Background::As one of the early discovered long non-coding RNAs (lncRNA), taurine upregulation gene 1 ( TUG1) has been widely expressed in a variety of tumors. Moreover, it promotes cell proliferation, differentiation, apoptosis, and migration. However, our understanding of its importance in the pathogenesis of cataracts remains limited. This study aimed to explore the mechanism by which lncRNA TUG1 mediates lens epithelial cell apoptosis in age-related cataracts (ARC) by regulating the microRNAs (miR-29b)/second mitochondria-derived activator of caspases axis, and to identify more non-surgical strategies for cataract treatment. Methods::The messenger RNA expression levels of TUG1, miR-29b, and Smac were detected using quantitative real-time polymerase chain reaction in vivo and in vitro. The expression of the Smac protein was analyzed by Western blotting and immunofluorescence. Flow cytometry and cell counting kit-8 assays were used to detect the cell apoptosis and proliferation rates, respectively. The targeted regulatory relationship between lncRNA TUG1, miR-29b, and Smac was verified by viral vector construction, co-transfection, nuclear and cytoplasmic separation, luciferase reporter assays, and RNA immunoprecipitation. Results::TUG1 and Smac were expressed at high levels in ARC and HLE-B3 cells treated with 200 μmol/L H 2O 2, whereas miR-29b expression was decreased. In vitro cell experiments confirmed that down-regulation of TUG1 could inhibit the apoptosis of lens epithelial cells. Mechanistically, Smac expression was negatively regulated by miR-29b. TUG1 competitively inhibited miR-29b expression and caused greater release of Smac. In addition, miR-29b partially reversed the effects of TUG1 on human lens epithelial cell line cells. Conclusions::lncRNA TUG1 increases Smac expression and promotes apoptosis of lens epithelial cells in ARC by competitively inhibiting miR-29b. This mechanism is the cytological basis for ARC formation. Based on these results, the lncRNA TUG1/miR29b/Smac axis may be a new molecular pathway that regulates ARC development.

Background::Acute kidney injury (AKI) is a common complication in patients, especially elderly patients, who undergo cardiac surgery with cardiopulmonary bypass. Studies have indicated a protective role of autophagy in AKI. However, the mechanisms underlying the regulatory effect of autophagy in AKI among patients undergoing cardiac surgeries are poorly understood. In this study, we aimed to test the hypothesis that exosomal microRNAs (miRNAs) regulate autophagy in tubular epithelial cells after AKI.Methods::Plasma exosomal RNA was extracted from young and elderly AKI patients undergoing cardiac surgery, and the miRNAs expression during the perioperative period were analyzed using next-generation sequencing. The screened miRNAs and their target genes were subjected to gene oncology function and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome enrichment analyses. Renal tubular epithelial cell line (HK-2 cells) was cultured and hypoxia/reoxygenation (H/R) model was established, which is an in vitro renal ischemia/reperfusion (I/R) model. We used Western blot analysis, cell viability assay, transfection, luciferase assay to investigate the mechanisms underlying the observed increases in the levels of renal I/R injury-mediated exosomal miRNAs and their roles in regulating HK-2 cells autophagy. Results::miR-590-3p was highly enriched in the plasma exosomes of young AKI patients after cardiac surgery. Increased levels of miR-590-3p led to the increases in the expression of autophagy marker proteins, including Beclin-1 and microtubule associated protein 1 light chain 3 beta (LC3II), and prolonged the autophagic response in HK-2 cells after H/R treatment. These effects were achieved mainly via increases in the exosomal miR-590-3p levels, and the tumor necrosis factor receptor-associated factor 6 protein was shown to play a key role in I/R injury-mediated autophagy induction.Conclusion::Exosomes released from HK-2 cells after renal I/R injury regulate autophagy by transferring miR-590-3p in a paracrine manner, which suggests that increasing the miR-590-3p levels in HK-2 cell-derived exosomes may increase autophagy and protect against kidney injury after renal I/R injury.

