自噬相关的LC3B-Ⅱ、CaMKII δ和P62蛋白表达升高(P＜0.01).结论:过表达RAB7可以通过mTOR/TFEB信号通路,增加ROS释放、细胞凋亡和线粒体自噬蛋白表达而促进心肌细胞线粒体自噬激活.

目的 以当归红芪超滤物干预糖尿病肾病模型大鼠,探讨其对糖尿病肾病脂噬的效应机制.方法 50只SPF级雄性Wistar大鼠随机选取7只为空白组,其余43只采用一次性大剂量腹腔注射链脲佐菌素联合高脂高糖饲料喂养制备糖尿病肾病模型.将成模大鼠随机分为模型组、厄贝沙坦组(17.9 mg/kg)和中药低、中、高剂量组(1.5、3、6 g/kg),分别灌胃相应溶液,连续12周.检测大鼠随机血糖、体质量及24 h尿蛋白含量,生化检测糖化血清蛋白(GSP)、血肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、游离脂肪酸(FFA)含量,HE染色观察肾组织形态变化,Masson染色观察肾组织纤维化情况,透射电镜观察肾组织超微结构,RT-qPCR检测肾组织哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、微管相关蛋白1轻链3(LC3B)mRNA表达,Western blot检测肾组织mTOR、转录因子EB(TFEB)、p-TFEB、LC3B蛋白表达.结果 与空白组比较,模型组大鼠随机血糖显著升高(P<0.01),体质量显著减少(P<0.01),24 h尿蛋白含量显著升高(P<0.01),GSP、SCr、BUN、TG、TC、LDL-C、FFA含量显著升高(P<0.01),HDL-C含量显著降低(P<0.01);肾小管上皮细胞空泡变性、胞质空泡化、有大量炎性细胞浸润,胶原纤维增多且分布杂乱,脂滴数量增加,自噬体数量减少;肾组织mTOR mRNA表达显著升高(P<0.01),LC3B mRNA表达显著降低(P<0.01),mTOR、p-TFEB蛋白表达显著升高(P<0.01),TFEB、LC3BⅡ蛋白表达显著降低(P<0.01).与模型组比较,各给药组大鼠给药12周随机血糖、24 h尿蛋白含量降低,体质量增加,GSP、SCr、BUN、TG、TC、LDL-C、FFA含量降低,HDL-C含量升高;肾组织炎性细胞浸润、纤维化、脂滴沉积有不同程度缓解,肾组织mTOR mRNA表达降低,LC3B mRNA表达升高,mTOR、p-TFEB蛋白表达降低,TFEB、LC3BⅡ蛋白表达升高,其中厄贝沙坦组和中药高剂量组差异均有统计学意义(P<0.01,P<0.05).结论 当归红芪超滤物能改善糖尿病肾病模型大鼠糖脂代谢紊乱、拮抗肾脏异位脂质沉积、促进脂噬、延缓糖尿病肾病进程,其机制可能与mTOR/TFEB信号通路有关.

目的 基于腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)介导的自噬流,探讨电针结合运动预处理对大鼠离体心肌缺血再灌注损伤的保护作用及机制.方法 按照随机数字法将 90 只雄性SD大鼠分成对照组、模型组、电针+运动组、电针+运动+生理盐水组、电针+运动+ Compound C组,每组18 只.各预处理组先接受3 周电针干预及运动干预,然后采用Langendorff灌流系统对除对照组外的其他4 组大鼠进行心肌缺血再灌注损伤造模(缺血40 min,复灌120 min),其中电针+运动+生理盐水组、电针+运动+ Compound C组分别在造模前1～2h腹腔注射生理盐水和Compound C.ELISA法检测心肌组织中ATP含量;透射电镜观察心肌组织超微结构;免疫组化染色观察心肌组织中转录因子EB(TFEB)表达情况;Western blot 法检测心肌组织中AMPK、p-AMPK、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、p-mTOR及LC3Ⅱ、p62 蛋白表达情况.结果 模型组大鼠心肌线粒体中ATP含量明显低于对照组(P<0.05),电针+运动组、电针+运动+生理盐水组大鼠心肌线粒体中ATP含量均明显高于模型组和电针+运动+ Compound C组(P均<0.05).透射电镜观察,模型组大鼠心肌细胞胞质中度水肿,线粒体肿胀呈圆形,基质间隙变宽;电针+运动组、电针+运动+生理盐水组大鼠心肌细胞中见自噬小体与散在分布的溶酶体,胞质轻度水肿,线粒体轻度肿胀;电针+运动+Compound C组大鼠线粒体轻度水肿,嵴密度降低.模型组大鼠心肌组织中TFEB阳性表达较对照组显著增加,电针+运动组、电针+运动+生理盐水组TFEB阳性表达较模型组和电针+运动+Compound C组明显减少.电针+运动组、电针+运动+生理盐水组p-AMPK/AMPK比值与LC3Ⅱ蛋白表达量均明显高于模型组和电针+运动+ Compound C 组(P 均<0.05),p-mTOR/mTOR比值与p62 蛋白表达量均明显低于模型组和电针+运动+ Compound C组(P均<0.05).结论 电针结合运动预处理可通过AMPK信号通路促进自噬流,从而减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤.

