目的:探讨DNA损伤激活的非编码RNA（NORAD）在高糖诱导小鼠肾小球系膜细胞增殖及凋亡中的作用及机制。方法:根据培养基中葡萄糖浓度将小鼠肾小球系膜细胞SV40-MES-13分为高糖组及低糖组，处理24 h后转染NORAD小干扰RNA（si-NORAD）及Toll样受体4（TLR4）小干扰RNA（si-TLR4），实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测NORAD及TLR4的表达。在SV40-MES-13细胞中分别转染NORAD、TLR4过表达质粒及小干扰RNA。Cell Counting Kit-8（CCK-8）、5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷（EdU）染色及流式细胞术检测细胞增殖和凋亡结果；共转染NORAD和miR-520h模拟剂，TLR4和miR-520h模拟剂后检测荧光素酶强度及三者表达情况；共转染si-NORAD和miR-520h抑制剂、TLR4过表达质粒和miR-520h模拟物以及共转染si-TLR4和miR-520h抑制剂后检测三者水平及细胞增殖水平来验证三者的调节关系。结果:高糖处理小鼠系膜细胞SV40-MES-13后，NORAD（1.65±0.08比1.00±0.06， P=0.003）及TLR4（1.96±0.09比1.01±0.07， P=0.001）的表达均升高。NORAD及TLR4过表达后细胞增殖加快（1.34±0.04比0.85±0.04， P=0.001；1.33±0.02比0.82±0.03， P<0.001），细胞凋亡减少（0.45±0.03比0.94±0.06， P=0.001；0.51±0.05比0.99±0.03， P=0.001）。双荧光素酶报告基因结果显示，miR-520h能与NORAD及TLR4结合；NORAD与miR-520h表达相互影响，miR-520h模拟物可减少TLR4表达。与单独转染si-NORAD相比，共转染si-NORAD及miR-520h抑制剂时TLR4相对表达量升高（0.74±0.03比0.55±0.03， P=0.014）；与单独转染miR-520h模拟物相比，共转染miR-520h模拟剂及TLR4过表达质粒后细胞增殖更快（0.73±0.01比0.61±0.02， P=0.007）；与单独转染miR-520h抑制剂相比，共转染miR-520h抑制剂及si-TLR4后细胞增殖减少（1.31±0.04比1.55±0.04， P=0.013）。 结论:NORAD可结合miR-520h调节TLR4促进高糖诱导系膜细胞增殖及抑制凋亡。

目的:探讨长链非编码RNA同源异形盒转录反义RNA(lncRNA HOTAIR)通过靶向微小RNA-520g-3p(miR-520g-3p)对胰腺癌细胞增殖、迁移能力的影响。方法:实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测胰腺癌细胞中miR-520g-3p、HOTAIR表达水平；转染HOTAIR小干扰RNA至SW1990胰腺癌细胞中，并分为NC组、siHOTAIR-1组、siHOTAIR-2组。细胞计数试剂盒(CCK-8)实验检测细胞增殖能力，划痕愈合实验检测细胞迁移能力；双荧光素酶报告基因实验验证miR-520g-3p与HOTAIR靶向调控关系，两组之间的定量资料比较采用 t检验。 结果:qRT-PCR结果表明SW1990中HOTAIR mRNA水平明显高于人正常胰腺导管上皮细胞(HPDE，3.08±0.33比1.57±0.17， t＝29.830, P<0.01)；miR-520g-3p在SW1990中的表达水平明显低于人正常胰腺导管上皮细胞(HPDE，0.93±0.11比2.63±0.24， t＝22.410, P<0.01)；HOTAIR小干扰RNA转染至SW1990中，72 h后NC组细胞吸光度( A)值明显高于siHOTAIR-1组、siHOTAIR-2组(3.52±0.99比1.92±0.23、2.36±0.58， t＝6.340、5.150， P<0.01)；降低HOTAIR表达48 h后，NC组细胞划痕愈合面积百分比为显著高于siHOTAIR-1组、siHOTAIR-2组[(85.37±9.82)%比(50.56±5.82)%、(35.28±6.86)%， t＝7.760, 14.750， P<0.01]，差异均有统计学意义。双荧光素酶报告基因表明miR-520g-3p可明显降低野生型HOTAIR载体荧光素酶活性。下调miR-520g-3p表达水平后，SW1990细胞增殖及迁移能力高于对照组( t＝13.190、12.480， P<0.01)，差异有统计学意义。 结论:HOTAIR可通过靶向负调控miR-520g-3p影响胰腺癌细胞增殖、迁移能力。