目的:探讨DNA损伤激活的非编码RNA（NORAD）在高糖诱导小鼠肾小球系膜细胞增殖及凋亡中的作用及机制。方法:根据培养基中葡萄糖浓度将小鼠肾小球系膜细胞SV40-MES-13分为高糖组及低糖组，处理24 h后转染NORAD小干扰RNA（si-NORAD）及Toll样受体4（TLR4）小干扰RNA（si-TLR4），实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测NORAD及TLR4的表达。在SV40-MES-13细胞中分别转染NORAD、TLR4过表达质粒及小干扰RNA。Cell Counting Kit-8（CCK-8）、5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷（EdU）染色及流式细胞术检测细胞增殖和凋亡结果；共转染NORAD和miR-520h模拟剂，TLR4和miR-520h模拟剂后检测荧光素酶强度及三者表达情况；共转染si-NORAD和miR-520h抑制剂、TLR4过表达质粒和miR-520h模拟物以及共转染si-TLR4和miR-520h抑制剂后检测三者水平及细胞增殖水平来验证三者的调节关系。结果:高糖处理小鼠系膜细胞SV40-MES-13后，NORAD（1.65±0.08比1.00±0.06， P=0.003）及TLR4（1.96±0.09比1.01±0.07， P=0.001）的表达均升高。NORAD及TLR4过表达后细胞增殖加快（1.34±0.04比0.85±0.04， P=0.001；1.33±0.02比0.82±0.03， P<0.001），细胞凋亡减少（0.45±0.03比0.94±0.06， P=0.001；0.51±0.05比0.99±0.03， P=0.001）。双荧光素酶报告基因结果显示，miR-520h能与NORAD及TLR4结合；NORAD与miR-520h表达相互影响，miR-520h模拟物可减少TLR4表达。与单独转染si-NORAD相比，共转染si-NORAD及miR-520h抑制剂时TLR4相对表达量升高（0.74±0.03比0.55±0.03， P=0.014）；与单独转染miR-520h模拟物相比，共转染miR-520h模拟剂及TLR4过表达质粒后细胞增殖更快（0.73±0.01比0.61±0.02， P=0.007）；与单独转染miR-520h抑制剂相比，共转染miR-520h抑制剂及si-TLR4后细胞增殖减少（1.31±0.04比1.55±0.04， P=0.013）。 结论:NORAD可结合miR-520h调节TLR4促进高糖诱导系膜细胞增殖及抑制凋亡。

目的:探讨ST8SIA6-AS1靶向结合微小RNA(microRNA，miR)-142-3p，影响肝细胞癌的增殖和侵袭能力。方法:用基因表达谱数据动态分析(GEPIA)验证ST8SIA6-AS1在肝细胞肝癌(HCC)和邻近正常组织中的差异表达。采用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测ST8SIA6-AS1和miR-142-3p在组织水平和细胞水平的表达量。采用细胞计数试剂盒(CCK-8)和集落形成实验检测人肝癌细胞Hep3B的增殖情况；采用迁移侵袭实验(Transwell法)检测肝癌Hep3B细胞迁移和侵袭情况。生物信息学、双荧光素酶报告实验验证ST8SIA6-AS1与miR-142-3P的靶向关系。组间采用 t检验，多组间采用单因素方差分析进行比较，相关性分析采用Spearman秩检验。 结果:GEPIA结果显示ST8SIA6-AS1在肝癌组织中的表达明显高于正常组织。RT-qPCR结果显示ST8SIA6-AS1在HCC中的表达明显高于癌旁组织(0.778±0.363比1.951±0.575， t＝11.370， P<0.05)，差异有统计学意义。miR-142-3p在肝癌组织的表达量显著低于癌旁组织(0.881±0.374比0.371±0.164， t＝9.395， P<0.05)，差异有统计学意义。