目的 探讨沉默调节蛋白3(sirtuin3,Sirt3)在胶质瘤细胞U87中的作用,为胶质瘤的早期诊治提供新靶点.方法 基于中国脑胶质瘤数据库(CGGA)、GEPIA2数据库,通过生物信息学分析Sirt3在胶质瘤不同分级的表达情况,通过Western blot检测6位胶质瘤患者癌旁与肿瘤组织中Sirt3的蛋白水平.利用shRNA慢病毒、CRISPR/Cas9系统干预U87细胞Sirt3的表达,采用TUNEL染色、PI-Annexin V双荧光标记检测细胞凋亡情况,Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Cleaved-caspase3及LAMP1、LAMP2、LAMP2A、TFEB、mTOR等蛋白的表达.利用mTOR小分子抑制剂Rapamycin处理Sirt3敲减U87细胞,检测相关蛋白及细胞凋亡的变化.对Sirt3敲除前后的U87细胞进行核质分离实验,并检测p-TFEB蛋白表达的变化.在敲减及敲除Sirt3的U87细胞中分别过表达TFEB及Sirt3后,检测溶酶体膜蛋白表达的变化情况.结果 Sirt3在高级别胶质瘤中高表达,且与患者的低生存率密切相关.敲减Sirt3表达后细胞凋亡增加(P＜0.01),溶酶体膜蛋白LAMP1、LAMP2、LAMP2A显著下调(P＜0.01),p-mTOR显著增加(P＜0.01),通过核质分离实验发现敲除Sirt3后p-TFEB在胞质中增加(P＜0.01).在Sirt3敲除组过表达Sirt3后,LAMP1、LAMP2蛋白水平恢复,且溶酶体数量显著增加(P＜0.01);在Sirt3敲减组过表达TFEB后,LAMPs蛋白表达明显上调(P＜0.01).结论 Sirt3可能通过调控mTOR信号通路影响TFEB的核质分布,上调溶酶体膜蛋白LAMPs表达增强胶质瘤细胞溶酶体功能,进而促进胶质瘤细胞存活和恶性增殖,提示Sirt3可能是胶质瘤临床诊断和进展的分子标志物.

探讨嗜酸性实性和囊性肾细胞癌(eosinophilic solid and cystic renal cell carcinoma,ESC RCC)的临床病理特征、免疫表型、分子改变、鉴别诊断及预后.方法 对解放军东部战区总医院2005至2019年收集的对15例ESC RCC进行光镜观察、免疫组织化学研究、高通量DNA靶向测序及随访,并复习相关文献.结果 15例患者中女性7例,男性8例.患者年龄15~68岁,平均年龄33岁,平均随访22个月,均无病生存.镜下肿瘤呈囊性及实性生长结构,肿瘤细胞胞质丰富嗜酸,胞质内可观察到嗜碱性的颗粒状物或嗜酸性小球.15例ESC RCC细胞角蛋白(CK)20均阳性, 13例CK20呈特征性点灶状阳性表达,CK7多数阴性,仅4例局灶阳性表达,CD10在6例中至少局灶阳性,信号通路相关的指标mTOR、S6的阳性比例分别为14/15和6/15,Cathepsin K、Melan A和HMB45在12/15、6/15和2/15的病例中至少局灶阳性表达,TFE3、TFEB、CA9和CD117均阴性.高通量DNA靶向测序证实10/10的病例中存在TSC1/TSC2基因突变.结论 ESC RCC是一种罕见的肾细胞癌,好发于青壮年,具有独特的形态特征、免疫表型和分子改变,生物学行为惰性,有望成为一种独立的肾癌亚型,明确诊断该肿瘤对患者的治疗方案选择以及预后预测意义重大.

雷帕霉素(Rapamycin,Rap)是一种免疫抑制剂,在临床上主要应用于器官移植过程中的抗排异反应,同时,Rap在抗癌、神经保护和抗衰老等领域也展现出巨大潜力.通过抑制哺乳动物Rap靶蛋白(mammalian target of Rapamycin,mTOR)活性,Rap能够活化调节溶酶体功能的转录因子EB(transcription factor EB,TFEB)从而上调溶酶体功能,同时,Rap也能够去除mTOR对ULK1(unc-51 like autophagy activating kinase 1)的抑制效果从而促进自噬.最新研究显示,Rap能够直接激活溶酶体钙离子通道TRPML1,此效应并不依赖于mTOR;TRPML1通道的开放可释放溶酶体钙离子,钙调神经磷酸酶(Calcineurin)作为此溶酶体来源的钙信号的感受器活化TFEB,进而增强溶酶体功能并促进自噬.此发现拓宽了对Rap药理学机制的认知,为衰老等领域的机制研究提供了理论基础.本文将以经典的Rap-mTOR-ULKl/TFEB信号通路为导引,详细介绍溶酶体钙离子通道TRPML1被确认为Rap新靶标的论证过程,并简要讨论此新信号通路(Rap-TRPMLl-Calcineurin-TFEB)的药理学意义.