目的 构建一种自催化发夹组装无酶信号放大的靶标快速荧光法,用于检测靶标miRNA.方法 首先在金纳米颗粒(AuNP)表面修饰5-羧基荧光素(FAM)标记的DNA发夹探针H1,形成探针AuNP-H1,H1的荧光被AuNP猝灭.加入靶标miRNA会导致AuNP上的H1标记荧光素远离AuNP而重新发射荧光,随后H1与DNA发夹探针H2发生循环自组装,靶标循环被利用,导致荧光信号放大.将探针AuNP-H1、探针H2及不同浓度的miRNA-721共反应后,在480 nm激发波长下测定体系的荧光强度.结果 以急性心肌炎生物标志物miRNA-721为模型靶标,在优化的实验条件下使用20 μL探针AuNP-H1、50 μL 3 μmol/L探针H2(退火缓冲液为20 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L NaCl、5 mmol/L MgCl2,pH 7.4)与 50 μL不同浓度(0.1～5 μmol/L)的 miRNA-721 在 30 ℃共反应20 min,发现在520 nm处的相对荧光强度变化值(△F=F-F0)与miRNA-721浓度(C)呈良好的线性关系,拟合线性方程为△F=29 232×lgC-52 435(R2=0.991 0).该荧光法检测限为1.23 nmol/L.在正常人血清中的加标回收率为92.71％～104.02％.一次完整的miRNA分析可以在20 min内完成.结论 该方法可用于生物样品中miRNA-721的检测,为急性心肌炎的早期诊断提供了一种快速检测手段.

目的 探讨miR-146a在肺鳞癌发生、发展中的作用.方法 采用qRT-PCR法检测70例份肺鳞癌组织及其配对的癌旁正常组织、20例份正常肺组织miR-146a表达,并分析miR-146a表达与肺鳞癌患者临床病理参数的关系.筛选人肺鳞癌细胞SK-MES-1、NCI-H520、NCI-H2170、NCI-H226及正常肺组织上皮细胞(BEAS-2B)中miR-146a表达最低的NCI-H520细胞进行后续实验.采用脂质体介导法转染miR-146a mimics或阴性对照mimics-NC,Transwell小室法检测转染miR-146a mimics和阴性对照mimics-NC的NCI-H520细胞迁移和侵袭能力.结果 肺鳞癌组织miR-146a表达明显低于癌旁正常组织和正常肺组织(P均＜0.01).肺鳞癌组织miR-146a表达与肿瘤组织分化程度、临床分期、淋巴结转移有关(P均＜ 0.01).转染miR-146a mimics的NCI-H520细胞迁移和侵袭细胞数目较转染mimics-NC的NCI-H520细胞明显降低(P＜0.05或＜0.01).结论 肺鳞癌组织miR-146a表达降低,其表达变化与肿瘤的恶性生物学行为有关;miR-146a能够明显抑制肺鳞癌细胞的迁移和侵袭.