ST8SIA6-AS1在4种人HCC细胞株(HepG2、SMMC-7721、HCCLM3和Hep3B)的表达(3.84±0.27、5.81±0.60、4.47±0.55、5.94±0.69)明显高于正常肝细胞株L02(1.00±0.09， t＝17.280， t＝13.730， t＝10.780， t＝12.300， P<0.05)，差异有统计学意义，ST8SIA6-AS1在敲低ST8SIA6-AS1的Hep3B细胞中的相对表达量低于对照组(0.26±0.04比1.00±0.01， t＝9.423， P<0.05)，差异有统计学意义。集落形成实验结果显示，敲低ST8SIA6-AS1的Hep3B细胞集落个数显著低于对照组[(32.60±6.70)个比(100.00±10.00)个， t＝10.040， P<0.05]，差异有统计学意义；CCK-8实验中敲低ST8SIA6-AS1的Hep3B细胞72 h吸光度( A)值低于对照组[(0.71±0.06)%比(1.14±0.09)%， t＝6.886， P<0.05]，差异有统计学意义。Transwell实验结果显示敲低ST8SIA6-AS1的Hep3B细胞垂直迁移率明显低于对照组[(53.38±6.49)%比(100.00±13.00)%， t＝5.641， P<0.05]，差异有统计学意义。敲低ST8SIA6-AS1的Hep3B细胞的侵袭率低于对照组[(44.98±8.42)%比(100.00±10.00)%， t＝7.485， P<0.05]，差异有统计学意义。双荧光素酶报告实验证实miR-142-3p过表达组明显低于对照组ST8SIA6-AS1-野生型(WT)细胞的荧光活性，ST8SIA6-AS1负向调控miR-142-3p的表达(0.42±0.05比1.00±0.09， t＝9.757， P<0.05)。干扰ST8SIA6-AS1的表达可对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭产生抑制作用，这种作用可通过沉默miR-142-3p发生逆转。 结论:ST8SIA6-AS1可通过竞争性结合miR-142-3p在肝癌中发挥致癌作用。

目的:探讨微小RNA(miRNA，miR)-25过表达对食管癌TE1、KSYE-150细胞增殖与侵袭的影响。方法:实验样本均来自青岛市中医院2016年1月至2017年6月45例食管癌患者肿瘤组织、癌旁正常组织(距肿瘤边缘>5 cm，且病理检查无癌细胞浸润)。实验分为空白对照组、阴性对照组、模拟物转染组、抑制物转染组，分别将miR-25模拟物、抑制物转入食管癌TE1、KSYE-150细胞株，检测miR-25表达水平、TE1、KSYE-150细胞增殖能力及细胞周期变化。多组间比较行单因素方差分析，两组比较行配对 t检验。 结果:(1)食管癌组织miR-25表达(1.288±0.214)明显高于正常组织miR-25表达( t＝33.058， P<0.01)；(2)TE1细胞模拟物转染组miR-25表达(2.452±0.360)明显高于阴性对照组，抑制物转染组miR-25表达(0.576±0.110)明显低于阴性对照组( t＝8.212、7.553， P<0.05， P<0.01)；KSYE-150细胞模拟物转染组miR-25表达(3.124±0.450)明显高于阴性对照组，抑制物转染组miR-25表达(0.624±0.120)明显低于阴性对照组( t＝10.297、6.452， P<0.05， P<0.01)，差异有统计学意义；(3)转染24、48、72、96 h，模拟物转染组TE-1细胞活性(35.25±5.24、96.45±8.21、165.36±18.24、223.45±20.24)明显高于阴性对照组( t＝11.137、9.216、7.575、10.547， P<0.05， P<0.01)，抑制物转染组TE-1细胞活性(4.21±0.72、22.36±4.21、52.15±7.36、63.45±7.36)明显低于阴性对照组( t＝4.874、8.940、6.830、7.368， P<0.05， P<0.01)；模拟物转染组KSYE-150细胞活性(42.36±6.36、102.65±13.45、172.36±22.45、242.31±25.35)明显高于阴性对照组( t＝12.449、7.381、7.110、10.464， P<0.05， P<0.01)；抑制物转染组KSYE-150细胞活性明显低于阴性对照组(5.42±0.75、25.12±7.24、62.45±8.36、67.36±8.45)( t＝5.827、6.699、4.872、6.689， P<0.05)，差异均有统计学意义；(4)模拟物转染组TE-1细胞G 