目的:探讨垂体生长激素(GH)细胞腺瘤中差异表达的微小RNAs(miRNAs)及其靶基因的生物学功能和两者的调控关系。方法:利用miRDB、miRwalk、Targetscan7.2及starbase数据库对差异表达的miRNAs进行靶基因预测并对靶基因进行GO、KEGG和蛋白-蛋白相互作用网(PPI)分析，随后筛选出有意义的核心靶基因，取核心靶基因和数据库的mRNAs测序结果进行对比，构建可视化的miRNAs-靶基因调控关系网。结果:以蛋白相互作用程度≥20为标准，本研究得到113个上调的miRNAs核心靶基因和128个下调的miRNAs核心靶基因，进一步取交集得到13个目的核心靶基因，这些基因主要涉及的通路为泛素介导蛋白水解通路，其相对应的调控miRNAs为miR-15b、miR-365、miR-32-3p、miR-486-5p。结论:本研究应用生物信息学分析工具构建了与GH细胞腺瘤密切相关的miRNAs-核心靶基因相互调控网，发掘了一些可能与GH细胞腺瘤发病机制和病理过程有关的蛋白和通路。

目的:探讨微小RNA(miRNA，miR)-365在胆囊癌中的表达及其对肿瘤进展的影响。方法:选取2019年6月到2021年6月商丘市第一人民医院收治的53例胆囊癌患者的肿瘤组织和癌旁组织作为研究对象，采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)分析胆囊癌组织和癌旁组织中miR-365表达水平。以人胆囊癌细胞株GBC-SD为研究对象，转染对照miRNA和miR-365模拟物，建立对照组和观察组细胞系，采用细胞计数试剂盒(CCK-8)分析细胞增殖活力，采用体外移植瘤实验分析细胞体内增殖能力，采用流式细胞术分析细胞凋亡比例，采用Transwell分析细胞的迁移能力，采用蛋白质印迹法(Western blot)分析细胞上皮-间充质转化能力和凋亡相关蛋白表达。组间计量数据比较采用 t检验。 结果:癌旁组织中miR-365表达水平(0.92±0.12)明显高于胆囊癌组织(0.54±0.16)，差异有统计学意义( t＝14.001， P<0.05)。对照组细胞吸光度( A)值(1.90±0.12)明显高于观察组(1.26±0.17)，差异有统计学意义( t＝7.737， P<0.05)。对照组细胞肿瘤体积[(666.33±66.97) mm 3]明显高于观察组[(399.17±46.23) mm 3]，差异有统计学意义( t＝8.041， P<0.05)。对照组细胞肿瘤质量[(3.56±0.45) g]明显高于观察组[(2.01±0.11) g]，差异有统计学意义( t＝8.236， P<0.05)。对照组细胞凋亡比例[(3.48±0.53)%]明显低于观察组[(25.25±3.51)%]，差异有统计学意义( t＝15.080， P<0.05)。Transwell结果显示，对照组细胞迁移数量[(89.67±8.29)个]明显低于观察组[(42.33±9.11)%]，差异有统计学意义( t＝9.412， P<0.05)。对照组细胞上皮细胞标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)蛋白表达水平(1.08±0.08)明显低于观察组(1.99±0.15)，差异有统计学意义( t＝12.850， P<0.05)。对照组细胞角形蛋白(Vimentin)和N-钙黏蛋白(N-cadherin)蛋白表达水平(1.08±0.07、1.50±0.11)明显高于观察组(0.71±0.05、0.69±0.12)，差异有统计学意义( t＝10.420、11.880， P<0.05)。对照组细胞第10号染色体上缺失与张力蛋白同源的磷酸酯酶基因(PTEN)蛋白和FasL蛋白表达水平(0.60±0.09、0.78±0.13)明显低于观察组(0.97±0.12、1.75±0.0.13)，差异有统计学意义( t＝6.065、13.190， P<0.05)。 结论:miR-365在胆囊癌中呈低表达，作为抑癌基因参与了胆囊癌细胞的增殖、凋亡、迁移和上皮-间充质转化等细胞生物学行为。