目的 筛选乳腺癌放射治疗(放疗)抵抗相关微小RNA(miRNAs),为乳腺癌患者放疗抵抗的基础研究与临床应用研究提供实验基础.方法 从基因表达综合数据库(GEO)中下载乳腺癌放疗患者相关miRNAs微阵列数据集GSE 107743,利用GEO2R分析工具筛选放疗后局部复发患者的差异表达miRNAs,mirDIP数据库预测差异表达miRNAs的靶基因,DAVID数据库对靶基因分别进行基因本体论(GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析.最后采用实时荧光定量PCR在人乳腺癌细胞MCF-7中进行差异表达验证.结果 采用GEO2R分析工具筛选出9种与放疗抵抗相关的差异表达miRNAs,其中3种miRNAs(hsa-miR-600、hsa-miR-525-3p、hsa-miR-591)表达上调,6种miRNAs(hsa-miR-488-5p、hsa-miR-582-3p、hsa-miR-520h、hsa-miR-488-3p、hsa-miR-744-3p、hsa-miR-103b)表达下调.靶基因预测结果显示,9种差异表达miRNAs的潜在靶基因共134个.靶基因显著富集在细胞周期、细胞凋亡、干细胞分化等相关生物学过程(均P＜0.05)以及转化生长因子-β、磷脂酰肌醇3-激酶\蛋白激酶B信号通路等信号通路中(均P＜0.05).实时荧光定量PCR检测结果表明,6种miRNAs (hsa-miR-600、hsa-miR-525-3p、hsa-miR-591、hsa-miR488-5p、hsa-miR-582-3p、hsa-miR-520h)在经5 Gy 137Csγ射线辐照后的MCF-7细胞中表达差异改变与GEO2R分析结果完全一致.结论 利用生物信息学从乳腺癌放疗患者局部复发临床样本中筛选出的差异表达miRNAs可能与乳腺癌患者的放疗抵抗密切相关,有望成为放疗抵抗治疗的新靶点.

目的 建立2型糖尿病合并脑缺血树鼩模型,探讨在代谢异常及脑缺血条件下,缺血后适应(postconditioning,PC)对树鼩脑皮层基因表达的调控机制.方法 将70只健康成年树鼩分为对照组、2型糖尿病(T2DM)组、脑缺血(IS)组、T2DM+IS及T2DM+IS+PC组(每组14只).采用高脂饲料饲养联合链脲佐菌素注射建立实验性糖尿病模型,通过光化学反应诱导树鼩局部血栓形成,缺血PC组于缺血后4h夹闭患侧颈总动脉3次(5 min/次)实施PC处理.在脑缺血后24 h,通过血清生化指标的检测了解机体代谢状态,采用TTC、HE染色及电镜超微结构观察对缺血性脑损伤进行评价,用RNA-Seq分析差异表达基因.结果 T2DM+IS组树鼩脑细胞的超微结构明显异常,脑梗死面积达(19.56±1.25)％(P＜0.01).与对照组比较,T2DM+IS组树鼩体重明显下降(P＜0.01),血糖、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、三酰甘油和C反应蛋白明显升高(均P＜0.01).RNA-Seq分析结果显示,T2DM+IS组与对照组相比差异表达基因有1 629个(上调基因1 109个,下调基因520个).经缺血PC处理后,皮层梗死面积明显缩小(P＜0.01),血糖、血脂和CRP水平降低(P＜0.05),差异表达基因520个(上调基因203个,下调基因317个).结论 缺血PC可改善2型糖尿病树鼩代谢异常所加剧的缺血性脑损伤,其机制可能与调控大脑皮质基因表达有关.

目的 探讨微小RNA-520e(miR-520e)对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞侵袭迁移和Janus激酶1( JAK1)／信号转导和转录激活因子3(STAT3)信号通路的影响.方法 采用实时定量PCR(QPCR)检测人肺上皮细胞BEAS-2B和NSCLC细胞株H1299、H1975、H1650、A549的miR-520e水平;体外常规培养A549细胞并采用脂质体分别转染模拟物(过表达组)和阴性对照序列(NC组),以仅经脂质体处理的细胞为对照组.采用QPCR、活细胞计数CCK-8、划痕实验和Transwell实验检测miR-520e和含锌指和BTB结构域7A(ZBTB7A)水平、增殖活力、划痕愈合率和穿膜细胞数,Western blotting检测基质金属蛋白酶(MMP)-9、磷酸化JAK1(p-JAK1)和磷酸化STAT3(p-STAT3)水平;双荧光素酶报告基因系统联合荧光素酶报告质粒psi-CHECK-2验证miR-520e与ZBTB7A的靶向关系.结果 与正常细胞相比,NSCLC细胞的miR-520e水平降低,其中A549细胞最低,差异有统计学意义( P＜0. 05).过表达组的miR-520e水平为19. 562± 1. 448,高于对照组的1. 002± 0. 057和NC组的1. 053±0. 082,ZBTB7A水平为0. 173±0. 026,低于对照组的1. 109±0. 091和NC组的1. 076±0. 136,差异均有统计学意义(P＜0. 05).与对照组和NC组相比,过表达组转染36、48 h后的增殖活力及转染48 h后的MMP-9、p-JAK1和p-STAT3水平均降低(P＜0. 05).过表达组的划痕愈合率和穿膜细胞数分别为(23. 618±3. 684)%和(51. 644±7. 069)个,低于对照组的(57. 089± 4. 569)%和(152. 269±12. 833)个及NC组的(59. 267±5. 671)%和(149. 075±11. 239)个( P＜0. 05). MiR-520e模拟物与携带野生型ZBTB7A 3’端非翻译区的psiCHECK-2载体共转染细胞的相对荧光强度降低(P＜0. 05).结论 miR-520e在NSCLC细胞中表达下调且可能通过靶向ZBTB7A降低JAK1／STAT3信号通路活性来抑制NSCLC细胞的增殖、侵袭和迁移.