0/G 1期(46.52±6.20)明显低于阴性对照组，S期(46.96±7.12)明显高于阴性对照组( t＝4.096，5.044， P<0.05)，抑制物转染组TE-1细胞G 0/G 1期(84.52±7.54)明显高于阴性对照组，S期(6.05±0.78)明显低于阴性对照组( t＝4.352，13.715， P<0.05， P<0.01)；模拟物转染组KSYE-150细胞G 0/G 1期(44.36±6.32)明显低于阴性对照组，S期(49.25±6.58)明显高于阴性对照组( t＝4.544，5.009， P<0.05， P<0.01)，抑制物KSYE-150细胞G 0/G 1期(81.25±7.43)明显高于阴性对照组，S期(8.78±1.12)明显低于阴性对照组( t＝4.577，10.127， P<0.05， P<0.01)。 结论:miR-25过表达将促进食管癌细胞株TE-1、KSYE-150增殖与侵袭，抑制miR-2表达会抑制食管癌细胞株TE-1、KSYE-150增殖，促进癌细胞凋亡。

目的:探讨微小RNA(miRNA，miR)-149调控卵巢癌细胞增殖和转移的影响及其分子机制。方法:选取2019年1月至2021年1月河南大学淮河医院手术切除的47例卵巢癌组织和癌旁组织作为研究对象，采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)分析肿瘤组织和癌旁组织中miR-149水平。并采用荧光定量PCR分析人卵巢上皮细胞HOSEpiC、卵巢癌细胞SW620和skov3中miR-149水平；采用miRNA和miR-149慢病毒感染SW620细胞，命名为miRNA组和miR-149组，采用细胞计数试剂盒(CCK-8)分析两组细胞的增殖能力；采用流式细胞术分析两组细胞凋亡和周期变化；采用Transwell分析两组细胞的迁移能力；生物信息学和双荧光素酶报告基因分析miR-149的靶基因；采用蛋白质印迹法(Western blot)分析miR-149靶蛋白表达、增殖、凋亡、周期和迁移相关蛋白表达水平。组间计量数据比较采用 t检验。 结果:癌旁组织miR-149表达水平(1.07±0.15)明显高于卵巢癌组织(0.73±0.09)，差异有统计学意义( t＝13.490， P<0.05)。人卵巢上皮细胞HOSEpiC miR-149表达水平(1.27±0.10)明显高于卵巢癌细胞SW620和skov3(0.80±0.08、0.70±0.08)，差异有统计学意义( t＝8.859、10.740， P<0.05)。miRNA对照组细胞48 h吸光度值(1.91±0.08)明显高于miR-149组(1.23±0.18)，差异有统计学意义( t＝8.655， P<0.05)。miRNA对照组细胞凋亡比例[(3.69±1.06)%]明显低于miR-149组[(18.90±2.35)%]，差异有统计学意义( t＝14.470， P<0.05)。miRNA对照组细胞G 0/G 1期比例[(39.91±2.86)%]明显高于miR-149组[(31.33±2.42)%]，差异有统计学意义( t＝5.616， P<0.05)。miRNA对照组细胞S期比例[(16.73±1.51)%]明显低于miR-149组[(20.48±2.04)%]，差异有统计学意义( t＝3.619， P<0.05)。miRNA对照组细胞凋亡比例[(127.67±21.69)个]明显高于miR-149组[(99.50±10.21)个]，差异有统计学意义( t＝2.887， P<0.05)。miRNA对照组细胞细胞核增殖抗原(Ki-67)和黏着斑激酶(FAK)蛋白表达水平(0.94±0.06、0.91±0.05)明显高于miR-149组(0.73±0.06、0.59±0.08)，差异有统计学意义( t＝8.655、8.488， P<0.05)。RGS17是miR-149的靶基因。癌旁组织中RGS17蛋白表达水平(0.97±0.02)明显低于卵巢癌细胞RGS17蛋白表达水平(2.17±0.11)，差异有统计学意义( t＝15.620， P<0.05)。miRNA对照组细胞FAK蛋白表达水平(1.24±0.09)明显高于miR-149组(0.73±0.08)，差异有统计学意义( t＝10.200， P<0.05)。 结论:miR-149在卵巢癌组织和细胞呈低表达，miR-149过表达显著抑制卵巢癌细胞的增殖、周期和迁移，诱导细胞凋亡。