目的 探究微小RNA(miRNA)-365a-3p影响血管内皮细胞功能参与子痫前期(PE)的发病机制.方法 分离原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs),设为NC组(转染miR-365a-3p NC)、mimics组(转染miR-365a-3p mimics)、inhibitor组(转染miR-365a-3p inhibitor),另取对数期细胞设为空白组.检测各组增殖、迁移及血管形成能力.双荧光素酶实验验证miR-365a-3p与下游基因的靶向关系.检测各组TGF-β1、Smad4、Smad7蛋白表达.结果 与空白组、NC组比较,mimics组24、48、72 h吸光度值及迁移率降低(P＜0.05),每个视野的管状结构数量减少(P＜0.05),inhibitor组24、48、72 h吸光度值及迁移率升高(P＜0.05),每个视野的管状结构数量增加(P＜0.05).双荧光素酶实验表明Smad7是miR-365a-3p的一个靶基因.与空白组、NC组比较,mimics组转化生长因子-β1(TGF-β1)、Smad4蛋白表达升高(P＜0.05),Smad7蛋白表达降低(P＜0.05),inhibitor组TGF-β1、Smad4蛋白表达降低(P＜0.05),Smad7蛋白表达升高(P＜0.05).结论 miR-365a-3p可能通过调控下游TGF-β信号通路影响血管内皮细胞功能,从而参与PE发病.

目的 探究血清及肝癌组织中长链非编码RNA(LncRNA)人去泛素化酶含有卵巢肿瘤结构域的6B反义RNA1(OTUD6B-AS1)、微RNA-365a-3p(miR-365a-3p)的表达水平与肝癌病人临床病理特征及预后的关系.方法 纳入2015年3月至2017年3月海南医学院第一附属医院收治的肝癌病人86例(肝癌病人组),同时募集同期体检的健康志愿者86例(健康对照组),收集所有研究对象的临床资料.采用qRT-PCR法检测血清及肝癌组织中LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p表达;Star?base数据库预测LncRNA OTUD6B-AS1与miR-365a-3p之间的关系;使用Pearson分析血清中LncRNA OTUD6B-AS1与miR-365a-3p表达的相关性;绘制Kaplan-Meier生存曲线分析血清中LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p表达与病人5年生存率之间的关系;Cox回归分析肝癌病人预后的影响因素.结果 与健康对照组比较,肝癌病人组血清中LncRNA OTUD6B-AS1高表达(1.59±0.41比1.02±0.32),miR-365a-3p低表达(0.42±0.15比1.05±0.26)(P<0.05).肝癌组织中LncRNA OTUD6B-AS1表达水平高于癌旁组织(1.70±0.44比0.97±0.16),miR-365a-3p表达水平低于癌旁组织(0.53±0.17比1.01±0.14)(P<0.05).血清中Ln?cRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p表达与TNM期、淋巴结转移以及分化程度相关(P<0.05).生物信息学预测显示LncRNA OTUD6B-AS1与miR-365a-3p之间存在靶向结合位点.Pearson分析显示,肝癌病人血清中LncRNA OTUD6B-AS1与miR-365a-3p表达存在负相关(r=?0.47,P<0.05).LncRNA OTUD6B-AS1低表达组肝癌病人的5年生存率高于LncRNA OTUD6B-AS1高表达组(37.21％比13.95％,χ2=6.11,P=0.013);miR-365a-3p高表达组肝癌病人的5年生存率高于miR-365a-3p低表达组(41.86％比9.30％,χ2=8.03,P=0.005).LncRNA OTUD6B-AS1高表达以及miR-365a-3p低表达是影响肝癌病人死亡的独立危险因素(P<0.05).结论 LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p在肝癌病人血清及肝癌组织中分别呈高、低表达,二者均与TNM期、淋巴结转移、分化程度等临床病理特征以及预后有关.