目的 探讨氧化苦参碱(OMT)通过微小RNA(miR)-520e调控星形胶质细胞瘤上调基因1(AEG-1)介导的结肠癌细胞的增殖、侵袭和迁移的影响.方法 不同浓度OMT处理结肠癌细胞,MTT法检测细胞增殖抑制率;对数生长期的结肠癌细胞随机分为Control组、OMT组(含70μmol/L OMT的培养基培养24 h)、NC组(转染阴性对照片段24 h)、miR-520e inhibitor组(转染miR-520e抑制物24 h)和OMT+miR-520e inhibitor组(转染miR-520e抑制物24 h后,70μmol/L OMT处理24 h),MTT法检测细胞存活率,PCR检测miR-520e表达水平,划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell实验检测细胞侵袭能力,双荧光素酶报告实验检测miR-520e与AEG-1靶向关系,蛋白印迹法检测AEG-1、白介素6(IL-6)和磷酸化信号转导子与激活子3(STAT3)蛋白相对表达量.结果 随着OMT浓度的增加,结肠癌细胞增殖抑制率升高(P<0.05);与Control组比较,OMT组细胞存活率、侵袭细胞数以及AEG-1、IL-6和p-STAT3蛋白相对表达量降低,miR-520e表达水平以及划痕愈合率升高(P<0.05);与OMT组比较,OMT+miR-520e inhibitor组细胞存活率、侵袭细胞数以及AEG-1、IL-6和p-STAT3蛋白相对表达量升高,miR-520e表达水平以及划痕愈合率降低(P<0.05);与NC组比较,miR-520e inhibitor组侵袭细胞数以及AEG-1、IL-6和p-STAT3蛋白相对表达量升高,miR-520e表达水平以及划痕愈合率降低(P<0.05);与miR-520e inhibitor组比较,OMT+miR-520e inhibitor组细胞存活率、侵袭细胞数以及AEG-1、IL-6和p-STAT3蛋白相对表达量降低,miR-520e表达水平以及划痕愈合率升高(P<0.05).结论 OMT通过上调miR-520e抑制AEG-1表达,降低结肠癌细胞增殖、侵袭和迁移能力.

目的 探讨上调微小RNA-520a(miR-520a)对胃癌细胞恶性生物学行为和放射增敏性的影响及相关机制.方法 将胃癌MGC-803细胞分为空白组、上调组、下调组,空白组加入常规细胞培养液,下调组给予转染p-Genesil,上调组给予转染p-Genesil-miR-520a.鉴定各组细胞转染情况,并检测细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭能力以及Janus激酶3(JAK3)/信号转导及转录激活因子3(STAT3)信号通路蛋白表达量.各组细胞在转染结束后,接受一定剂量的X线照射,观察细胞集落形成情况,并计算平均致死量(D0)、2 Gy剂量X线照射下的细胞存活分数(SF2)和放射增敏比(SER).结果 转染48 h后,上调组miR-520a表达量高于空白组,下调组miR-520a表达量低于空白组及上调组(均P<0.05).稳定转染后24 h、48 h、72 h,上调组细胞增殖率低于空白组及下调组,下调组细胞增殖率高于空白组;72 h后,上调组及下调组细胞凋亡率均高于空白组,且上调组高于下调组(均P<0.05).上调组细胞迁移、侵袭数少于空白组及下调组,但下调组细胞迁移、侵袭数多于空白组(均P<0.05).上调组SF2值、D0值和SER大于空白组及下调组,下调组SF2值、D0值和SER小于空白组(均P<0.05).上调组JAK3、STAT3、磷酸化JAK3、磷酸化STAT3蛋白表达量均低于空白组及下调组,下调组JAK3、STAT3、磷酸化JAK3、磷酸化STAT3蛋白表达量均高于空白组(均P<0.05).结论 上调miR-520a表达水平可以抑制胃癌细胞增殖、迁移、侵袭,促进细胞凋亡,并可增强细胞的放射增敏性,其可能通过影响JAK3/STAT3信号通路的表达发挥作用.