目的:探讨β-淀粉样蛋白(amyloid β peptide,Aβ)对阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)模型小鼠脑神经元及小胶质细胞内溶酶体的影响.方法:取6月龄APP/PS1双转基因AD模型小鼠和同窝野生型小鼠各6只,免疫荧光染色观察脑内神经元和小胶质细胞表达以及和溶酶体共表达情况;Western blot检测小鼠脑内自噬相关蛋白表达.用Aβ25-35处理SH-SY5Y细胞后,转录因子EB(transcription factor EB,TFEB)过表达腺病毒干预细胞72 h,Western blot检测TFEB和溶酶体标志物水平.结果:与野生型组小鼠比较,6月龄AD转基因组小鼠LC3、p62蛋白表达增加(t=4.976,P=0.008;t=4.463,P=0.011),溶酶体标志蛋白LAMP1明显减少(t=14.91,P=0.0001).AD模型组小鼠海马区神经元明显丢失,小胶质细胞明显增生,溶酶体表达均明显减少.与野生型组小鼠比较,AD转基因组小鼠磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mammalian target of rapamycin,p-mTOR)/mTOR蛋白表达量明显升高(t=5.501,P=-0.005),TFEB蛋白表达水平明显降低(t=5.899,P=0.004).Aβ25-35处理使SH-SY5Y细胞TFEB和Lamp1蛋白水平均下调(t=10.94,P＜0.001;t=17.22,P＜0.001),过表达TFEB后,溶酶体标志物Lamp1蛋白水平明显升高(t=5.136,P＜0.01).结论:Aβ引起AD转基因小鼠脑内神经元和小胶质细胞内溶酶体均减少,可能通过抑制mTOR/TFEB信号通路发挥作用.

目的 探讨沙格列汀干预非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)合并2型糖尿病(T2DM)大鼠对肝组织腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)-转录因子EB(TFEB)自噬信号通路蛋白表达的影响.方法 将42只大鼠随机分为对照组、模型组和沙格列汀干预组,每组14只.采用高脂饲料喂养和链脲佐菌素腹腔注射构建NAFLD合并T2DM模型.在建模成功后,分别给予沙格列汀或生理盐水灌胃8 w.采用放射免疫法检测空腹胰岛素(INS,使用全自动生化分析仪检测空腹血糖(FPG),计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR).采用Western bloting法检测肝组织p-AMPK、mTOR、TFEB和自噬标记物LC3B-Ⅱ蛋白表达.结果 沙格列汀处理组大鼠体质量、肝质量和肝脏指数分别为(341.53±5.15)g、(11.06±0.49)g和(3.32±0.25)％,显著低于模型组[分别为(353.27±8.74)g、(12.77±0.84)g和(3.67±0.18)％,P＜0.05];FPG、INS 和 HOMA-IR 水平分别为(9.45±0.71)mmol/L、(7.92±0.34)mIU/L 和(3.44±0.36),显著低于模型组[分别为(13.97±0.92)mmol/L、(14.57±0.84)mIU/L 和(9.03±0.91),P＜0.05];TC、TG、ALT 和 AST 水平分别为(3.79±0.17)mmol/L、(0.81±0.13)mmol/L、(68.76±4.11)IU/L 和(54.49±5.21)IU/L,均显著低于模型组[分别为(4.05±0.20)mmol/L、(2.04±0.15)mmol/L、(119.73±3.94)IU/L和(83.27±7.68)IU/L,P＜0.05];肝组织p-AMPK、TFEB和 LC3B-Ⅱ 表达分别为(1.13±0.11)、(1.23±0.13)和(1.17±0.12),显著强于模型组[分别为(0.62±0.07)、(0.48±0.05)和(0.37±0.04)],而mTOR表达为(0.89±0.08),显著弱于模型组[(1.53±0.16),P＜0.05].结论 沙格列汀可能通过调控AMPK/mTOR-TFEB自噬信号通路显著降低NAFLD合并T2DM大鼠血糖和血脂水平,改善肝脂肪变.

受体相互作用蛋白3(receptor-interacting protein 3,RIP3)是一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶,因其参与细胞自噬的调控而受到广泛关注.本文就RIP3 在细胞自噬的发展和调控机制中的作用进行了总结.RIP3 可参与mTOR信号通路的调节,同时与多种自噬所必须的蛋白发生相互作用,包括GNAI3/RGSI9、P62 和TFEB等,从而其在自噬启动、自噬体形成和自噬溶酶体成熟等多个阶段发挥正向或负向调控作用,为进一步探究RIP3 对细胞程序性死亡的调控机制及相关疾病治疗的潜在分子靶标筛选提供参考.