目的:探讨ⅩⅦ型胶原蛋白α1（COL17α1）在小鼠衰老皮肤中的表达与作用及其对人表皮干细胞（ESC）干性和增殖能力的影响，并且探讨相关微小RNA（miR）干预人ESC中COL17α1表达的机制。方法:采用实验研究方法。取2个月龄（青年）和24个月龄（老年）雄性C57BL/6J小鼠各12只，取其胸背部全层皮肤标本进行后续检测。对青年小鼠和老年小鼠全层皮肤标本，行苏木精-伊红染色后观察表皮层结构并测量表皮厚度，用透射电子显微镜观察表皮基底膜形态和半桥粒并行半桥粒计数，分别采用实时荧光定量反转录PCR（RT-PCR）法与蛋白质印迹法检测COL17α1的mRNA与蛋白表达，采用免疫荧光法观测COL17α1的蛋白表达与分布。取于解放军总医院第四医学中心行包皮切除手术的3名20~30岁健康男性术后弃用的新鲜包皮组织，提取ESC，取生长良好的细胞进行后续实验。按随机数字表法（分组方法下同）将ESC分为进行相应处理的空白对照组、转染试剂对照组、空载体质粒组、敲低COL17α1质粒组，培养48 h后，采用实时荧光定量RT-PCR法检测COL17α1的mRNA表达，采用蛋白质印迹法检测COL17α1和细胞角蛋白14（CK14）的蛋白表达，采用细胞计数试剂盒8法检测细胞增殖水平。通过DIANA、miRTarBase、miRNAMap、TargetScan、microRNA数据库筛选可能作用于 COL17α1 mRNA 3'非编码区的miR。将ESC分为转染miR模拟物阴性对照物的阴性对照组和转染前述筛选出的各miR的模拟物的各miR模拟物组，转染后48 h，通过蛋白质印迹法检测COL17α1的蛋白表达。基于基因表达综合数据库（GEO）的miR测序数据集GSE114006，使用GEO2R工具统计分析前述筛选出的可造成COL17α1蛋白表达下降的miR在30名青年（18~25岁）人和30名老年（>70岁）人皮肤中的表达。取青年小鼠和老年小鼠全层皮肤标本，采用实时荧光定量RT-PCR法检测前述老年人皮肤中表达增多的miR的表达。取2批ESC，第1批分为COL17α1野生型+miR-203b-3p阴性对照组与COL17α1野生型+miR-203b-3p模拟物组，第2批分为COL17α1突变型+miR-203b-3p阴性对照组与COL17α1突变型+miR-203b-3p模拟物组，分别转染对应序列，48 h后，采用荧光素酶报告基因检测试剂盒检测COL17α1的基因表达水平。组织实验中样本数均为6，细胞实验中样本数均为3。对数据行独立样本 t检验、单因素方差分析、LSD检验或Dunnett检验、Mann-Whitney U检验或Kruskal-Wallis H检验。 结果:与青年小鼠比较，老年小鼠皮肤表皮层与真皮层分界模糊且细胞层次较少，表皮层厚度明显变薄（ Z=-2.88， P<0.01），基底膜形态不连续，表皮-真皮连接处半桥粒较少且分布不均，半桥粒数量明显减少（ Z=-2.91， P<0.01），COL17α1的mRNA和蛋白表达水平均明显降低（ t值分别为10.61、6.85， P<0.01）。与青年小鼠比较，老年小鼠皮肤表皮基底层和毛囊球部的COL17α1蛋白表达均明显减少（ Z=-2.24， P<0.05）。培养48 h后，空白对照组、转染试剂对照组、空载体质粒组、敲低COL17α1质粒组ESC中COL17α1的蛋白表达水平分别为1.00±0.27、1.12±0.21、1.13±0.23、0.42±0.18。相较于空白对照组，转染试剂对照组和空载体质粒组ESC中COL17α1的mRNA和蛋白表达水平、CK14的蛋白表达水平及ESC增殖水平均未发生明显变化（ P>0.05），敲低COL17α1质粒组ESC中这些指标均明显降低（ P<0.05或 P<0.01）。