目的 鉴定粪类圆线虫感染性Ⅲ期幼虫(iL3)和寄生性雌虫(pF)的微小RNA(miRNA),分析差异表达miRNA及其靶基因的功能.方法 从粪类圆线虫感染犬粪便中收集iL3.取4 000～5 000条iL3于颈后皮下注射感染健康犬,感染后21 d,从肠道中采集pF.提取iL3和pF的总RNA并测序.测序数据与粪类圆线虫基因组和鼠类圆线虫miRNA比对筛选保守的miRNA,用miRDeep2通过颈环结构分析、成熟序列比对筛选miRNA.分析iL3和pF的miRNA表达谱,筛选差异表达miRNA,预测差异表达miRNA的靶基因,对log2(差异倍数)＞1和每百万转录本上的读数(TPM)＞1 000的未注释miRNA的靶基因功能进行分析.用ClusterProfiler对差异表达miRNA靶基因进行GO富集分析.选取11个未注释或保守的差异表达miRNA进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证,以粪类圆线虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GenBank登录号:BI773092.1)为参照基因,计算差异表达miRNA的相对转录水平.结果 共鉴定出265个miRNA,包括130个保守的miRNA和135个未注释的miRNA.其中,134个miRNA在iL3和pF之间差异表达(包含77个保守的miRNA和57个未注释的miRNA),251个为iL3和pF所共有,10个为iL3特有,4个为pF特有.差异表达miRNA靶基因预测结果显示,57个未注释的miRNA中,有12个差异倍数＞2且TPM＞1 000,有248个靶基因与秀丽隐杆线虫同源,其中35.08％(87/248)的靶基因与发育相关,其余与应激、运动和蜕皮等相关.大部分在pF高表达未注释的miRNA靶向SSTP_0000114700.差异表达miRNA靶基因的GO分析结果显示,共5 595个靶基因被富集,其中富集靶基因数居前5位的分别为膜组成成分(1821个)、核酸结合(561个)、细胞核(450个)、蛋白质水解作用(365个)和信号传导(284个).qRT-PCR验证结果显示,sst-miR-86-5p、sst-84-5p、sst-novel-104、sst-miR-92-3p、sst-miR-34a-3p、sst-miR-81a-5p、sst-miR-1-3p、sst-novel-108、sst-miR-124-5p、sst-miR-50-3p、sst-novel-51 的 log2(差异倍数)分别为-2.13、6.39、4.46、-3.69、-3.69、2.34、-2.48、-2.41、-2.30、2.25、-3.32,转录组分析获得的 log2(差异倍数)分别为-3.05、4.98、4.07、-4.9、-3.66、0.98、-3.79、-2.61、-0.99、0.63、-1.55.qRT-PCR与转录组分析获得的上调、下调趋势结果一致.结论 获得粪类圆线虫感染性Ⅲ期幼虫和寄生性雌虫的miRNA表达谱和差异表达miRNA,差异表达miRNA与粪类圆线虫的生长发育和繁殖功能相关.