目的 探讨微小RNA-520a-5p(miR-520a-5p)在胶质瘤发生发展中的作用和机制.方法 选取2016年5月至2018年11月在宝鸡高新人民医院治疗的胶质瘤病人肿瘤组织作56例为研究对象.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测56例胶质瘤组织和56例正常脑组织中miR-520a-5p表达水平.体外培养胶质瘤U251细胞,转染miR模拟对照序列(miR-NC)、miR-520a-5p9模拟物(miR-520a-5p mimics)至U251细胞,分别采用四甲基噻唑蓝染色法(MTT)、流式细胞仪、Transwell和蛋白质印迹法检测过表达miR-520a-5p对U251细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭及细胞中鼠双微体基因(MDM2)、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、P21、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)和E-钙黏蛋白(E-cadherin)蛋白表达的影响.双萤光素酶报告基因实验验证miR-520a-5p与MDM2靶向关系,蛋白质印迹法检测转染miR-520a-5p mimics、miR-520a-5p抑制剂(anti-miR-520a-5p)对U251细胞中MDM2蛋白表达的影响.共转染miR-520a-5p mimics和MDM2过表达载体(pcD?NA3.1-MDM2)至U251细胞,上述相同方法观察过表达MDM2能否逆转过表达miR-520a-5p对U251细胞增殖、迁移和侵袭及相关蛋白表达的影响.结果 与正常脑组织相比,胶质瘤组织中miR-520a-5p表达降低(P<0.05).与转染miR-NC的U251细胞比较,转染miR-520a-5p mimics的U251细胞24 h、48 h和72 h的OD值[(0.36±0.04)比(0.50±0.05)、(0.49±0.05)比(0.95±0.09)、(0.71±0.07)比(1.36±0.13)]、迁移细胞数[(67±6.26)比(144±13.38)]、侵袭细胞数[(59±5.47)比(135±13.12)]均降低(P<0.05),凋亡率[(21.17±2.06)％比(7.82±0.77)％]升高(P<0.05),细胞中cyclin D1、Bcl-2和MMP-2的蛋白表达水平均降低(P<0.05),而P21、Bax和E-cadherin的蛋白表达水平均升高(P<0.05).miR-520a-5p可与MDM2的3'UTR靶向结合,同时转染miR-520a-5p mimics的U251细胞中MDM2蛋白水平显著低于转染miR-NC的细胞,而转染anti-miR-520a-5p的U251细胞中MDM2的蛋白水平显著高于转染anti-miR-NC的细胞.与共转染miR-520a-5p mimics与pcDNA3.1的U251细胞比较,共转染miR-520a-5p mim?ics与pcDNA3.1-MDM2的U251细胞24 h、48 h和72 h的OD值、迁移细胞数、侵袭细胞数均升高(P<0.05),凋亡率降低(P<0.05),细胞中cyclin D1、Bcl-2和MMP-2的蛋白表达水平均升高(P<0.05),而P21、Bax和E-cadherin的蛋白表达水平均降低(P<0.05).结论 miR-520a-5p在胶质瘤组织中表达降低,过表达miR-520a-5p可能通过靶向负调控MDM2抑制胶质瘤U251细胞增殖、迁移和侵袭,并诱导其凋亡.