miR-203a-3p、miR-203b-3p、miR-512-5p、miR-124-3p、miR-28-5p、miR-590-3p、miR-329-5p可能结合 COL17α1 mRNA的3'非编码区。转染48 h后，与阴性对照组的1.000±0.224比较，miR-329-5p模拟物组、miR-203b-3p模拟物组和miR-203a-3p模拟物组ESC中COL17α1的蛋白表达水平明显降低（0.516±0.188、0.170±0.025、0.235±0.025， t值分别为3.17、5.43、5.07， P<0.05或 P<0.01）。老年人皮肤中仅miR-203b-3p表达水平明显高于青年人（ t=3.27， P<0.01）。老年小鼠皮肤中miR-203b-3p表达水平明显高于青年小鼠（ Z=-2.88， P<0.01）。转染后48 h，COL17α1野生型+miR-203b-3p模拟物组ESC中COL17α1的基因表达水平明显低于COL17α1野生型+miR-203b-3p阴性对照组（ t=7.66， P<0.01），COL17α1突变型+miR-203b-3p模拟物组ESC中COL17α1的基因表达水平与COL17α1突变型+miR-203b-3p阴性对照组相近（ P>0.05）。 结论:COL17α1的mRNA和蛋白表达水平随小鼠年龄增长而减少，可能导致小鼠ESC脱离表皮基底膜。COL17α1的表达减少可抑制CK14的表达与ESC增殖，这可能是老年人皮肤中表皮层变薄和创面愈合减慢的原因。小鼠衰老皮肤中表达增多的miR-203b-3p可以靶向结合 COL17α1 mRNA的3'非编码区，阻碍转录后翻译过程，造成COL17α1蛋白表达减少。

目的:评价长链非编码RNA-肺癌转移相关转录本1/微小RNA-145/Bcl-2和腺病毒E1B19k Da相互作用蛋白3(Lnc-MALAT1/miRNA-145/BNIP3)信号通路在舒芬太尼预处理对大鼠心肌保护效应中的作用。方法:大鼠H9C2细胞以1×10 6个/ml密度接种于6孔培养板或培养瓶，采用随机数字表法分为5组( n＝30)：对照组(C组)、缺氧复氧组(H/R组)、舒芬太尼预处理组(S组)、真核细胞表达载体pcDNA3.0组(pcDNA组)和pcDNA-MALAT1组(MALAT1组)。S组用10 μmol/L舒芬太尼孵育2 h，随后制备缺氧复氧损伤模型；pcDNA组和MALAT1组分别用pcDNA3.0及pcDNA-MALAT1转染，转染后24 h用10 μmol/L舒芬太尼孵育2 h，随后制备缺氧复氧损伤模型。于复氧后2 h时，采用Real-time PCR法检测Lnc-MALAT1、miRNA-145及BNIP3 mRNA的表达水平；采用CCK-8法检测细胞存活率；采用流式细胞仪检测细胞凋亡率；分别采用硫代巴比妥酸显色法、羟胺法和微板法检测细胞MDA、SOD水平及LDH漏出量；采用Western blot法检测Bcl-2、Bax及cleaved-caspase-3表达水平。 结果:与C组比较，其余4组细胞存活率降低，凋亡率升高，MDA水平及LDH漏出量升高，SOD水平降低，LncRNA-MALAT1、BNIP3 mRNA、Bax和cleaved-caspase-3表达上调，miRNA-145和Bcl-2表达下调( P<0.05)；与H/R组比较，S组和pcDNA组细胞存活率升高，凋亡率降低，MDA水平及LDH漏出量降低，SOD水平升高，LncRNA-MALAT1、BNIP3 mRNA、Bax和cleaved-caspase-3表达下调，miRNA-145和Bcl-2表达上调( P<0.05)；与S组比较，MALAT1组细胞存活率降低，凋亡率升高，MDA水平及LDH漏出量升高，SOD水平降低，LncRNA-MALAT1、BNIP3 mRNA、Bax和cleaved-caspase-3表达上调，miRNA-145和Bcl-2表达下调( P<0.05)。 结论:舒芬太尼预处理对大鼠心肌保护效应的机制与抑制Lnc-MALAT1/miRNA-145/BNIP3信号通路有关。