目的 探讨微小RNA-365 (miR-365)和E74样受体4(ELF4)在宫颈癌中的表达、作用和临床意义.方法 采用实时定量PCR方法检测miR-365在正常宫颈组织(n=34)、宫颈上皮内瘤变Ⅰ级(CIN Ⅰ)(n=31)、宫颈上皮内瘤变Ⅱ～Ⅲ级(CINⅡ～Ⅲ)(n=37)和宫颈鳞癌组织(SCC)(n=33)以及3种宫颈癌细胞系(C33A细胞、HeLa细胞、SiHa细胞)中的表达;生物信息学预测和荧光素酶报告基因检测验证miR-365对ELF4的靶向调控;Western blot方法检测ELF4在宫颈癌细胞中的表达;采用免疫组织化学方法检测不同病理宫颈组织中ELF4表达变化;CCK8实验检测不同时间点下过表达或抑制miR-365的表达对3种宫颈癌细胞株增殖的影响;分析miR-365和ELF4表达的相关性及其与SCC临床病理参数的关系.结果 实时荧光定量PCR结果表明,与正常宫颈组织相比,在CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ、SCC组织中miR-365的表达随着病理程度的加深逐渐下调;并且与正常宫颈上皮细胞(HcerEpic)比较,miR-365在不同宫颈癌细胞系中表达均有不同程度的下调;报告基因分析结果证实ELF4是miR-365的直接靶点;Western blot实验结果显示,与正常宫颈上皮细胞比较,3种宫颈癌细胞系中ELF4的表达均升高(P =0.013,P=0.000,P=0.004);免疫组织化学实验证实ELF4在CIN和宫颈癌组织中的表达均上调.CCK8检测结果证实,在宫颈癌细胞中过表达或抑制miR-365表达显著抑制或促进细胞的增殖活性(P＜0.05).另外,在CINⅡ～Ⅲ和SCC组中,miR-365和ELF4的表达水平呈负相关性(CINⅡ～Ⅲ:r=-0.351,P=0.045;SCC:r=-0.349,P=0.035);临床资料分析显示miR-365和ELF4 mRNA的表达均与肿瘤大小、病理分级及临床分期相关(P均＜0.05).结论 miR-365在人宫颈癌细胞中表达下调,解除对下游靶分子ELF4的抑制作用,从而促进宫颈癌细胞的增殖和肿瘤的形成.

目的 探究肺结核患者外周血CD+8 T细胞中 γ 干扰素(IFN-γ)和微小RNA(miR)-365a表达水平、相关性及临床意义.方法 选取2017年3月 ～2017年6月青海省人民医院收治的肺结核患者53例为肺结核组,以同期进行体检的健康志愿者47例为对照组,磁珠法分离外周血中分离CD+8 T细胞,应用流式细胞术检测外周血CD+8 T细胞中IFN-γ 表达水平,应用荧光定量PCR检测CD+8 T细胞中miR-365a表达水平,分析IFN-γ、miR-365a表达水平与临床参数的关系及两者表达的相关性.结果 肺结核组外周血CD+8 T细胞中IFN-γ 及miR-365a表达水平显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05).抗结核治疗时间<3个月、3～6个月、>6个月的CD+8 T细胞中IFN-γ、miR-365a表达水平比较,差异有统计学意义(P<0.05),且随抗结核治疗时间的延长而降低(P<0.05);治疗前痰抗酸染色涂片阳性的患者其CD+8 T细胞中IFN-γ、miR-365a表达水平显著高于痰抗酸染色涂片阴性的患者(P<0.05).肺结核患者CD+8 T细胞中IFN-γ 与miR-365a表达水平呈显著正相关性(r=0.786,P=0.000).结论 肺结核患者外周血CD+8 T细胞中INF-γ、miR-365a表达明显升高,两者呈显著正相关,有望成为动态监测肺结核病情变化的参考指标.

目的:分析游离二氧化硅(silicon dioxide,SiO2)粉尘刺激的RAW264.7巨噬细胞源性外泌体miRNA的表达差异.方法:以SiO2(200 mg/L)刺激RAW264.7巨噬细胞48 h(exo_48 h组)后收集上清液,超速离心法提取上清中的外泌体;使用透射电镜扫描、纳米微粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)技术、蛋白质印迹法鉴定外泌体;提取外泌体miRNA行高通量测序,比较exo_control组(以不含SiO2粉尘的培养基孵育RAW264.7巨噬细胞48 h)与exo_48 h组外泌体miRNA表达差异;采用miRanda,TargetScan和starBase 3个软件进行差异miRNA的靶基因预测,对靶基因进行GO(gene ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析,进一步分析基因的生物学功能.结果:在透射电镜下,外泌体为不均匀分布的、圆形或椭圆形的、脂质膜包被的、直径30～100 nm的囊泡;粒径检测显示其体积峰度集中在40～100 nm;蛋白质印迹法显示外泌体标志蛋白质TSG101表达阳性.高通量测序筛选出148个差异表达的外泌体miRNA.与exo_control组相比,exo_48 h组miR-219c-3p,let-7d-3p,let-7a-1-3p,miR-328-3p,miR-365-3p,miR-7219-3p等显著上调,miR-378d和miR-5106等显著下调.靶基因预测结果、GO和KEGG分析结果显示靶基因主要富集在mTOR信号通路、Wnt信号通路、TGF-β信号通路等.结论:SiO2诱导的巨噬细胞产生的外泌体包含丰富的miRNA,且其表达存在显著差异,这些差异的miRNA可能参与了肺成纤维细胞的活化、上皮间质转化等过程.