目的:建立人真皮成纤维细胞（HDF）高糖老化模型，探讨人蜕膜间充质干细胞（dMSC）来源外泌体对高糖老化HDF增殖、迁移、凋亡的影响及其可能机制。方法:采用实验研究方法。收集2021年1—3月解放军总医院第四医学中心收治的4例男性包茎患者（18~22岁）环切术后废弃包皮组织，分离培养获取原代HDF。取第6代HDF，按照随机数字表法分为低糖组和高糖组，分别采用低糖完全培养基和高糖完全培养基进行每72小时换液、不传代培养，10 d后取细胞，于接种后24 h，采用β-半乳糖苷酶试剂盒检测细胞衰老情况；于接种后48 h，采用蛋白质印迹法检测细胞衰老相关蛋白p16、p53表达情况；于接种后24、48、72 h，采用细胞计数试剂盒8（CCK-8）法检测细胞增殖情况；于接种后48 h，采用脱氧尿嘧啶核苷（EdU）染色法检测细胞增殖情况，采用流式细胞术检测细胞周期及凋亡情况；于接种后24 h，采用Transwell实验测定细胞迁移能力。取人dMSC培养48~72 h，采用差速高速离心法获取其外泌体，采用透射电子显微镜观察dMSC外泌体形态，采用纳米颗粒追踪分析法检测dMSC外泌体的粒径分布，采用蛋白质印迹法检测dMSC外泌体标志蛋白CD9、肿瘤易感基因101（TSG101）的表达。取dMSC外泌体及前述高糖完全培养基诱导老化的HDF共孵育24 h，采用PKH67试剂盒检测细胞摄取外泌体的情况。取前述高糖完全培养基诱导老化的HDF，同前分为单纯高糖组、高糖+低浓度外泌体组、高糖+高浓度外泌体组，分别于高糖完全培养基中加入等体积的磷酸盐缓冲液、终质量浓度为50 μg/mL dMSC外泌体、终质量浓度为100 μg/mL dMSC外泌体进行常规细胞培养。分组后同前于对应时间点采用CCK-8法和EdU染色法、流式细胞术、Transwell实验分别检测细胞增殖、细胞周期和凋亡及细胞迁移情况。根据前述结果，另取经高糖完全培养基诱导老化的HDF，分为单纯高糖组、高糖+高浓度外泌体组并同前处理。分组培养48 h，采用实时荧光定量反转录PCR法检测单纯高糖组和高糖+高浓度外泌体组细胞衰老相关的微小RNA-145-5p（miR-145-5p）、miR-498、miR-503-5p及其靶基因钙/钙调素依赖性蛋白激酶1D（CAMK1D）、人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因（ PTEN基因）和细胞周期蛋白D1的mRNA表达情况。对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD- t检验和独立样本 t检验。 结果:接种后24 h，高糖组HDF β-半乳糖苷酶阳性染色率为（38.4±4.2）%，明显高于低糖组的（16.5±2.2）%（ t=4.65， P<0.01）。接种后48 h，高糖组HDF的衰老相关蛋白p16和p53的表达量均明显高于低糖组（ t值分别为11.85、3.02， P<0.05或 P<0.01）。接种后24、48、72 h，高糖组HDF的增殖活性均明显低于低糖组（ t值分别为4.13、9.90、15.12， P<0.01）。接种后48 h，高糖组HDF的EdU阳性染色率明显低于低糖组（ t=3.83， P<0.05）。接种后48 h，高糖组HDF周期的G2/M+S亚群在3个亚群（G0/G1、S和G2/M）的占比明显低于低糖组（ t=8.74， P<0.01）。接种后24 h，高糖组HDF穿过Transwell滤膜到达下室的细胞数量为（37±6）个，明显少于低糖组的（74±7）个（ t=8.42， P<0.01）。接种后48 h，高糖组HDF凋亡率明显高于低糖组（ t=8.48， P<0.01）。dMSC外泌体为边缘清晰、大小分布均匀的杯状或者圆形囊泡，粒径基本处于80~200 nm。dMSC外泌体标志性蛋白CD9、TSG101表达均呈阳性。共孵育24 h，外泌体被HDF摄入胞内，主要分布于细胞核周围。分组培养24、48、72 h，高糖+低浓度外泌体组和高糖+高浓度外泌体组HDF增殖活性均明显高于单纯高糖组（ t值分别为6.36、6.10、7.76，8.92、12.17、10.74， P<0.01），高糖+高浓度外泌体组HDF增殖活性均明显高于高糖+低浓度外泌体组（ t值分别为7.92、4.82、4.72， P<0.01）。