目的 建立子痫前期胎盘组织miRNA差异表达谱并对其生物学功能进行分析,探讨差异表达谱中变化最显著的miR-365a-3p参与子痫前期发病的相关机制.方法 采用高通量测序技术对子痫前期和正常胎盘组织(各3例份)进行miRNA表达谱测序,DeSeq2分析差异表达,对差异表达miRNA的靶基因进行GO及KEGG功能富集分析.可视化软件StarBase 3.0显示miR-365a-3p(差异表达谱中表达上调最显著的miRNA)与TGF-β通路关键基因SMAD2、MAPK1的3′非编码区均存在靶向结合位点.采用real-time PCR法检测子痫前期和正常胎盘组织(各41例份)miR-365a-3p及SMAD2、MAPK1 mRNA表达,并分析其相关性.结果 与正常胎盘组织相比,子痫前期胎盘组织中有44个miRNA差异表达,其中12个miRNA表达显著上调、32个miRNA表达显著下调.GO及KEGG富集分析结果显示,差异表达miRNA潜在靶基因主要参与子宫内膜癌、TGF-β信号通路、Wnt信号通路、急性粒细胞白血病、mTOR信号通路、醛固酮调节钠的重吸收、慢性粒细胞白血病、胰岛素信号通路、ErbB信号通路、癌症发生等.子痫前期胎盘组织miR-365a-3p相对表达量高于正常胎盘组织,SMAD2、MAPK1 mRNA相对表达量均低于正常胎盘组织(P均<0.01).子痫前期胎盘组织中miR-365a-3p与SMAD2、MAPK1 mRNA表达均呈显著负相关关系(P均<0.05).结论 子痫前期胎盘组织存在异常表达的miRNA,并参与诸多信号通路;子痫前期胎盘组织miR-365a-3p表达升高,其可能通过负性调控TGF-β信号通路参与子痫前期的发病.

目的 探讨糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)患者尿沉渣microRNA表达谱在DN无创性诊断中的价值.方法 6例DN患者和9例非糖尿病肾病(non-diabetic renal disease,NDRD)患者为筛选队列,采用Human microRNAV21.0芯片筛选尿沉渣中差异性表达的microRNAs.24例DN患者(DN组)和49例NDRN患者(NDRN组)为验证队列,采用实时荧光定量PCR法检测2组差异性表达的microRNAs相对表达量,并绘制ROC曲线,评估差异性表达的microRNAs在无创性DN诊断中的价值.结果 6例DN患者和9例NDRD患者尿沉渣中筛选出8个差异性表达的microRNAs.DN组患者尿沉渣中miR-31-3p、miR-135b-5p、miR-1290相对表达量(0.551±0.159、0.374±0.104、0.266±0.066)明显高于NDRD组(0.191±0.440、0.143±0.027、0.108±0.013) (P＜0.05),miR-7109-5p、miR-665、miR-4697-5p、miR-486-5p、miR-365a-3p相对表达量与NDRD组比较差异无统计学意义(P＞0.05).差异性表达的miR 31 3p、miR-135b-5p和miR-1290相对表达量的最佳截断值分别为0.216、0.087、0.156时,无创性诊断DN的AUC分别为0.691(95％CI:0.562～0.820)、0.698(95％CI:0.576～0.820)、0.653(95％CI:0.502～0.804),灵敏度分别为54.2％、79.2％、58.3％,特异度分别为79.2％、55.1％、86.4％.结论 DN患者尿沉渣中miR-31-3p、miR-135b-5p、miR-1290有可能成为DN特异性无创诊断标志物.