分组培养48 h，与单纯高糖组比较，高糖+低浓度外泌体组和高糖+高浓度外泌体组HDF EdU阳性染色率均明显升高（ t值分别为5.32、9.88， P<0.01）；与高糖+低浓度外泌体组比较，高糖+高浓度外泌体组HDF EdU阳性染色率显著升高（ t=5.27， P<0.01）。分组培养48 h，与单纯高糖组比较，高糖+低浓度外泌体组和高糖+高浓度外泌体组HDF中的G0/G1期亚群占比均显著降低（ t值分别为3.81、4.31， P<0.05），G2/M+S亚群占比均明显升高（ t值分别为3.81、4.31， P<0.05）。分组培养24 h，与单纯高糖组相比，高糖+低浓度外泌体组和高糖+高浓度外泌体组HDF穿过滤膜的数量均明显增多（ t值分别为10.14、13.39 ，P<0.01）；与高糖+低浓度外泌体组相比，高糖+高浓度外泌体组HDF穿过滤膜的数量明显增多（ t=6.27 ，P<0.01）。分组培养48 h，与单纯高糖组比较，高糖+低浓度外泌体组和高糖+高浓度外泌体组HDF凋亡率均明显降低（ t值分别为3.72、5.53， P<0.05或 P<0.01）。分组培养48 h，与单纯高糖组相比，高糖+高浓度外泌体组HDF的miR-145-5p、miR-498 mRNA表达量均明显上升（ t值分别为13.03、8.90， P<0.01），miR-503-5p mRNA表达量明显下降（ t=3.85， P<0.05）；高糖+高浓度外泌体组中HDF的CAMK1D、 PTEN基因mRNA表达量均明显低于单纯高糖组（ t值分别为8.83、5.97， P<0.01），细胞周期蛋白D1 mRNA表达量明显高于单纯高糖组（ t=4.03， P<0.05）。 结论:人dMSC来源外泌体可显著提高高糖老化HDF的增殖和迁移能力，抑制其凋亡。这可能与HDF内miR-145-5p和miR-498表达增高抑制了CAMK1D和 PTEN基因的表达及miR-503-5p表达下降促进了细胞周期蛋白D1的表达有关。

目的:探讨黄芪甲苷对人内皮祖细胞(EPC)分泌外泌体及外泌体中微小RNA-126(miRNA-126)表达的影响。方法:取湖南中医药大学第一附属医院妇产科2019年出生的1名足月健康新生儿脐带血，采用密度梯度离心法分离单个核细胞并培养7 d，其间行形态学观察；取第3代细胞，采用CD31免疫磁珠分选法和双荧光染色法鉴定。将鉴定成功的EPC按照随机数字表法分为黄芪甲苷组和磷酸盐缓冲液(PBS)组。黄芪甲苷组细胞加入终质量浓度100 mg/L的黄芪甲苷培养24 h，PBS组细胞加入等体积的PBS培养24 h。培养结束后收集2组细胞培养上清液中的外泌体，采用蛋白质印迹法检测外泌体特征性标志物CD9、CD63和CD81表达，于透射电子显微镜下观察EPC外泌体(EPC-Exo)形态，采用纳米颗粒跟踪分析技术检测EPC-Exo的粒径，采用二辛丁酸法测定EPC-Exo的浓度(样本数为3)，采用反转录PCR法测定EPC-Exo中与血管新生相关miRNA-126-3p和miRNA-126-5p的表达(样本数为3)。对数据行独立样本 t检验。 结果:(1)培养第4天，细胞开始贴壁生长，圆形、梭形、条形等多形态同时出现；继续培养至第7天时，细胞边缘清晰，呈铺路石样排列，中央细胞呈圆形，周边细胞呈梭形。(2)CD31免疫磁珠分选法显示细胞膜染绿色，细胞核染蓝色；双荧光染色法显示细胞呈橙黄色。经以上鉴定，细胞被证实为EPC。(3)培养24 h，2组EPC-Exo的CD9、CD63和CD81表达均呈阳性，证实本实验已成功提取EPC-Exo。(4)培养24 h，2组EPC-Exo均呈圆形膜囊泡，形态无明显差异。(5)培养24 h，黄芪甲苷组中98.7%的EPC-Exo粒径为84.7～143.1 nm，PBS组中98.0%的EPC-Exo粒径为88.7～123.5 nm。(6)培养24 h，黄芪甲苷组EPC-Exo的质量浓度为(310±5)μg/mL，明显高于PBS组的(257±5)μg/mL， t＝13.369， P<0.01。(7)培养24 h，黄芪甲苷组EPC-Exo中miRNA-126-3p( t＝16.062， P<0.01)和miRNA-126-5p( t＝3.252， P<0.05)均明显多于PBS组。 结论:黄芪甲苷可改善人EPC分泌外泌体的功能，且所分泌的外泌体负载miRNA-126。